猪Utx基因慢病毒过表达与干扰载体构建及包装研究

"猪Utx慢病毒过表达/干扰载体的构建和病毒包装" 这篇论文主要关注的是猪Utx基因的功能研究及其在慢病毒载体系统中的应用。Utx（UTX，编码蛋白质UTX）是一种组蛋白去甲基酶，特别针对H3K27me2/3标记，这些是染色质修饰的重要组成部分，参与基因表达的调控。在动物发育过程中，Utx起着关键的作用。 研究人员首先从NCBI（美国国立生物技术信息中心）获取了猪Utx基因的预测序列，然后通过PCR（聚合酶链式反应）技术扩增了该基因的CDS（编码序列）区域，这通常是基因功能实现的核心部分。利用这个CDS区的信息，他们构建了一个名为pCD513B-CMV-Utx的过表达载体，这里的CMV（ cytomegalovirus）启动子使Utx基因在目标细胞中得以高效表达。 同时，为了研究Utx基因的干扰效果，研究团队设计并合成了特定的shRNA（短发夹状RNA）序列，这是一种用于RNA干扰（RNAi）的技术，可以抑制目标基因的表达。shRNA与阴性对照寡核苷酸片段经过退火处理形成双链DNA，随后插入到pCD513B-U6慢病毒干扰载体中。通过双酶切验证和DNA测序来确保重组载体的正确构建。 接下来，过表达和干扰载体质粒被共转染至293T细胞中，通过qRT-PCR（实时逆转录聚合酶链反应）筛选出最有效的干扰序列。结果显示，pCD513B-U6-Utx-shRNA-3序列显示出最佳的干扰效率，达到约70%。 最后，将重组质粒与三种慢病毒辅助包装质粒（pRsv-Rev、pGag-Pol、pVSV-G）共转染293T细胞以包装慢病毒。成功包装出的慢病毒包括Lenti-Utx-shRNA（干扰病毒）、Lenti-NC（阴性对照病毒）和Lenti-Utx（过表达病毒），它们的滴度分别为6.1×10^7 TU/mL、4.8×10^7 TU/mL和3.9×10^5 TU/mL。这些包装的慢病毒可以用于后续在猪源细胞中研究Utx基因的作用。 这项研究通过构建和包装慢病毒载体，实现了猪Utx基因的过表达和干扰，为深入理解Utx在猪发育和生理过程中的作用提供了实验工具。这不仅有助于基础生物学研究，也为猪的遗传改良和疾病模型建立提供了可能。