医学信息学解锁20（2020）100392基于结构的药物设计，通过靶向核糖核酸内切酶NSP 15鉴定潜在的COVID-19抗病毒药物D. Anantha Krishnan，G.Sangeetha，S.Vajravijayan，N.Nandhagopal*，K.Gunasekaran**晶体学和生物物理学高级研究中心，马德拉斯大学，Guindy校区，Chennai，600 025，印度A R T I C L EI N FO关键词：核糖核酸内切酶冠状病毒COVID-19NSP15抑制剂A B S T R A C T由于2019冠状病毒病（COVID-19）大流行，世界正面临健康和经济浩劫。考虑到感染人数和死亡率，该病毒无疑是对人类的严重威胁。通过与早期关于严重急性呼吸系统综合征（SARS-CoV）和中东的报告进行类比，呼吸综合征（MERS-CoV）-病毒，新型冠状病毒的复制机制可能是很好的联合国理解。SARS冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的核糖核酸内切酶（NSP 15）的结构是新近报道的。这种酶预计在复制中起着至关重要的作用。在这项工作中，试图确定这种酶的抑制剂。为了实现这一目标，进行了高通量的计算机筛选和分子对接程序。从10亿化合物的烯胺数据库中，选择了3978种具有潜在抗病毒活性的化合物进行筛选并诱导拟合对接，最终筛选出8种具有良好对接评分和对接能量的化合物。对活性位点处的非共价相互作用的详细分析以及分子与结合口袋形状的表观匹配进行了评估。所有化合物都显示出紧密结合的显著相互作用。由于所有化合物都是合成的，具有良好的药物样性质，因此可以考虑立即优化和下游应用。1. 介绍近年来，由于运输规模和速度的重大改进，病毒感染已成为全球人类社会的致命威胁。出现了新型病毒，它们与所有严重急性呼吸道综合征有关。其中，SARS-CoV和MERS-CoV已造成高致死率。目前，SARS-CoV-2正在引起一场迅速蔓延的大流行。COVID-19导致的死亡率在感染人群中非常高。此外，大流行病需要作出重大的缓解努力，这一点和卫生保健系统的直接成本已经造成了经济衰退。过去曾发生过动物到人的传播，在过去几年中，也报告了人到人的传播[1，2]，并形成了当前大流行的基础。虽然疫苗正在开发中，但只有支持性的健康护理系统目前可以在治疗感染方面发挥作用。在考虑治疗感染的方法时，必须详细了解病毒复制、潜在的宿主、传播机制和途径 到 治疗一般 症状 的 症状 的COVID-19感染通常是温和的，与流感非常相似，而不是SARS和MERS病毒感染引起的症状[3]。这些轻微的病例被认为在其传播中起了作用。为了设计针对COVID-19的药物，可以采用最近报道的几种策略[4]。第一种策略是根据现有的广谱抗病毒药物设计化合物。这种方法的优点是具有已确定的药物特性的化合物，这些化合物具有在人类中使用的历史，因此可以容易地使用。然而，这种策略严格限于有限的化合物库，并且直接从这样的家族的成员产生强大治疗的可能性非常不确定。用于治疗冠状病毒肺炎的利巴韦林和亲环素等抑制剂就属于这一类。第二种是利用现有的数据库，可能有对冠状病毒的治疗作用的化合物进行筛选，第三种策略是基于基因组信息和病理学特性。在这些方法中，第一种方法是一种更快的方法，因为我们在抗病毒数据库中有大量的化合物用于初步筛选。此外，还有关于针对关键蛋白质靶点的小分子的报道，这些蛋白质靶点对于病毒复制至关重要，并具有经证实的效力。* 通讯作者。** 通讯作者。电子邮件地址：nandhanu@gmail.com（N. Nandhagopal），gunaunom@gmail.com（K.Gunasekaran）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2020.100392接收日期：2020年5月26日;接收日期：2020年7月2日;接受日期：2020年7月2日2020年7月11日在线2352-9148/©2020的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：http://www.elsevier.com/locate/imuD.A. Krishnan等人医学信息学解锁20（2020）1003922Fig. 1. NSP15的多序列比对。蓝色星星代表催化剂残留物。(For关于这一图中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版最近，有几篇报道引用了采用计算机虚拟筛选方法设计SARS-CoV-2药物[5在SARS和MERS的情况下，除了木瓜蛋白酶样蛋白酶之外，结构蛋白（NSPs）已经被研究并报道为有效的阐明了病毒的NSP和开放阅读框（ORF），如DNA复制、表观遗传和基因表达调控、囊泡运输、脂质修饰、RNA加工和调控、泛素连接、信号传导、核转运、细胞骨架的构建小分子药物的靶点[16]。冠状病毒的旁系同源物，线粒体， 和 细胞外 矩阵X [17 ]第10段。 最近， NSP15几个保守的序列基序，并已令人信服地作为药物靶点[2]。现在，关于SARS-CoV-2进入宿主细胞和复制的一些细节正在浮出水面不同的功能COVID-19，尿苷酸特异性核糖核酸内切酶（NendoU）结构被报道，并基于与SARS和MERS的NSP 15据报道，NSP15是D.A. Krishnan等人医学信息学解锁20（2020）1003923��参与RNA复制和亚基因组RNA的加工，但功能仍不清楚。2. 材料和方法2.1. 序列分析从序列数据库中检索对应于SARS-CoV-2、SARS和MERS的NSP 15的一级氨基酸序列。使用ClustalW进行多重序列比对，并使用ESPript 3.0[18]绘制图表。2.2. 蛋白质制备和网格生成NSP15的三维晶体结构从蛋白质数据库（PDB ID：6VWW）检索[19]。为了进行对接研究，使用Schr dinger软件套件中可用的蛋白质解析向导优化蛋白质结构[20，21]。蛋白质模型的制备包括两个步骤。在第一步中，加入氢原子并中和侧链原子。第二步是细化，其中去除水分子并使模型最小化。最后，使用OPLS-2005力场，通过共轭梯度法进行能量最小化，以具有唯一的低能量最小结构。生成包含负责NSP15内切核酸酶活性的重要活性位点残基的网格框。活性位点残基是His 235、His 250、Lys 290、Ser 294、Tyr 343和Thr 341。采用Schr dinger软件包网格生成面板中的Glide网格模块。2.3. 抗病毒文库制备通过从Enamine数据库（https://enamine.net/）检索来制备一组3978个具有抗病毒活性的分子。所有这些化合物均使用Schrodinger的Ligprep模块制备[22]用于几何优化和能量最小化。2.4. 基于结构的虚拟筛选（SBVS）最初，将抗病毒化合物的文库对接到COVID-19的NSP 15中;使用HTVS算法（Glide，Schrodinger）的新的潜在药物靶标选择约20 20203的网格覆盖整个催化位点。分子对接分两步进行;标准精密度（SP）和额外精密度（XP）[23]（Schrodinger LLC，2014），以分析蛋白质和配体之间的相互作用，从而基于对接评分和滑移能对其进行排名。基于对接得分和滑移能，使用标准精度（SP）算法进一步重新对接前20%的对接化合物。进行了EXtra precision（XP）对接程序，其中20%的SP对接结果。在对接期间，活性位点残基保持刚性（其包括H235、H250、K290、S294、T341和Y343），并且允许配体是柔性的。由于库中有大量的分子，在虚拟筛选的几个阶段中，每个配体仅考虑一个对接姿势。为了分析结合特征，对所选分子进行诱导拟合对接。2.5. 选择的化合物针对NSP15核糖核酸内切酶（NSP15）为了具有所提出的配体（来自早期步骤）与NSP 15的动态结合特性，通过诱导配合对接（IFD）程序进行柔性对接。对于每种配体，考虑20种结合姿势，并基于相互作用、对接得分和滑移能选择最佳姿势。所有的分子模拟研究都是使用OPLS-AA（液体模拟优化势-全原子）力场进行的。使用2D maestro view分析所有对接的复合物的配体相互作用，图二. 基于结构的虚拟筛选-流程图。从wwPDB下载靶蛋白NSP15的三维结构，ID：6VWW。使用Chimera可视化软件进行叠加分析。3. 结果和讨论3.1. 序列比对NSP 15（COVID-19）与SARS-CoV-2、MERS-CoV和H-CoV-229 E（人类冠状病毒）的序列比较NSP15与上述三种蛋白的同源性分别为87%、52%和44 病毒分别当仅催化结构域（COVID-19的NSP 15的235-343）对齐时，存在89%的高度保守性，61%和50%。保守区被发现，D.A. Krishnan等人医学信息学解锁20（2020）1003924图三. 识别的新先导分子的示意图。还提供了物理化学性质。分布在整个蛋白质的长度，特别是，保守性是显着高的催化结构域（图1），这可以归因于功能的相似性。催化结构域区域之间如此高的序列相似性强烈支持可以在该蛋白质家族的所有研究中得出的功能推断。催化三联体残基His235、His250和Lys290在属于冠状病毒家族的所有病毒中是保守的。这些残基与核糖核酸酶活性以及功能性六聚体形成有关[24，25]，当然，由于这个原因，蛋白质的这个区域是潜在的药物靶标。3.2. 使用SBVS方法总共从烯胺数据库下载了3978个具有抗病毒活性的化合物用于特异性对接。使用对接程序Glide（Schrodinger suite）的虚拟筛选工作流程，采用SARS-CoV-2的NSP-15结合区的计算机辅助筛选方案。运行了一种灵活的对接方法，该方法自动生成每个配体分子的不同构象。 共3978个配体用于使用HTVS的多个对接过滤器进行筛选。基于对接得分，526种化合物被列入候选名单，其值优于-5.00的对接得分（DS），D.A. Krishnan等人医学信息学解锁20（2020）1003925-表1鉴定的先导化合物对NSP 15的对接评分和滑行能（kcal/mol）（PDBID：6VWW）。化合物对接评分(kcal/mol）滑移能（kcal/mol）互动（D-HA）、Z56786758-5.44-56.21Lys 290（NHis 235（N表2已识别先导化合物的催化位点相互作用化合物H235H250K290S294T341Y343Z595015370YXYYXYZ2228348553XXYYXY邮编：Z1302426228YXYXXX邮编：Z1343129850XYYYXYZ16215674XXYYXYZ2760938911YXYYXYZ2239044677YXYXYXZ56786758YXYXXX* 配体与催化残基的相互作用（Y表示“yes”and X indicates40.00 kcal/mol的滑移能（GE），随后进行SP对接，得到174个化合物（DS-5.5和GE-40.5 kcal/mol）。最后，对174种化合物进行XP（额外精密度）模式筛选，得到19种化合物（DS-6.0，GE-46.0）。SBVS的详细工作流程见图。 二、3.3. 配体与NSP15在十九种化合物中，从柔性对接到IFD，Z595015370-10.50-51.37Ser294（N-H赖氨酸290（NHis 235（NTyr 343（Leu346（N-H O）Z2228348553-9.87-50.03（N-H-O）Tyr343Gly248（赖氨酸290（NLys290（NLeu346（（O（邮编：Z1302426228-9.68-44.33His 235（NGly248（（O-H N）His250赖氨酸290（N（邮编：Z1343129850-9.42-40.01（O-H-O）Tyr343Leu346（（N-H丝氨酸294（（O-H N）His250（O-H-O）Tyr343赖氨酸290（NZ16215674-9.07-49.35（N-H丝氨酸294（N赖氨酸290（NTyr 343（Z2760938911-8.65-55.95丝氨酸294（N（O-H O）Leu346Tyr 343（（NHis 235（NGly248（Z2239044677-6.74-60.19色氨酸333（（N-H-O）Thr341His235（NLys290（N赖氨酸290（NLeu346（D.A. Krishnan等人医学信息学解锁20（2020）1003926见图4。对接复合物（2D maestro视图）：发现所有配体与活性位点相互作用，具有多种有利的相互作用。D.A. Krishnan等人医学信息学解锁20（2020）1003927图五、 所有鉴定的 化合物在NSP1 5 的活性位点处的叠加。所有的化合物都与催化位点很好地吻合图六、根据已识别铅化合物的残留分解能量分析。（A）范德华力（B）静电学。D.A. Krishnan等人医学信息学解锁20（2020）1003928--选择了在NSP 15的活性位点上表现出显著结合的八种化合物。图3中示出了二维方案及其物理化学性质。还在滑动评分和能量方面比较了预测的结合相互作用（表1和表2）。从这些表中，有趣的是注意到所有化合物都与重要的催化残基Lys290相互作用，如从SARS和MERS NSP 15所理解的，该催化残基主要参与核苷的水解[24，25]。水解所必需的残基His235被发现与8种化合物中的5种具有相互作用。与催化残基接近并可能负责底物结合的Ser294和Tyr343残基的羟基也与模型中的配体形成氢键。还注意到，在MERS（NSP15）的情况下，已通过突变研究确定了残基 Tyr343 （ Y343A ） 对 核 糖 核 酸 酶 活 性 的 重 要 性 [26] 。 化 合 物Z595015370、Z1343129850和Z2760938911在有利于结合的活性位点处表现出四种相互作用。发现除Z56786758外的化合物与催化残基及其附近形成许多相互作用，显示其潜在的结合特性。从图（图4）中可以看出，建模导致了所提出的结合情况，这是定性地预期这种酶的抑制剂的情况。此外，应注意，所有化合物均位于活性位点内这表明对接进行没有不寻常的空间问题（图。 5）。化合物Z595015370的对接得分为10.50 kcal/mol和51.37 kcal/mol的滑移能建立了与NSP 15的许多不同类型的相互作用，因此预期表现出紧密结合。为了理解对接复合物的结合自由能和贡献，进行了每个残余分解能量分析，发现除了氢键相互作用之外，许多活性位点残基还通过范德华和静电相互作用对有利的结合做出了显著贡献（图6）。详细研究了SARS的核糖核酸内切酶（NSP 15），并且His-His-Lys三联体（对应于COVID-19的His 235、His 250和Lys 290）涉及催化活性，并且据报道，活性位点环境附近的许多残基执行从单体或三聚体回收六聚体。对这些残基的突变分析使得NSP 15不能缔合以显示水解活性。此外，据报道H235A、H250A和K290A突变体严重降低内切核糖核酸酶活性。在MERS-CoV NSP 15的情况下，Tyr 339（COVID-19中的Tyr 343）突变体（Y339 A）也显示出降低了MERS-CoV NSP 15的表达。活动[24，25]。4. 结论在这项工作中，随着解决最近全球COVID-19大流行（如WHO的声明）的紧迫性和对用于治疗病毒感染的新药候选物的高需求，最近报道的一种重要的内切核糖核酸酶被考虑用于基于结构的药物设计工作。为了使筛查有效和快速，从烯胺数据库中检索具有推定的抗病毒活性的化合物，并使用分级过滤来筛选在NSP 15的活性位点处显示紧密结合的化合物。鉴定的化合物显示出有利的药物样性质，包括溶解度。根据对接程序，表观相互作用似乎与良好抑制剂活性位点相互作用的预期相当。因此，这些化合物可用于抑制NSP 15核糖核酸内切酶活性，进而阻止病毒复制。此外，由于这些化合物已经合成，因此可以很容易地考虑进一步研究。披露声明作者声明他们没有利益冲突数据可用性说明“应提交人要求提供的数据”。支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。竞合利益作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作确认作者A.D.感谢印度医学研究委员会（ICMR），印度通过授予高级研究员身份来支持他的研究。作者还衷心感谢埃里克·安德森博士，博士，美 国 国 家 糖 尿 病 、 消 化 和 肾 脏 疾 病 研 究 所 肽 中 心 质 谱 负 责 人 ，Bethesda，MD 20892，感谢他帮助语言纠正并提供有用的建议。附录A. 补充数据本 文 的 补 充 数 据 可 在 https ： //doi 网 站 上 找 到 。org/10.1016/j.imu.2020.100392。引用[1] 宋宏东，涂春春，张国威，王世英，郑珂，雷良春，等。果子狸和人类严重急性呼吸综合征冠状病毒的跨宿主进化。 Proc Natl Acad Sci Unit States Am2005;102：2430-5. https://doi.org/10.1073/pnas.0409608102。[2] RahamanJ，Siltberg-Liberles J. 避免出现构象和功能灵活性的区域，以确定当前和未来的抗病毒靶点冠状病毒Genome Biol Evol 2016;8：3471-84. https://doi.org/10.1093/gbe/evw246.[3] Zhao S，Cao P，Chong MK，Gao D，Lou Y，RanJ， et al.冠状病毒病（COVID-19）的时间变化序列间隔及其性别特异性差异：香港和深圳公共监测数据的数据驱动分析中国，2020年1月10日至2月15日2020年感染控制医院流行病学1-8. https://doi.org/10.1017/ice.2020.64网站。[4] Wu C，Liu Y，Yang Y，Zhang P，Zhong W，Wang Y，et al.治疗分析SARS-CoV-2的靶点以及通过计算方法发现潜在药物。Acta Pharm Sin B2020;10 （ 5 ） ： 766-88 。 https://doi.org/10.1016/j 的 网 站 。apsb.2020.02.008。[5] Benítez-CardozaCG，Vique-SaánchezJL. ACE2和SARS-CoV-2（RBD）之间相互作 用 的 潜 在 抑 制 剂 ， 以 开 发 药 物 。 Life Sci 2020;256 ： 117970.https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.117970网站。[6] 陈文辉，陈文辉，陈文辉.从FDA批准的药物中鉴定SARS-COV-2内切核糖核酸酶（EndoU）的潜在抑制剂：一种寻找COVID-19治疗药物的药物再利用方法生物分子结构动力学杂志2020年：1-11。https://doi.org/10.1080/07391102.2020.1775127网站。[7] Choudhury A，Mukherjee S. SARSCoV2刺突糖蛋白与ACE2受体同源物相互作用的比较表征的计算机模拟研究，人TLR。J Med Virol 2020：1-9. https://doi.org/10.1002/jmv.25987网站。jmv.25987.[8] 放大图片作者：J.J. 穿心莲内酯作为SARS-CoV-2主要蛋白酶的潜在抑制剂：计算机模拟方法。JBiomolStructDyn2020：1-7.https://doi.org/10.1080/07391102.2020.1760136。[9] Feng S，Luan X，Wang Y，Wang H，Zhang Z，Wang Y，et al. Eltis a potentialtarget for drug intervention in SARS-CoV-2 spike protein. Infect Genet Evol2020：104419. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2020.104419网站。[10] Gupta MK，Vemula S，Donde R，Gouda G，Behera L，Vadde R.计算机模拟方法检测人严重急性呼吸综合征冠状病毒包膜蛋白离子通道的抑制剂。JBiomol StructDyn 2020：1-11. https://doi.org/10.1080/07391102.2020.1751300.[11] Hage-Melim Li da S，Federico LB，de Oliveira NKS，Francisco VCC，CorreiaLC，de Lima HB，et al. Virtual screening，ADME/ToX predictions and the drugrepurposing concept for future use of old drugs against the COVID-19. Life Sci2020;256：117963. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.117963网站。[12] 黄俊，宋伟，黄宏，孙勤.靶向RNA依赖性RNA聚合酶、蛋白酶和刺突蛋白的药物治疗：从COVID-19的机制研究到临床试验。临床医学杂志2020;9：1131。https://doi.org/10.3390/jcm9041131。[13] Iftikhar H，Ali HN，Farooq S，Naveed H，Shahzad-ul-Hussan S.计算机模拟筛选SARS冠状病毒2型三种关键酶的抑制剂D.A. Krishnan等人医学信息学解锁20（2020）1003929approach.计算机生物医学2020;122：103848。https://doi.org/10.1016/j的网站。Copyright © 2018 - 2019 www.combiomed.com版权所有[14] Shah B，Modi P，Sagar SR.新型冠状病毒治疗药物的计算机模拟研究：药物再利用方法。Life Sci 2020;252：117652. https://doi.org/10.1016/j的网站。lfs.2020.117652。[15] Islam R，Parves MR，Paul AS，Uddin N，Rahman MS，Mamun A Al，等.一种分子模拟方法来识别有效的抗SARS-CoV-2主要蛋白酶的抗病毒植物化学物质。JBiomol Struct Dyn 2020：1-12. 网址：http：//doi.org/10.1080/07391102.2020.1761883[16] Béaez-SantosYM，StJohnSE，MesecarAD. SARS冠状病毒木瓜蛋白酶样蛋白酶：结构、功能和抗病毒化合物的抑制作用。Antivir Res 2015;115：21-38.https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.12.015网站。[17] Gordon David E，Jang Gwendolyn M，Bouhaddou Mehdi，XuJiewei，Obernier Kirsten，Tutuncuoglu Beril，Foussard Helene，Batra Jyoti，Krogan NJ. Nature2020;583：459-68. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2286-9网站。[18] 古埃山口ESPript/ENDscript：提取和渲染序列和3D蛋白质原子结构的信息 核酸研究2003;31：3320-3.https://doi.org/10.1093/nar/gkg556。[19] 放大图片创作者：Robert Jedrzejczak. Maltseva ME，Adam Godzik，KM和A J.来自SARS-CoV-2的Nsp 15内切核糖核酸酶NendoU的晶体结构2020：1-18。[20] 杨文伟，李文伟.蛋白质和配体制备：参数、方案和对虚拟筛选富集的影响。J Comput Aided Mol Des2013;27：221-34. https://doi.org/10.1007/s10822-013-9644-8.[21] Schr o€ dinger Release2014-1. 蛋白质制备向导。 NewYork，NY：Epik，Schro€dinger，LLC;2014. ;Impact，Schro€dinger，LLC，NewYork，NY，2014;Prime，Schr o€dinger，LLC，NewYork，NY. 2014年。[22] 薛定谔释放[n.d]。 NewYork，NY：LigPrep，Schr o€dinger，LLC;2020.[23] GlideSch rodinger. 版本6.0[n.d]。 NewYork，NY：Schr o€dinger，LLC;2014.[24] Deng X，Hackbart M，Mettelman RC，O'BrienA，MielechAM，YiG，etal.Coronavirusnonstructuralprotein15mediatesevasionofdsRNAsensorsandlimitsapoptosisinmacrophages. Proc Natl Acad Sci U S A 2017;114：E4251-60. 网址：http：//doi.org/10.1073/pnas.1618310114[25] Zhang L，Li L，Yan L，Ming Z，Jia Z，Lou Z，et al. Structural andbiochemical characterization of endoribonuclease Nsp 15 encoded by MiddleEast respiratory syndrome coronavirus. 92.第92章大结局https://doi.org/10.1128/jvi.00893-18网站。[26] [10]张文，张文.突变分析SARS病毒Nsp 15核糖核酸内切酶：鉴定影响六聚体形成的残基。J Mol Biol2005;353：1106-17. https://doi.org/10.1016/j的网站。 jmb.2005.09.007。
我的内容管理
展开
