肝内胆管癌患者外周血免疫标志物预测化疗敏感性

工程7（2021）1381研究肿瘤诊断和治疗新技术-文章肝内胆管癌患者外周血特异性免疫标志物预测化疗药物敏感性Tong Wua，b，#，Ying-Cheng Yangc，#，Bo Zhenga，b，#，Xue-Bing Shic，Wei Lic，Wen-Cong Mac，ShanWangd，Zhi-Xuan Lia，b，Yan-Jing Zhua，b，Jian-Min Wue，Kai-Ting Wange，Yan Zhaoe，Rui Wuc，Cheng-Jun Suic，沈思云a，b，吴璇f，陈雷a，d，g，刘伟，袁振刚h，王宏扬a，d，王第二军医大学东方肝胆外科医院肝胆肿瘤生物学教育部重点实验室肝癌信号转导与靶向治疗国际合作实验室上海200438b国家肝癌中心，上海201805，中国c第二军医大学东方肝胆外科医院肝胆外科，上海200438d复旦大学附属肿瘤医院，中国复旦大学代谢与整合生物学研究所，上海200433f同济大学附属上海市第十人民医院检验科g肝癌信号调控与靶向治疗教育部重点实验室，上海200438h第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤科，上海200438阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2020年2021年1月13日修订2021年1月21日接受2021年8月11日在线提供保留字：肝内胆管癌吉西他滨药敏外周血单核细胞A B S T R A C T肝内胆管细胞癌（ICC）是第二常见的肝癌。化疗仍然是晚期ICC患者的主要治疗策略，但化疗敏感性因人而异。在这里，我们应用飞行时间流式细胞术（CyTOF），以建立外周血单核细胞（PBMC）的单细胞水平上的免疫概况，在指定的时间点化疗前，化疗期间和化疗后。应用多重免疫荧光染色来检查某些免疫簇的空间分布。组织微阵列（TMAs）用于预后评估。共20例ICC患者接受吉西他滨（GEM）治疗，其中8例为良好反应（R），12例为无反应（NR）。在化疗后观察到PBMC组成的巨大变化，包括CD 4/CD 8双阳性T细胞（DPT）水平的增加。治疗前CD4+ CD45RO+ CXCR3+ T细胞水平较高的患者对化疗反应良好我们的研究发现，T细胞亚群的百分比与化疗后的临床反应呈正相关，这表明通过评估PBMC中细胞群的比例来预测治疗前的潜在反应©2021 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍肝内胆管细胞癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是第二常见的原发性肝癌.它被定义为位于第二胆管近端的胆管癌，发病率稳定增加[1]。ICC来源于肝内胆管的上皮细胞，手术切除是唯一的治愈性治疗方法[2]。作为一种高度恶性的疾病，只有接受完全R0手术切除的患者才有很好的机会，*通讯作者。电子邮件地址：chenlei@smmu.edu.cn（L. Chen），yuanzg@163.com（Z.- G.Yuan），hywangk@vip.sina.com（H.- Y. Wang）。#这些作者对这项工作做出了同样的生存[3]。以前，姑息治疗主要应用于不可切除的ICC患者[4]。几项研究报告称，放疗和辅助化疗为晚期或侵袭性胆道肿瘤提供了生存获益[3，5]。然而，由于复杂的肿瘤异质性，ICC患者对化疗的反应性不同。因此，它是一个紧迫的问题，开发一种无创的方法来区分患者的良好反应（R）和无反应（NR）的患者吉西他滨（GEM）是一种核苷类似物，对人体各种实体瘤（包括乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和非小细胞肺癌）具有活性抗肿瘤作用[6];常用于ICC来源的肝转移[7]。不可切除和转移性ICC的一线化疗选择是吉西他滨和顺铂联合治疗[8]。除了https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.01.0142095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engT. 吴玉-C. 扬湾，澳-地Zheng等人工程7（2021）13811382·化学毒性，GEM具有免疫调节功能[9，10]。此外，已表明患者的免疫状态可影响其化疗敏感性[11因此，ICC患者的免疫状态与其对GEM的敏感性之间的关系应予以阐明。在这项研究中，我们应用飞行时间流式细胞术（CyTOF）进行高维、深入的免疫表型分析，以比较化疗前、化疗期间和化疗后患者外周血单核细胞（PBMC）的免疫特征我们发现，高水平的CD4+CXCR3+ T细胞，代表外周血中T细胞的活化状态，表明ICC患者对化疗的反应更好我们还通过多重免疫荧光染色检测了ICC肿瘤组织中的CD4+ CXCR3+ T细胞水平，发现其水平与其在血液中的水平呈正相 关 组 织 微 阵 列 （ TMAs ） 帮 助 我 们 证 实 ， 具 有 高 水 平 CD4+CXCR3+ T细胞的患者具有更好的总生存期（OS）。2. 材料和方法2.1. 患者和样本特征血液样本收集自20名ICC患者，在三个不同的时间点（化疗前/化疗 中 / 化 疗 后 ） 接 受 GEM 联 合 化 疗 ， 来 自 东 部 肝 胆 外 科 医 院（EHBH）。根据实体瘤缓解评价标准（RECIST），将这些ICC患者的治疗缓解分类为部分缓解（PR）、疾病稳定（SD）或疾病进展（PD）。PR和SD患者均被视为R患者，而PD患者被视为NR患者。由于几名患者在治疗期间脱落，因此最终共有49份血液样本入组本研究。所有20例患者的临床特征见表1。所有样本均根据当地伦理指南进行匿名编码。我们的CyTOF抗体组由35种表面免疫标记物组成分离PBMC并用金属标记的抗体预染色，然后使用CyTOF分析对高维原始数据进行处理，在进一步分析之前进行降维。还鉴定了在不同收集时间点R患者与NR患者中差异分布的免疫簇2.2. 分离pbmc为了分离PBMC，将新鲜血液样品（2mL）与等体积的盐水混合。然后将混合物小心地叠加在4mL Ficoll液体的表面上，并以450g离心25分钟。将PBMC离心后浓缩在2.3. 质谱CyTOF和数据处理每个PBMC样品在如前所述分离后用重金属缀合的抗体染色[14]。 组合使用了一组包含广泛免疫亚群的35种抗体（附录A中的表S1）。CyTOF抗体组既可以检测PBMCs的经典免疫表型，又可以发现新的免疫簇。预偶联抗体直接从供应商处购买。分离后，用10 mmol L-1顺铂染色2分钟，然后与金属结合的表面膜抗体在37 °C下孵育30分钟。接下来，用固定和烫发缓冲液固定细胞。最后，进行细胞嵌入（固定和渗透缓冲液加铱）以进行细胞固定和可视化;该过程持续过夜，然后在Helios质谱细胞仪（Fludigm，USA）上进行分析。根据制造商的说明书使用EQ TMFour Element Calibration Beads以标准化信号。对于每个样品，收集250 000-300 000个细胞事件。将文件（.fcs）上传到Cytobank中，手动门控感兴趣的群体，并将感兴趣的事件导出为.fcs文件。在进一步分析之前，对高维原始数据进行降维处理。使用R软件上的Cytofkit程序从每个文件.fcs中进行随机采样。然后对这些细胞进行基于t分布随机邻居嵌入（t-SNE）的可视化和基于FlowSOM/Renograph算法的聚类。差异分布表1ICC患者的临床特征和RECIST状态患者性年龄TNM评分TNM阶段化疗治疗在第一次化疗在第二次化疗在第三次化疗RECIST不NMECOGCA19-9WBCECOGCA19-9WBCECOGCA19-9WBC（U·mL-1）（×109L-1）（U·mL-1）（×109L-1）（U·mL-1）（×109L-1）1男性55301IVGEMOX112.006.10195.66.08238.46.25PR2女性44X11IVGEMOX16.507.5727.15.04210.66.11SD3男性57X11IVGEMOX112981.008.4618700.08.4111909.06.00SD4男性62X11IVGP161.807.761153.06.661184.47.20PR5女性61XX1IVGEMOX112283.008.3211972.04.191132.94.00SD6女性54XX1IVGS112.304.0619.42.78110.43.59SD7男性43XX1IVGEMOX2303.226.25195.66.08238.46.25PR8女性67XX1IVGEMOX1953.805.45NANANA21103.05.20SD9男性56XX1IVGEMOX1119.206.391256.45.692454.57.00PD10女性542X1IVGEMOX117.703.26114.43.36217.53.90PD11男性43X11IVGEMOX1221.504.052357.84.362525.74.00PD12女性532X1IVGEMOX1543.404.951866.88.112916.95.00PD13女性622X1IVGEMOX1146.3011.792132.010.931262.111.00PD14女性64X11IVGEMOX21.104.9920.54.39NANANAPD15女性67XX1IVGP1219.805.32NANANANANANAPD16女性61XX1IVGS152.804.47235.53.83NANANAPD17男性63X11IVGEMOX1187.004.57NANANANANANAPD18女性432X1IVGEMOX22.909.92NANANANANANAPD19男性67X11IVGP112632.007.47215823.06.71NANANAPD20男性56XX1IVGEMOX1200.306.801158.76.081158.97.00PDTNM：肿瘤（T）-淋巴结（N）-转移（M）; GEMOX：吉西他滨+奥沙利铂; GP：吉西他滨+顺铂; GS：吉西他滨+S-1; ECOG：美国东部肿瘤协作组评分标准; CA 19 -9：碳水化合物抗原19-9; WBC：白细胞; NA：不可用。T. 吴玉-C. 扬湾，澳-地Zheng等人工程7（2021）13811383还鉴定了在不同收集时间点R患者与NR患者的免疫簇2.4. 多重免疫荧光染色用Opal多重免疫组织化学检测试剂盒（Perkin-Elmer，USA）对含有75名患者的ICC组织的两个TMA进行染色，并使用Vectra3.0病理成像系统显微镜（Perkin-Elmer）获取图像将载玻片脱蜡并再水化，并使用Trilogy缓冲液（Cell Marque）通过高压灭菌15分钟回收抗原用3%H2O2 处 理 载 玻 片15分钟，洗涤，并用4%牛血清白蛋白（BSA ）/ 磷酸 盐缓冲 盐水（ PBS）/0.1%Triton X-100 （ 均来自Sigma）封闭. 使用的抗体为：抗CD8、抗CD4和抗CXCR3。用于每种抗体的检测染料是：opal570 染料（CD8 ）、opal520 染料（CD4）和opal690染料（CXCR 3）。 40，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）用作核复染剂。使用HighplexFL模块用Halo Image Analysis软件（Indica Labs）分析数字图像，该模块允许同时分析任何细胞区室-细胞核、细胞质和/或细胞膜中多达8种免疫荧光标记的标志物。对所有标志物呈阴性的细胞为黑色，对个别标志物呈阳性的细胞根据该标志物颜色着色，并且计算对三种标志物呈阳性的细胞所有75例患者的临床特征见附录A表S2。本实验中使用的抗体和相应的稀释比列于附录A表S3中。2.5. 数据和软件可用性本文报道的CyTOF数据的登录号和相关数据已上传到Mendeley数据库：https://doi.org/10.17632/3b9yc9296n.2。本研究中使用的软件见表S1。2.6. 伦理批准和参与同意遵循的所有程序均符合人体实验责任委员会（机构和国家）的伦理标准和1975年赫尔辛基宣言（2008年修订）（5）。获得所有患者的知情同意书，以便纳入研究。3. 结果3.1. GEM联合化疗改变PBMCs为了探索ICC患者外周血免疫微环境是否能够预测GEM的反应，我们设计了一个基于CyTOF的工作流程。如第2节所述，分离并处理PBMCs进行分析。基于对PBMC的深入单细胞水平分析，我们打算鉴定PBMC中可以预测ICC患者化疗敏感性的特异性免疫簇。应用多重免疫荧光染色以区分PBMC衍生的免疫谱和肿瘤内免疫谱（图1（a））。在处理原始文件后，从每个样品中的CD45+细胞中随机取样5000个细胞用于进一步分析。使用PhenoGraph，一种经典的聚类方法，定义了35个免疫簇。我们观察到给予GEM组合药物后PBMC中大多数免疫簇的主要变化，并且这些簇的变化在不同患者中非常不同（图1B）。 1（b））。 图图1（c）描绘了每个簇的分子表达。根据这35个聚类，经典免疫谱系，包括B细胞、CD16+自然杀伤（NK）细胞、CD16+骨髓树突细胞（mDC）、CD4+ CD45RA+T细胞、CD4+ CD45RO+ T细胞、CD8+ CD45RA+ T细胞、CD8+ CD45RO+ T细胞，可进一步细化CD 4/CD 8双阴性T（DNT）细胞、CD 4/CD 8双阳性T（DPT）细胞和单核细胞（图1（c））。系统分析后，确定DPT细胞 的 大 小 受 GEM 联 合 治 疗 的 影 响 ， 具 有 统 计 学 显 著 性 （ 图 1（d））。在我们的研究中，DPT细胞在化疗后显著富集（图1）。 1（d））。在化疗之前、期间和之后，PBMC衍生的免疫细胞上的多种表面标志物的表达示于图1B中。 1（e）. 如t-SNE图所示（图1）。 1（f）），GEM组合处理增加了CD7的表达水平，同时降低了CD161的表达。3.2. 化疗前，R组和NR组患者PBMCs的免疫功能有明显差异为了确定潜在的化疗敏感性预测因素，在下一步中，使用CyTOF分析来自20名化疗前ICC患者的PBMC，并从每个样品中随机采集5000个CD45+细胞使用FlowSOM，定义了30个免疫簇（图2（a））。二维t-SNE图用于显示来自PBMC的所有30个鉴定的免疫簇的分布。基于分子表达，我们进一步将30个簇重新分组为经典免疫谱系（图2（a））。PBMC中以CD4+ T、CD8+T、DPT和DNT为主，单核细胞、CD16+NK细胞、B细胞、CD16+ mDCs等仅占很小比例。标记基因的代表性表达模式显示在图2（b）中。使用热图显示了30个免疫簇和PBMC的不同谱系的分子表达特征（图1A和1B）。2（c）和（d））。为了进一步探讨8例R患者和12例NR患者PBMC免疫组成的差异，我们调查了R和NR患者之间经典免疫谱系是否存在显著差异。我们绘制了病人的树状图。在R组（患者1-8）和NR组（患者9-20）之间未发现经典免疫谱系的显著差异 20名患者的详细免疫组成显示在图2（f）中。有趣的是，与R患者相比，NR患者中仅CD4 + T细胞和CD8 + T细胞显示出下降趋势，而其他免疫谱系的分布在两组中保持相对相似（图1B）。附录A中的S1（a））。根据患者的树状图，将具有相似免疫组成的一些NR患者分组在一起（图2（f））。R组和NR组中PBMC不同免疫簇的比例比较见附录A图。 S1（b）. 在R患者中观察到几个簇显著高于NR患者，包括CD4+ CD45RO+ CXCR3+ T细胞（簇3）和CD8+ CD45RO+ CXCR3+T细胞（簇6和10）（图2（g））。总的来说，R和NR患者仅在T细胞方面表现出不同的免疫景观此外，个性也是一个不可忽视的因素。如图2（h）所示，典型谱系的组成在患者中变化很大。与其他患者不同，患者11和20中经典免疫谱系的百分比相当小。在大多数患者中，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞所占比例最大，而患者5的PBMC中CD16+这些结果表明PBMC中存在高度异质的患者间免疫环境。3.3. 外周血中某些T细胞簇与化疗我们接下来关注R组和NR组之间T细胞组成的差异。5000个T细胞T. 吴玉-C. 扬湾，澳-地Zheng等人工程7（2021）13811384Fig. 1. GEM联合化疗改变了PBMC的免疫特征。(a)整个工作流程的图形摘要。在整个化疗期间从ICC患者收集PBMC样品。将提取的免疫细胞用金属标记抗体处理并放入CyTOF管道中在降维后将采集的数据可视化通过手动门控策略和聚类算法识别细胞簇（b）热图显示在化疗前、化疗中和化疗后时间点所有患者中所有35个簇的细胞百分比（c）热图（所有化疗前/化疗中/化疗后样品）显示所有35个免疫簇中所有35个标志物的平均表达水平(d)绘制DPT的细胞百分比，并在化疗前和化疗后样品之间进行比较。P0.05。(e)对所有患者中多种标志物（CD 45、CD 49 d、CCR 5、CD 4、CD 8a、CCR 4、CCR 7、CD 28、Fas、CXCR 3、CD 278、CD 45 RA、CD 9、HLA-DR、CD 127和CD 16）的细胞百分比作图，并在化疗前、化疗中和化疗后时间点之间进行比较（f）示例性t-SNE图显示化疗后某些表面标志物的表达变化从化疗前、化疗中和化疗后收集的患者T细胞库中随机取样我们使用t-SNE图来呈现来自外周血的29个鉴定的T细胞簇的分布（图1B）。3（a））。分布的显著差异在R患者和NR患者之间发现外周血T细胞簇（图1B）。 3（b））。类似于图中的结果。图1（b）中，在R组和NR组中，大多数T细胞簇在化疗后均表现出变化（图1（b））。 3（c））。我们观察到，CD4+幼稚型T. 吴玉-C. 扬湾，澳-地Zheng等人工程7（2021）13811385图二、化疗前，R组和NR组患者PBMC的免疫功能有明显差异（a）t-SNE图（20个处理前样品）显示（i）通过表型图聚类方法在总淋巴细胞中鉴定出30个簇和（ii）鉴定出经典免疫亚群。(b)来自所有样品的标准化标志物表达的t-SNE图（c）热图显示了所有30个免疫簇中所有35个标志物的平均表达水平（d）热图显示了所有经典免疫亚群的门控策略（e）热图显示所有20名患者中所有经典免疫亚群的细胞百分比Scale方法：行规范化。（f）热图显示了所有20名患者中所有30个簇的细胞百分比Scale方法：行规范化。（g）绘制簇3/6/10的细胞百分比，并在R和NR患者之间进行比较P0.05。(h)每个ICC样本的经典免疫子集的频率化疗后，R和NR患者组中的T（Tnaive）细胞（簇5、6和14）增加，而CD 4+中枢记忆T（Tcm）细胞（簇9、22和26）减少根据根据患者使用监督聚类，值得注意的是，T. 吴玉-C. 扬湾，澳-地Zheng等人工程7（2021）13811386图三.外周血中的某些T细胞簇与化疗反应有关。(a)t-SNE图（所有化疗前/化疗中/化疗后样品）显示通过表型图聚类方法在总T细胞中鉴定出29个簇。(b)细胞密度分别显示在R/NR患者的t-SNE图上。(c)热图显示了所有29个免疫簇中所有35个标志物的平均表达水平。Tem：效应记忆T细胞; Teff：效应T细胞。(d)热图显示了所有29个T簇的细胞百分比。所有20例患者（治疗前）。(e)热图显示所有患者在化疗前/化疗中/化疗后时间点的簇1/16/22的细胞百分比。(f)①比较R组和NR组不同时间点的CD 4+ CXCR 3+ CD 45 RO+和CD 8+ CXCR 3+ CD 45 RO+T细胞百分比;②比较R组和NR组不同时间点的CD 4+/CXCR 3+ CD 45 RO+和CD 8+/CXCR 3+ CD 45 RO+T细胞比例。P0.05。(g)R组和NR组的聚类丰度相关模式不同。(h)12名ICC患者的独立队列的CD4+ CXCR3+T细胞的细胞百分比（6例具有良好应答，6例具有无应答）。(i)聚类丰度与患者临床特征之间的相关性显示在热图中。AST：天冬氨酸转氨酶; ALT：丙氨酸转氨酶;ALB：白蛋白; HGB：血红蛋白; PLT：血小板; DBIL：直接胆红素; TBIL：总胆红素; CEA：癌胚抗原。T. 吴玉-C. 扬湾，澳-地Zheng等人工程7（2021）13811387聚类1、16和22的组合更精确地将患者在化疗前分为不同的组点（图3（e））。然而，从其他两个时间点采集的样品不能很好地分离（图3（e））。簇16和22均被鉴定为CXCR3+ CD45RO+ T细胞。与病理发现相似，簇16和簇22在化疗前时间点在R患者中均显示上调（图3（f））。然而，在化疗前时间点，R患者中的簇22（CD4 + CXCR3 +CD45RO +T细胞）比NR患者中相对更显著地增加，而簇16（CD8 +CXCR3 + CD45RO + T细胞）显示相反的趋势（图1B）。 3（f））。为了进一步阐明这些簇的功能，我们仅在化疗前样品中探索了不同簇之间的共存和互斥。在R组中观察到簇27（CD4+ CD9+Tcm）与簇16和簇22正相关（图3（g）），除了CXCR 3之外，具有与簇22类似的表达谱。NR组中团簇间的共存关系与R组不同。我们发现簇25（CTLA4+DPT）、簇5和簇6（CD45RA+ Tnaive）共存，而所有这些簇与簇16和簇22互斥（图3（g））。我们还提取了其他免疫谱系，包括B细胞，NK细胞，单核细胞和DC，以分析其组成。 其聚类的t-SNE图和热图见附录A图。S2（a）和（b）。然而，患者无法根据B细胞、NK细胞、单核细胞或DC簇进行良好分组（附录A中的图S2增加了一个由12名接受基于GEM治疗的ICC患者（6名R和6名NR）组成的独立队列（患者信息见附录A中的表S4我们分析了其PBMC中CD4+CXCR3+T细胞的百分比，并验证了以下发现：在其PBMC中具有高水平CD4+CXCR3+T细胞的患者对基于GEM的疗法更敏感，并表现出更好的临床结果（图3（h））。为了探索CD4+ CXCR3+ T细胞的临床适应症，我们分析了在化疗前时间点簇22的大小与多个临床指标之间的相关性（图3（i））。R组22与全身炎症指标如白细胞（WBC）/中性粒细胞（NEUT）呈显著负相关，NR组22与WBC/NEUT呈显著正相关（P= 0.0929/0.0754），提示R组22升高提示全身炎症反应受到抑制（附录A图S2（d））。总的来说，我们的数据显示了R和NR组中T细胞簇的不同分布，特别是在预处理时间点。3.4. ICC患者外周血T细胞的活化状态提示其对化疗有较好的为了进一步探索R组和NR组之间T细胞分子表达谱的差异，我们检测了R组和NR组中所有35种标志物的表达，发现基于不同表面标志物的表达水平，可以将患者很好地分为R组和NR组（图4（a））。接下来，我们进行了基于免疫分子连锁的二元多变量逻辑回归分析。模型的受试者操作特征（ROC）曲线显示，R组与NR组相比，这35种免疫表面标志物的分化能力较高（附录A中的图S3）。每种标志物的贡献见附录A表S5。R组中CXCR 3、CD 45 RO、HLA-DR、CD 49 d和CD 11 a显著高于NR组（图4（b））。这些免疫分子的表达指示T细胞的活化状态。我们发现CXCR3和CD45RO的结合可以有效地预测ICC患者的化疗敏感性（图11）。 4（c））。R组和NR组中T细胞表面标志物的共表达模式见图1。 4（d）. 在R组中，HLA-DR的表达与PD-1密切相关，提示T细胞的免疫激活状态较晚然而，在NR组中，PD-1与CD 272（BTLA 1）共表达，这意味着T细胞的状态比R组更受抑制。从两组中的每一组获得两名患者的临床信息。成像数据显示，患者7（R）的肿瘤部位在化疗后显著缩小，而患者19（NR）的肿瘤部位在化疗后进展（图5（a））。与患者19相比，患者7具有更高的CD4+CXCR3+ CD45RO+ T 细 胞 的 细 胞 百 分 比 和 更 低 的 CD8+ CXCR3+CD45RO+T细胞的细胞百分比，特别是在24小时。的化疗前时间点（图5（b））。除了CXCR3，我们发现其他免疫分子，包括CD49d，CD11a和CD45RO，在患者7中显著高于患者19（图19）。 5（c））。研究已将CD 11 a高 CD 8+ T细胞鉴定为含有肿瘤反应性T细胞的群体，并且发现较高水平的CD 4+ CD 45 RO+/CD 4+ T细胞与化疗后较好的OS相关[15，16]。我们应用FlowSOM算法分析我们的质谱数据，得到80个聚类。根据80个聚类之间的表型相似性，我们将它们进一步划分为20个元聚类（附录A中的图5（d），图S4）。与患者19相比，患者7的CXCR3、CD11a、CD49d和CD45RO阳性 Meta荟萃簇更多，这证实了R组患者的T细胞更活化，对化疗的反应性更好（附录A中图5（d），图S4值得注意的是，CXCR3的表达在所有时间点在患者7中显示持续增加（图1B）。附录A中的S4）。3.5. 肿瘤环境中CXCR3+T细胞的水平反映了PBMC的状况并具有预后价值获得总共五个ICC患者的活组织为了评估CD4+ CXCR3+ T细胞的数量，我们应用了多重免疫荧光染色（图6（a））。有趣的是，我们发现外周血和配对肿瘤组织之间的T细胞呈正相关。来自R组的患者1和患者2在其外周血中具有高水平的CD4 + CXCR3 +T细胞，在其ICC组织中也具有更多的浸润的CD4 + CXCR3 +T细胞，而来自NR组的患者5、7和11的外周和肿瘤内CD4 + CXCR3 + T细胞都是罕见的（图1A和1B）。6（a）和（b））。为了验证PBMC和ICC肿瘤组织中CD4+CXCR3+ T细胞的一致性，从EHBH获得独立ICC患者组的13个从血液/肿瘤样品中分离PBMC/肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），并计算CD 4+CXCR 3+ T细胞的百分比。结果，我们证实了外周血和配对肿瘤组织之间的CD4 + CXCR3 + T细胞呈正相关（图11）。 6（c））。这13例患者的临床特征见附录A表S6。接下来，我们探讨了CD4+ CXCR3+ T细胞水平是否影响ICC患者的临床预后。 多个生存期和复发相关临床病理变量的单变量分析显示，仅CD4+ CXCR3+T细胞水平和肿瘤大小与OS显著相关（表2）。然后对每个参数进行多变量分析，结果表明，CD4+ CXCR3+ T细胞水平是影响ICC患者生存率的独立和重要因素（表2）。T. 吴玉-C. 扬湾，澳-地Zheng等人工程7（2021）13811388见图4。化疗前R患者的免疫表面标志物特征明显。(a)热图显示了所有20名患者（治疗前）中所有35种标志物的平均表达水平。(b)比较R/NR患者之间几种表面标志物（CXCR 3、CD 45 RO、PD-1、HLA-DR、CD 49 d和CD 11 a）的表达水平。(c)热图显示所有患者在化疗前/化疗中/化疗后时间点的CD 45 RO和CXCR 3的平均表达（d）化疗前R/NR患者中所有35种表面标志物的聚类树4. 讨论先前的研究强调了肿瘤微环境（TME）在癌症化疗和放疗中的作用[5，17治疗前癌症患者的局部免疫微环境和全身免疫景观的状态可能会影响他们对化疗的反应和放射治疗。最近的一项研究[5]指出，治疗前PBMC的全身免疫状况可用作肝细胞癌（HCC）对钇-90（Y 90）-放射栓塞（RE）的持续治疗反应的预测生物标志物吉西他滨是一种经典的化疗药物，已被证明对多种肿瘤有效，包括ICC[6，22然而，基于GEM的治疗反应T. 吴玉-C. 扬湾，澳-地Zheng等人工程7（2021）13811389图五. 典型病例化疗前PBMCs免疫标志物表达水平与临床预后的关系(a)计算机断层扫描（CT）图像显示（i）患者7的肿瘤（来自R组）和（ii）患者19的肿瘤（来自NR组）分别在化疗之前和之后。(b)（i）CD 4+/CXCR 3+ CD 45 RO+ T细胞比率分别在化疗前患者7和患者19之间绘制和比较（ii）CD 8+/CXCR 3+ CD 45 RO+T细胞的比率。P0.05。(c)绘制32种表面标志物的平均表达水平，并在患者7和患者19之间进行比较。P0.05。(d)从患者7中提取的淋巴细胞的SPADE分析和19.每个圆圈代表一个细胞簇。表面标志物的表达水平用颜色编码。由于个体和肿瘤异质性，ICC患者的化疗不同[27]。因此，确定ICC患者的化疗敏感性预测生物标志物并加速ICC化疗的个体化进程具有重要意义，这将使临床医生不仅能够选择治疗方案，tic策略更精确，而且还减少了不必要的医疗费用。本文应用CyTOF技术检测了20例患者的PBMC，发现其与正常人相比，R和NR患者的全身免疫景观的差异。PBMC中CD4+ CXCR3+T细胞水平较高的患者对GEM化疗更敏感。此外，我们发现PBMC中CD4+CXCR3+T细胞的丰度与肿瘤组织中的丰度之间存在强相关性。尽管患者之间存在异质性，但我们的研究确定了一些一般模式。研究发现，GEM，T. 吴玉-C. 扬湾，澳-地Zheng等人工程7（2021）13811390见图6。肿瘤环境中CXCR3+T细胞的水平反映了PBMC的状况，并具有预后价值。(a)ICC组织微阵列中CD4 + T细胞、CD8 + T细胞和CXCR3+T细胞的多重免疫荧光染色。用Halo软件分析CD 4+CXCR 3+T细胞的定位。 比例尺：100μm。(b)流动图显示作为CD4+ CXCR3+ T细胞门控的细胞（c）外周血和配对肿瘤组织之间的CD4+ CXCR3+ T细胞的相关性P0.05，基于Pearson相关性检验。r：相关系数;n：样本数。(d)Kaplan–Meier analysis of the correlation between CD4 P0.05。RFS：无复发生存期。表2OS的单变量和多变量分析变量OS单因素分析多变量分析HR（95% CI）P值aHR（95% CI）P值aCXCR3表达0.729（0.5560.0210.719（0.5390.025年龄1.029（0.9990.0521.007（0.9770.666肿瘤数目1.683（1.1880.0071.985（1.3330.001糖尿病1.719（0.9350.0991.486（0.7330.271高血压1.746（0.9920.0661.990（1.0300.041HR：风险比; CI：置信区间。aP值表示在不同的生存和复发相关的临床病理变量下OS的差异的显著性。作为一种常见的化疗药物，在人体内具有免疫调节功能[28，29]。我们确定了基于GEM的化疗对患者的全身免疫状况具有免疫调节作用。化疗后R组DPT细胞和CD7+ CD161+ CD16+NK细胞水平较 NR组明显升高，提示化疗有效化疗可以激活患者已报道DPT细胞存在于各种病理条件下，包括病毒感染、炎性疾病和癌症[32，33]。使用掺入5-氨基乙酰丙酸（ALA）的纳米复合物的稳健光动力疗法可以通过增加DPT细胞来治愈转移性黑素瘤[31]。T. 吴玉-C. 扬湾，澳-地Zheng等人工程7（2021）13811391为了建立PBMC免疫状态与患者化疗敏感性之间的联系，我们继续探索R组和NR组在化疗前时间点的差异。有趣的是，我们发现R患者和NR患者外周血中T细胞的分布存在显著差异，特别是在第22群（CD4+CXCR3+ CD45RO+ T细胞）和第16群（CD8+ CXCR3+ CD45RO+ T细胞）中，这两个群均被鉴定为CXCR3+ CD45RO+ T细胞。干扰素γ（IFNc）诱导型趋化因子受体CXCR3及其内源性配体主要是参与炎症和伤口愈合[34，35];它们还在TME中发挥重要的双重作用在活化的T淋巴细胞上发现了CXCR3，据报道其配体具有抗癌活性[36，37]。CXCR3+淋巴细胞向TME的迁移被认为参与了抗肿瘤反应[38]。癌症中CXCR3+效应记忆CD8+T细胞的存在和细胞毒性已显示在化疗后增加[39]。化疗药物，如紫杉醇，也重塑了肿瘤内的CD4+T细胞分布，使其趋向Th1（CXCR3+）表型[40]。但外周血单个核细胞和肿瘤组织中T细胞CXCR3表达水平与化疗效果是否相关仍需进一步研究进一步分析免疫簇与临床指标之间的相关性表明，在R患者中，CD4+ CXCR3+ T细胞的增加表示肝脏状况较好R组CXCR3、CD 45 RO、HLA-DR、CD 49 d、CD 11 a表达水平升高，提示T细胞活化状态与化疗反应强呈正相关。CXCR3和CD45RO联合检测可有效预测ICC患者化疗敏感性我们的数据还检测了ICC患者配对的切除肿瘤组织和PBMC中CD 4+/CD 8+ CXCR 3+通过进行多重免疫荧光染色，我们发现CD4+ CXCR3+ T细胞水平与总体和无复发生存率最近出现的CyTOF技术是一种基于电感耦合等离子体质谱法的灵敏测量方法，用于精确系统免疫学所需的单细胞蛋白表达的深入分析[41]。CyTOF可以同时检测每个细胞40多个标志物，消除了传统流式细胞术检测参数数量的限制，使细胞类型的区分更加容易[42]。使用传统的基于荧光的流式细胞术同时检测核糖核酸（RNA）和蛋白质、抗原特异性T细胞筛选和染色质修饰分析受到可用参数数量和复杂光谱重叠补偿过程的限制[43]。CyTOF通过同时可靠地量化目前多达45个参数，并在未来应用中提供更高的多重功能，在维度增量方面取得了突破[42]。在我们的研究中，我们利用CyTOF实现了对PBMC的深入分析，并描绘了ICC患者的全身免疫景观然而，这项研究仍然存在局限性和制约因素。 CyTOF技术不如流式细胞术灵敏，CyTOF的抗体组需要仔细设计和验证，需要有经验的劳动力，仪器和试剂都很昂贵[41，44]。这些限制意味着CyTOF目前还不能广泛应用需要更多的改进，以允许更多的医院获得CyTOF机器，供全球临床医生使用为了验证我们的CyTOF结果的准确性，我们通过流式细胞术检测了R组和NR组中PBMC的分子表达。此外，我们的研究受到了来自同一患者化疗前后肿瘤组织可用性的限制，因为活检不是常规在化疗前对患者进行，并不是所有的患者都经历了整个化疗过程。由于患者外周血比肿瘤组织更容易获得，更便于临床应用，因此我们主要关注PBMC中的T细胞然而，如果我们招募更多接受手术切除联合GEM化疗的ICC患者，以进一步研究CD4+ CXCR3+ T细胞如何浸润到肿瘤中，通过使用连续切片进行免疫组化等实验，这些问题我们目前的研究也有其他局限性这些患者主要在一个临床中心招募，我们的发现需要一个独立的验证队列，缺乏这一队列可能会导致对ICC患者中GEM敏感性的外周血CD4+ CXCR3+ T细胞数量或T细胞标志物表达的差异能力的高估或低估为此，我们计划在多中心水平上进行后续研究，在前瞻性ICC队列中验证我们目前的发现，并分析胆管癌细胞中CD4+ CXCR3+ T细胞的可能生物学功能然而，这些障碍并不包括我们的结论，这些结论是从基于GEM的化疗之前和之后的不同时间点的PBMC中的T细胞的全面、高维分析中5. 结论综上所述，我们的工作不仅证实了化疗药物影响ICC患者的免疫状况，而且还揭示了ICC患者的免疫功能直接决定了他们的化疗敏感性。此外，我们发现ICC患者PBMC的免疫景观可以反映全身免疫功能的状态分析外周血单个核细胞的免疫背景被认为是指导ICC患者治疗选择的一种有前途的方法致谢本工作得到了国家重点研究项目（2017 YFA 0505803和2017 YFC0908100）、传染病国家重点项目（201