三代测序技术：预处理与数据分析流程

"三代测序预处理.pdf" 三代测序，又称单分子实时（Single Molecule, Real-Time，SMRT）测序，是生物信息学领域中的一个重要技术，由Pacific Biosciences公司（PacBio）开发。这项技术以其长读长和对DNA分子的直接观察而著称，为基因组学研究提供了全新的视角。PacBio的三代测序系统主要包括PacBio RSII和Sequel System两个平台，这两个系统都利用了Zero-Mode Waveguides（ZMWs）来捕捉和检测单个DNA分子的荧光信号。 ZMWs是PacBio测序技术的核心组件，它们是一种微小的光学装置，能够限制荧光信号的检测范围，使得只有在ZMW底部的DNA分子片段能被观测到。当DNA聚合酶在模板链上移动并添加荧光标记的核苷酸时，会释放出特定的荧光信号，这些信号被转化为数字数据，进而构建出序列信息。 测序过程中，数据会分为不同的质量等级。P0代表Empty ZMW，意味着没有检测到高质量的读取；P1表示检测到了高质量的读取；P2则表示检测到了信号，但没有得到高质量的读取。这些数据通常以三种不同的文件格式之一呈现：`.h5`、`.bam`或`.fastq`，其中`.h5`是PacBio特有的原始数据格式。 PacBio测序产生的原始数据需要经过预处理，包括去除低质量读段（如P0和P1）、基质校正、纠错等步骤，才能用于后续的分析。其中，Subreads是原始的短读段，而Circular Consensus Sequences (CCS) 是通过多次循环读取同一分子，提高准确性的产物。Chaisson MJ和Tesler G在2012年的文章中介绍了使用Basic Local Alignment with Successive Refinement (BLASR) 算法进行单分子测序读段映射的方法。 三代测序的一个显著优势是没有明显的GC偏倚，与Illumina的短读测序数据相比，如Shi等人在2016年发表的研究所示。这使得三代测序在处理GC含量变化大的区域时表现优越。 下机数据通常以`.h5`格式存储，需要通过特定的软件工具转换成`.bam`格式，以便于常规的生物信息学分析。PacBio提供了SMRT Analysis软件套件（如SMRTAnalysis 2.3 for PacBio RSII和SMRTLink v5.1.0 for PacBio Sequel），以及相关的转换工具和BAM处理的配方。同时，开源社区如GitHub上的项目FALCON-formatter也提供了帮助转换和解析三代测序数据的解决方案。 三代测序预处理的完整管道通常涉及多个步骤，包括数据质量检查、基线校正、信号到碱基的转换、错误率降低等，每个步骤都需要使用专门的软件和算法。完成这些预处理后，数据可以用于组装基因组、检测结构变异、表观遗传学研究等多种生物学应用。三代测序预处理是基因组学研究中不可或缺的一环，它对于充分利用PacBio测序技术的优势至关重要。