构建并鉴定Ery基因替换乳酸杆菌：对抗酸化研究的关键

本文主要探讨了构建并鉴定Ery基因替换β-半乳糖苷酶基因的重组乳酸杆菌的过程。研究由佳佳、陈阳、郑耀武和张禄卿等人进行，他们在东北师范大学生命科学学院开展工作，得到了高等学校博士学科点专项科研基金的支持。研究的核心目标是通过构建具有红霉素抗性(Ery)基因的乳酸杆菌，为理解β-半乳糖苷酶在牛奶发酵和酸奶后酸化过程中可能产生的影响提供生物学基础，这对于防止酸奶后酸化具有重要意义。 研究方法分为三步： 1. 首先，从乳酸杆菌的基因组DNA中利用PCR技术扩增出739bp的LacZ5'同源臂和771bp的LacZ3'同源臂片段，这是构建重组乳酸杆菌的关键组成部分。接着，从PMG36e质粒中提取出735bp的Ery片段，并将其与上述片段连接到pUC57Kan-T7-sgRNA质粒中，形成打靶载体pUC57-LacZ5'-Ery-LacZ3'。 2. 接下来，通过电转将打靶载体导入乳酸杆菌的感受态细胞中，通过同源重组的方式实现Ery基因替换β-半乳糖苷酶基因，从而得到重组乳酸杆菌。这一步骤确保了基因的精确替换，避免了不必要的基因突变。 3. 最后，通过PCR扩增LacZ5'-Ery-LacZ3'片段和β-半乳糖苷酶基因片段来确认基因替换的成功，并通过X-Gal染色实验鉴定重组乳酸杆菌。如果能扩增出2245bp的LacZ5'-Ery-LacZ3'片段而未检测到580bp的内源β-半乳糖苷酶基因片段，就证明了Ery基因已成功替换。此外，由于X-Gal染色实验显示重组乳酸杆菌不表达β-半乳糖苷酶，因此不会出现X-Gal显色，这进一步证实了重组乳酸杆菌的制备成功。 本文的研究成果对于理解β-半乳糖苷酶在乳酸菌代谢中的作用以及其在酸奶工业中的潜在影响具有重要价值，也为后续针对这一特定酶的调控和应用提供了关键技术手段。同时，这项工作展示了分子生物学在乳酸菌工程改造中的应用，以及在食品工业领域的创新性研究。