RNA提取、逆转录与qRT-PCR详细步骤详解

提RNA+逆转录+qRT-PCR是一个关键的分子生物学实验流程，主要用于基因表达的研究，特别是定量检测特定基因在细胞或组织中的转录水平。以下是该过程的详细步骤和注意事项： 一、提纯RNA步骤 1. 实验准备： - 需要75%乙醇、Trizol（一种用于RNA提取的试剂）、一次性EP管（无菌）、氯仿、异丙醇、RNA专用枪头，以及低温储存设备。 - 配制75%乙醇溶液，确保其无菌并预冷至-20℃。 2. 操作步骤： - 将上清弃去，用PBS清洗样本两次，弃去清洗液。 - 加入Trizol处理样本，静置约2分钟。 - 使用枪头轻轻搅拌后，离心分离。 - 添加氯仿，进行离心分层，取上清部分。 - 异丙醇用于沉淀RNA，与上清混合后离心，收集RNA。 - 通过洗涤步骤去除杂质，最后用75%乙醇洗涤RNA。 - RNA在干燥过程中需小心处理，避免损失。 - 溶解RNA于DEPC水，测量浓度。 3. 注意事项： - RNA可以短期储存在-20℃，但长期存储应置于-80℃。 - 异丙醇比乙醇更有效沉淀RNA。 - 在操作过程中，注意无菌操作，防止污染。 二、RNA浓度测定 1. 实验准备： - 在指定实验室（如先知楼21楼）准备好必要的工具，包括冰盒、DEPC水、枪头、笔记本和笔。 - 打开专门的软件，如用于核酸分析的软件。 2. 测定步骤： - 登记样本信息。 - 执行软件中的RNA浓度测定程序，选择适当的选项（如"RNA"），校准仪器。 - 清洗枪头并用灭菌的ddH2O进行校零。 - 测量RNA样品的浓度，并记录数据。 整个流程从RNA的提取到浓度测定，涉及多个关键步骤，每个环节都需要严格按照操作规程进行，以确保最终得到高质量的RNA样本，为后续的逆转录和qRT-PCR提供准确的基础。逆转录将RNA转化为cDNA，而qRT-PCR则用于定量分析特定基因的表达水平，这是生物科学研究中常用的技术手段之一。