移植中HLA特异性免疫抑制的潜力：嵌合抗原受体和调节性T细胞的研究回顾

工程10（2022）30免疫学研究综述嵌合抗原受体和调节性T细胞：移植中HLA特异性免疫抑制的潜力Sabrina Wright#，Conor Hennessy#，Joanna Hester，FadiIssa牛津大学纳菲尔德外科学系，牛津OX3 9DU，英国阿提奇莱因福奥文章历史记录：2021年6月21日收到2021年9月22日修订2021年10月25日接受2021年12月20日在线提供保留字：嵌合抗原受体T细胞Treg同种免疫生物工程移植自身免疫A B S T R A C T嵌合抗原受体（CAR）是基因工程的一项突破，彻底改变了过继细胞治疗（ACT）领域。通过在合成CAR构建体内包含抗原特异性结合区，表达这些受体的细胞被重新路由至预定的具有程序化特异性的细胞的优势已经在肿瘤学领域的临床上得到证实，并且清楚的是，此类细胞与其未修饰的对应物相比具有更高的准确性、效力和降低的脱靶治疗效果。与常规T细胞（Tconv）相比，调节性T细胞（Tconv）在抑制免疫活化和调节宿主免疫应答中起主要作用。已经提出TCR4内的CAR表达作为自身免疫性和炎性疾病、移植物抗宿主病（GVHD）和器官移植排斥的疗法在后者中，它们作为同种异体移植受体免疫耐受的介导剂具有巨大然而，目前对CAR-Treg工程的研究非常有限，并且关于治疗用途的最佳设计存在不确定性。本综述探讨了CAR-Tclase开发背后的基本原理，它们对人类移植的意义，潜在的设计，安全性考虑以及迄今为止CAR-Tclase在移植模型中的比较。©2021 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍嵌合抗原受体（CAR）是过继性细胞治疗（ACT）细胞设计和生产的突破。通过在合成构建体内包含抗原特异性结合区，表达此类受体的CAR-T细胞被重新路由至预定义的具有程序化特异性的细胞的优势已经在许多异种移植模型中得到证实，并且很明显，与其未修饰的对应物相比，抗原特异性细胞具有更高的准确性、效力和降低的脱靶治疗效果。已经提出在调节性T细胞（Tcells）内诱导CAR表达作为自身免疫性和炎症性疾病、移植物抗宿主病（GVHD）和器官移植排斥的推定疗法（表1）[1CAR-T细胞作为同种异体移植受体耐受性的介质具有巨大的潜力，因此值得更多的关注。在现阶段进行审查是必要的，以突出需要，*通讯作者。电子邮件地址：fadi. nds.ox.ac.uk（法文）。Issa）。#这些作者对这项工作做出了同样的鼓励在这一领域进行更多的研究，并确定在实验研究进展到临床应用之前必须解决的缺失信息领域。为了本综述的目的，T细胞被定义为CD 4+ CD 25+-FOXP 3+（CD：分化簇; FOXP 3：叉头框P3）T细胞;相反，具有促炎特性的T细胞的CD 4+ CD 25当描述已经被修饰以表达CAR的T细胞时，修饰的Tconv被称为CAR-Tconv，而修饰的Tconv被称为CAR-Tconv。1.1. Treg抑制1995年，Sakaguchi等人[6]将TcB正式确认为T细胞的一个独特亚群，他们通过标志物标志性CD4+ CD25+对其进行鉴定。这篇具有里程碑意义的论文阐明了Tcl3抑制同种异体应答的能力，并揭示了Tcl3的耗竭导致免疫应答增强和自身免疫性疾病的自发发展。后来的工作将转录因子FOXP3鉴定为Treg表型的定义调节因子[7]。淋巴细胞是适应性免疫系统中天然存在的淋巴细胞亚群，https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.10.0182095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engS.赖特角，澳-地Hennessy，J. Hesteret al.工程10（2022）3031表1目前五项研究的总结，检查CAR-Tclase是否可以调节同种免疫应答。参考scFv铰链结构域跨膜结构域共刺激结构域CD3f信号链结果MacDonald等人[1]第一章HLA-A2CD8aCD28CD28CD3f同种异体反应性T细胞的抑制Boardman等人[2]HLA-A2CD28CD28CD28CD3f皮肤移植排斥反应Noyan等人[3]第一章HLA-A2CD8aCD8CD28CD3f皮肤移植排斥反应Imura等人[4]美国CD19CD28CD28CD28/4-1BBCD3f同种抗体产生Sicard等人[五]《中国日报》HLA-A2CD8aCD28CD28CD3f皮肤移植排斥反应HLA：人类白细胞抗原; ScFv：单链可变区片段。维持免疫稳态除了介导对自身抗原的耐受性之外，它们在炎性条件下起作用以限制效应免疫应答，从而防止对个体组织的过度损伤通过多种接触依赖性和可溶性机制，TdR操纵免疫它们能够直接抑制其他免疫细胞亚群，包括B细胞和CD 4+ CD 25-以下是THBE用于调节免疫系统对抗原刺激的反应的主要策略1.1.1. 细胞溶解细胞溶解分子如颗粒酶B被释放以直接杀死靶促炎细胞。由胸腺衍生的天然胸腺肽（nTcR）产生的颗粒酶B诱导Tconv和B细胞中的细胞凋亡[10，11]。穿孔素/颗粒酶途径介导直接细胞毒性，但穿孔素与颗粒酶B之间的关系一直存在争议。两项体外研究描述了表达颗粒酶B的FOXP3+细胞的颗粒酶B依赖性、穿孔素依赖性抑制系统[12，13]，而Gondek等人[10]报道了两种系统之间的独立性Cao等人[14]使用颗粒酶B缺陷型小鼠模型报道，穿孔素和颗粒酶B对于Treg介导的自然杀伤（NK）和CD8+ T细胞增殖都很重要，因为缺乏这两种分子的基因的Treg的过继转移未能抑制肿瘤清除。类似地，在穿孔素敲除模型中发现穿孔素对于Treg介导的DC去除是必需的[15]。1.1.2. 细胞因子释放白细胞介素（IL）-10和IL-35是负责抑制促炎反应的关键调节细胞因子[16]。白介素-10阻止Tconv释放促炎细胞因子和趋化因子，同时抑制DC和其他专职抗原呈递细胞（APC）上的共刺激分子和II类主要组织相容性复合物（MHC）的表达[17IL-35是已知Treg工具库的相对较新的添加物，并且已经显示直接抑制小鼠中Tconv的增殖[20]。尽管IL-35在人TcB中不是组成型表达的，但人TcB的长期活化导致IL-35的上调，从而赋予增强的抑制能力[21，22]。有趣的是，离体诱导的TGFs（iTGFs）似乎依赖于细胞因子信号传导而不是细胞毒性来发挥其功能;几项研究已经报道，通过iTGFs的转化生长因子b（TGF-b）信号传导负责抑制B细胞、T细胞和DC[11，23]。然而，迄今为止，在临床前模型中，胸腺T细胞比iT细胞更受青睐（可能是由于它们在体内的稳定性更高），因此对iTreg机制的深入分析不在本综述的范围内1.1.3. DC的操作T细胞能够减弱或消除来自专业APC的活化信号，以防止幼稚T细胞的活化[24]。Treg分子细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）与APC细胞表面的共刺激分子CD 80和CD 86结合，触发吲哚胺2，3-二氧合酶（IDO）的释放，IDO是一种致耐受性酶，可作为Tconv中色氨酸催化剂的速率限制剂，并导致周围环境中色氨酸代谢物浓度增加，对Tconv细胞周期进程具有抑制作用[24，25]。此外，T细胞受体（TCR）结合以CTLA-4依赖性方式刺激DC上CD 80和CD 86的下调[24]。1.1.4. 代谢紊乱和竞争通过竞争必需细胞因子的代谢破坏是另一种有效的抑制机制。特别是，TclO可以通过消耗外部供应直接剥夺周围细胞的IL-2，从而限制非TclO的生长和存活[26]。当在单个区域聚集时，TcB上CD 25（IL-2受体a）的高表达可能结合足够的IL-2，以诱导周围细胞的凋亡[26]。1.1.5. 感染耐受性最后，Tclase可通过称为感染耐受的现象在炎症细胞中诱导耐受原性表型[27，28]。这需要TGF-b表面上的膜结合TGF-β，其以接触依赖性方式诱导FOXP 3+ T细胞从幼稚前体从头产生[29]。IL-35具有将靶Tconv转化为Tconv的能力;因此，可以将其视为感染耐受性因子[22]。1.2. 作为一种新兴疗法，过继性细胞疗法（ACT）的治疗策略利用免疫细胞的内在功能;在THBE的情况下，这是促进耐受状态。Treg的其他特征，包括其增殖、与其他细胞类型相互作用和发挥多种抑制机制的能力，支持Treg疗法优于非细胞方法。在发现TcB后不久，人们意识到它们的抑制功能可用于抑制自身免疫性疾病和移植背景下的免疫应答[30，31]。随后进行了关于Treg转移疗法对各种自身免疫性疾病（包括1型糖尿病、实验性自身免疫性脑脊髓炎和系统性红斑狼疮）、GVHD和同种异体移植的有效性的体内研究[32研究表明，离体扩增的T细胞可通过减少CD4+和CD8+ T细胞浸润延长人源化小鼠模型中皮肤和胰岛同种异体移植物的存活，这使人乐观地认为这些结果可在人类患者中复制[37，38]。在移植中使用胸腺肽的概念主要由于非细胞免疫的毒副作用而获得关注。S.赖特角，澳-地Hennessy，J. Hesteret al.工程10（2022）3032免疫抑制药物，并希望基于细胞的治疗将减轻毒性的风险[39，40]。在移植受者中观察到心血管疾病和糖尿病的发生率较高;尽管这些疾病在很大程度上受到移植前患者合并症的影响，但它们也直接受到药理学免疫抑制剂的影响[39，41]。高血压在肾移植患者中常见，主要是由于钙调磷酸酶抑制剂治疗所致，其在成人患者中的患病率可高达82%[39，42]。这些因素反过来会增加心血管疾病的风险，如心肌梗死、心肌病、心力衰竭和中风[40]。总体而言，器官毒性严重影响患者的生活质量，并且仍然是移植受体中移植物丢失和患者死亡的主要原因[40]。细胞疗法也可能是更大的实用性的患者谁否则将遵循每日用药方案。未修饰的多克隆Tclase在人体中可在两周到一年内保持可检测性，允许剂量之间的时间跨度更大;这将减少患者的负担，并降低因不依从性导致的同种异体移植物排斥的机会[1，43，44]。一个有待回答的问题是，是否有必要重复给予TdR，或者是否有可能从有限的输注中建立一个自我维持的供体特异性TdR群体。Treg过继性转移的第一次人体临床试验提供了证据，支持使用扩增的多克隆Treg预防或治疗GVHD和自身免疫性疾病[45根据在小鼠中的类似研究[48]，在没有任何并发免疫抑制的情况下，人类患者中的早期Treg输注显示出预防慢性GVHD;此外，Treg治疗与针对机会性病原体的更大细胞免疫相关，同时保留移植物抗白血病效应[49]。然而，死亡率突出了在安全性方面改进的需要：患者仍然容易受到腺病毒感染、弓形体病、细菌感染和来自一般性抑制的免疫系统的真菌感染最近，实体器官移植成为I期剂量递增试验的主题，以评估肾移植患者中在Mathew等人的这项试验中[50]，9名活体肾移植受者接受了移植后两个月，淋巴细胞耗竭后，与霉酚酸酯（MMF）和西罗莫司维持治疗联合，离体扩增的自体THBE。值得关注的是，未报告严重不良事件，也未观察到机会性感染或其他免疫抑制相关疾病的证据。研究人员报告称，移植后两年移植物存活率为100%[50]。 正在进行进一步的研究以确定Treg治疗的潜力，同时具有最小的免疫抑制。 ONE研究是一个国际联盟，旨在评估活体供肾移植背景下的不同调节细胞类型，其中包括TCFs [51]。患者最初接受三联治疗（泼尼松龙、MMF和他克莫司），随后在移植后5天输注自体多克隆Tcl4[52]。在接受调节细胞并完成观察期的38例患者中，15例成功地停用他克莫司单药治疗，与接受标准免疫抑制治疗的患者相比，病毒感染较少[51]。随后宣布了一项名为TWO研究的后续II期试验，旨在评估TBI联合西罗莫司单药治疗预防肾移植排斥反应的疗效[53]。尽管目前还不清楚TIPs是否可以完全取代传统药物，但即使将免疫抑制降低到单药治疗，也会对同种异体移植物和患者的结局产生显著的积极1.3. 抗原特异性T细胞免疫激活途径的非特异性抑制剂，如代谢抑制剂，赋予全身性抑制，使整个身体而不仅仅是供体器官受到影响。除了心脏毒性和肾毒性外，已知全身免疫抑制的重度方案会增加患者降低患者虽然细胞疗法消除了许多与药理学药物相关的毒性，但风险仍然存在，即具有多克隆特异性的Tcl3仍将增加移植患者中感染和恶性肿瘤发展的脆弱性。为了解决这个问题，正在设计新的治疗方法来靶向供体组织特异性抗原，从而使表达自身抗原的其他器官不受影响。虽然癌症特异性CAR-Tconv的设计者面临着选择合适靶点的困难（几乎没有真正的癌症特异性抗原），但在移植的情况下，供体和受体的人类白细胞抗原（HLA）的表达等位基因库之间存在这使得它可以靶向供体器官所特有而受体所不存在的抗原，从而实现对同种异体移植物的高特异性TCR占循环CD 4+ T细胞群的不到10%，并且其中只有一小部分将携带针对目标抗原的正确TCR[56通常通过将大量的TCLs与同种异体DC或与先前已经用同种异体肽脉冲的自体DC共培养来体外选择性扩增抗原特异性TCLs[57，58]。或者，遗传操作可用于直接赋予多克隆细胞样品特异性。许多临床前研究已经将已知特异性的重组TCR克隆到宿主CD 4+ T细胞中，以产生靶向细胞疗法;这已经在Tcirrhosis以及Tconvs中完成[59-61]，并且已经从多发性硬化症和1型糖尿病的实验模型中获得了有希望的然而，尽管TCR对MHC的加工允许识别胞内（IC）肽，但也存在这样的论点，即TCR（无论是内源性的还是修饰的）的主要缺点是它们限于与MHC相关的肽，从而限制了靶抗原的库此外，钙调磷酸酶抑制剂对DC中MHC表达的下调作用的证据表明，如果患者接受某种药物免疫抑制，则该过程可能会受到损害[62，63]。为了解决这些问题，第一辆汽车的开发Gross等人于1989年报道[64]。该受体将抗2，4，6-三硝基苯基抗体的恒定和可变结构域与a或bTCR链的一段结合;然后将总构建体转染到细胞毒性T细胞杂交瘤中。所得到的转基因细胞被证明具有抗原特异性的、非MHC限制性的效应子功能，以及在其靶细胞中诱导细胞因子产生的能力。通过使用抗体的可变片段而不是TCR的MHC限制性结合区，合成受体可以与细胞外（EC）肽接合而不需要加工。重要的是，对于同种异体移植，这意味着MHC分子本身也可以被靶向。1.4. CAR设计继Gross等人革命性的[64]，许多其他研究人员已经扩展了CAR的设计和应用，以改善寿命和功能。汽车已经被设计成各种各样的S.赖特角，澳-地Hennessy，J. Hesteret al.工程10（2022）3033细胞类型，包括NK细胞、CD 8+ T细胞、Tconv和Tconv[65CAR是TCR设计的改进，因为它们是模块化的，并且CAR构建体的各个区段可以被添加或取代（图1）。例如，共刺激结构域可以由TCR的不同结构域形成，其中CD 28和4-1BB（CD 137）是最常用的，并且每一个都赋予CAR的功能其自身的优点或缺点。还可以掺入另外的组分，例如细胞因子序列，以增强它们的功能。CAR疗法在治疗复发性或难治性癌症中显示出显著的功效，其中先前的治疗线已经失败。他们在临床前模型和后来的临床试验中取得了巨大成功，为美国食品药品监督管理局（FDA）在2017年批准两种独立的CAR-Tconv 疗 法 铺 平 了 道 路 ， 一 年 后 又 获 得 了 欧 洲 药 品 管 理 局（ EMA ） 的 批 准 [70] 。 其 中 一 种 疗 法 ， tisagenle-cleucel （ 以Kymriah®销售），在涉及75例患者的早期I/IIa期试验中达到了93%的完全缓解率[71]。在实验鼠模型中，CAR-TcR在治疗自身免疫性和炎性疾病方面以及在同种异体干细胞移植模型中预防GVHD方面类似地显示出功效，并且与多克隆TcR相比，在实体器官移植的同种异体模型中显示出优异的功效[1，2，72 -76]（图1A）。 2）的情况。CAR-Tibet的生产是最近的一个里程碑基因工程T细胞的发展。第一项研究其在同种异体移植中相关性的体内CAR-Treg研究由MacDonald等人于2016年发表。[1]，其说明了CAR-Tclase赋予针对HLA的抗原特异性抑制的能力;然而其作为移植排斥的预防和治疗的潜力仍然高度未被研究。目前尚未进行CAR-Treg的人体试验，因此也没有批准的CAR-Treg疗法。尽管如此，FDA和EMA最近批准了抗CD 19 CAR-Tconv Kymriah®和Yescarta®，这鼓励CAR-Tconv在不久的将来可能同样获得临床应用的同意[70]。2. 设计一种有效的CAR用于治疗性T细胞瘤采用具有抗原特异性结合区的基本嵌合分子的第一种设计--已经被标记为随后的设计在原型的扩展和持久性的基础上进行了改进（图3）。第二代CAR包括跨膜结构域和CD 3f信号传导结构域之间的共刺激结构域，以允许细胞的完全活化;这显著改善了扩增，并因此改善了携带受体的Tconv和Tconv两者的功效[77第三代和第四代CAR也被开发为包含额外的元素。所有CAR，无论产生与否，都在IC尾部含有CD3f链以传播激活信号，模拟通过TCR的激活虽然已经发表了关于CAR设计的优秀综述，但本文将具体讨论与CAR-TactiSys相关的每个组件的重要性。2.1. 选择HLA目标在CAR内，抗原特异性通常通过包含衍生自单克隆抗体（mAb）的单链可变片段（scFv）的轻链和可变链迄今为止，所有CAR-Treg同种异体移植物模型都使用MHC I类HLA-A2抗原作为治疗靶点，原因是其在人群中普遍存在，因此可以用单一CAR设计治疗大量患者Fig. 1.常规Treg与CAR-Treg设计。CAR-T细胞保留了T细胞的关键成分：CD 25和CD 4复合物。TCR复合物被模块化CAR-Treg设计取代，其提供抗原特异性，这取决于单链可变片段（ScFv）来源的单克隆抗体（mAb）这允许产生具有靶向抗炎作用的Tcl3，其可在下调同种异体移植中的同种异体反应和预防移植物排斥中具有应用Hc：重链; Lc：轻链。S.赖特角，澳-地Hennessy，J. Hesteret al.工程10（2022）3034图二、CAR-Treg介导的同种免疫抑制的拟定机制传统上认为同种异体移植后的器官排斥反应是由T细胞介导的同种异体免疫介导的APC如DC将来自供体组织的抗原呈递给宿主T细胞，然后通过识别“非自身”而激活这最终导致细胞毒性T细胞的产生，细胞毒性T细胞传播组织破坏并因此产生器官排斥。CAR-T细胞的拟议功能可能会防止这种情况。识别供体器官上抗原的CAR的构建（例如，HLA-A2）将导致Treg活化和增殖。然后，这些CAR-T细胞可以通过细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CLTA 4）-CD 80和主要组织相容性复合物I类（MHCI）-淋巴细胞活化基因3产物（LAG 3）相互作用直接抑制APC此外，CAR-T细胞可以通过产生抑制性细胞因子（TGF-β，IL-10和IL-35）直接抑制T细胞活化。最后，活化的CAR-Tclase可以通过释放颗粒酶和穿孔素破坏细胞毒性T细胞来抑制排斥反应[1这是优选的，以减少生产和扩增每个克隆所需的劳动力、然而，应探索其他常见的HLA抗原作为CAR-Treg疗法的潜在靶标事实上，如果CAR-Tribunal真正被设想为未来的治疗剂，那么地理和种族群体之间单倍型频率的变化需要扩大抗原靶标组[83在目前已知的超过800种中，CAR-T细胞的临床前模型尚未指定scFv可以结合HLA-A2的哪些亚型[81，82，91]。产生可以靶向多个等位基因的CAR以减少覆盖所有患者HLA单倍型所需的CAR设计的数量将是方便的，尽管这种情况将需要仔细控制以确定供体和受体之间没有不希望的交叉反应性发生（将进一步讨论的安全性问题）。有证据表明，HLA结合肽可以与多种不同的亚型反应[92]。2.2. 共刺激结构域CD 28和4-1BB最常用作CAR构建体的共刺激元件[1他们每个人都证明了对CAR的信号传导动力学和持久性，甚至对宿主细胞的抑制功能的不同影响[94]。CD 28的IC信号强度高于4-1BB;因此，存在更大的细胞扩增速率，这使得宿主细胞更容易耗竭，并且与更差的持久性相关[95，96]。相反，已证明4-1BB CAR在单次输注后在人体中存活超过600天[71]。第一项直接比较CD 28与4-1BB对CAR-T细胞表型和功能的影响的研究报告，CD 28在促进细胞因子分泌和总体抑制能力方面优于4-1BB[94]。携带CD 28结构域的CAR-T细胞产生的IL-10显著多于其4-1BB对照;这与体外与CD 4+和CD 8+ Tconv共培养时4-1BB CAR-T细胞的抑制能力降低有关。此外，该研究报告称，与缺乏任何共刺激结构域的第一代CAR相比，4-1BB甚至降低了CAR-Tclase的抑制功能。在CAR中测试较少的其他共刺激结构域包括诱导型T细胞共刺激分 子 （ ICOS ， CD278 ） 、 肿 瘤 坏 死 因 子 受 体 超 家 族 成 员 4（OX40）、CD27和CD40配体（CD40L）[97，98]。获得更多关于这些结构域的功效及其对Treg亚群的功能作用的数据将是有用的。CD 27是增强持久性的特别有希望的候选者; Song et al.[九十九]S.赖特角，澳-地Hennessy，J. Hesteret al.工程10（2022）3035图三. CAR的模块化结构。CAR结构可以根据目标靶标和功能进行修饰。ScFv提供抗原特异性，并且通常来源于针对感兴趣抗原的mAb。铰链结构域是可以增加细胞因子产生、增强增殖或促进迁移的任选组分。跨膜结构域将EC组分锚定到IC组分，并且还可以在信号转导中发挥作用共刺激结构域可以影响信号转导，增加细胞扩增速率，并防止T细胞耗竭。它们可以单独使用或组合使用，这取决于所需的效果。第四代CAR-T细胞已经引入了产生细胞因子的转基因，这些细胞因子可以帮助细胞的抑制或细胞毒性效应作用，这取决于其目的。IgG：免疫球蛋白G; IgD：免疫球蛋白D; OX 40：肿瘤坏死因子受体超家族成员4; ICOS：CD 278; CD 40 L：CD 40配体; M/：巨噬细胞; TLR：Toll样受体。结果表明，与携带CD28的CAR相比，携带CD27结构域的CAR具有增加的体内在第三代CAR中尝试了对第二代设计的改进，包括额外的共刺激域。Ramos等人[100]（使用Tconvs）的一项研究发现，CD 28和4-1BB的组合克服了每个单独结构域的局限性，与单独使用CD 28的第二代CAR相比，其持久性和扩增性更高。再一次，这个主题在CAR-T细胞领域还没有经过测试，值得对其潜力进行研究。2.3. 细胞因子结构域CAR构建体的进一步增强已经导致第四代CAR并入细胞因子结构域-最常见的是IL-12或IL-15-以增强针对抗肿瘤免疫治疗而工程化的CAR的细胞毒性作用[101从这种设计中获得灵感并将其应用于CAR-T细胞，在CAR内掺入调节性细胞因子如IL-10或TGF-β可以潜在地调节同种异体移植物内的免疫环境发现它们的纳入在多大程度上改善了CAR-Treg治疗的成功，在创造耐受性环境和在最小限度的药理学药物支持下预防移植物损伤3. 基因传递系统不同的基因组编辑技术与CAR表达细胞的不同效率、特异性、表达稳定性和安全性特征相关，这最终影响最终CAR-Treg产物的成功。在本节中，评价了用于CAR基因递送的已建立方法在CAR-Treg治疗背景下的适用性。3.1. 病毒载体病毒转导是T细胞遗传操作的最常用方法。这可以归因于它们的高编辑效率和它们的DNA货物最终掺入宿主细胞基因组中，从而导致稳定的蛋白质表达[104]。在逆转录病毒转导的TcR上的平均CAR表达范围为20%至95%[3，76]。虽然通过逆转录病毒递送制造的几种CAR产品已进入临床试验（特别是FDA批准的Yescarta®）[105，106]，但有证据表明此类细胞可表达免疫原性载体编码的表位，存在病毒载体可能增加治疗性细胞免疫原性的安全性问题[107]。通过偏向转录起始位点的半随机整合模式，遗传毒性风险增加[108，109]。慢病毒是逆转录病毒的一个复杂的亚家族，S.赖特角，澳-地Hennessy，J. Hesteret al.工程10（2022）3036载体，并且使用该方法工程化的CAR也已经进展到临床试验及以后，包括FDA批准的Kymriah®[110CAR-Treg研究已经报道了慢病毒转导效率的不同范围，从10%[72]）至30%[2]）。由于慢病毒系统倾向于活性基因位点而非转录起始位点，因此其遗传毒性似乎较低，并且被认为具有较低的插入诱变风险;因此，其在临床应用中更有利[108，109，113]。虽然CAR-Tconv尚未进入临床试验，但CAR-Tconv可以提供对病毒转导后它们在人体中的持久性的了解。来自axicabta-基因ciloleucel（Yescarta®）的ZUMA-1临床试验的数据表明，CAR可以在外周血中保持容易检测180天，甚至更长时间。在某些患者中为24个月;在这种 情 况 下 ， 使 用 了 CD 28 结 构 域 [114] 。 更 令 人 印 象 深 刻 的 是 ，tisagenlecleucel（Kymriah®），据报道，包含4-1BB结构域的CAR疗法在血液中持续最多617天，中位持续时间为168天[71]。这一证据表明，病毒递送具有支持CAR表达持续广泛和临床上适当的时间段的潜力。有趣的是，来自小鼠模型的CAR-Treg数据尚未证明使用病毒载体的CAR表达的如此长的持续时间。来自小鼠研究的数据显示，CAR-T细胞在慢病毒转导后仅存活2周（MacDonald等人[1]），在同种异体移植模型中逆转录病毒转导存活超过40天（Noyan等人[3]），在Tenspolde等人[75]的1型糖尿病模型中逆转录病毒转导存活17周。MacDonald等人[1]假设，持续性可能受到IL-2不足、抗原不足或两者联合的阻碍;第一种肯定是潜在因素，因为TCFs不产生内源性IL-2，而是依赖于其他细胞分泌。另一方面，Noyan等人的评论[3]提出了一个观点，即在MacDonald的研究中，小鼠用HLA-A2外周血单核细胞（PBMC）重建在这些研究中，CAR-Treg是否由于靶抗原的持续存在而耗尽，或者病毒载体赋予的免疫原性是否是CAR-Treg群体下降的原因，这些问题仍有待回答;这些因素及其对CAR-Treg治疗成功的影响将在本综述的后面进行讨论。上述病毒载体可以运输高达1000000的DNA货物。至8个内切酶（kb），远高于平均CAR序列的大小[115]。然而，基因整合以半随机的方式发生;这可能导致CAR的异质性表达，并可能导致DNA序列整合到原癌基因位点，促使一些研究人员探索替代方案。3.2. 转座子转座子是一种非病毒的遗传修饰手段，提供长期表达和更高的DNA货物限制，尽管在原癌基因位点附近整合的风险与病毒载体相似[116]。转座子元件通常与转座酶一起通过两个单独的表达质粒递送到细胞中（转座酶也可以作为信使RNA（mRNA）递送）[117，118]。转座酶切除货物DNA并该方法最重要的优点是货物容量，这是其他方法效率的限制因素;例如，表达系统PiggyBac可以携带高达14.3 kb的盒而不影响效率[117 ， 119] 。 转 座 子 系 统 对 人 外 周 血 细 胞 的 表 达 效 率 约 为50%[120]。转座子介导的CAR表达先前已用于临床环境中：作为Kebriaei等人进行的I期试验的一部分[121]，使用过度活跃的“睡美人”（SB）系统SB 11从患者来源的T细胞离体产生抗CD 19 CAR-TconvCAR转基因在外周血中可检测到，平均51天，最多180天。该实施例是追求长期CAR表达的令人鼓舞的起点，并且总体而言，与基于转座子的递送相关的货物容量、表达效率和体内持久性都有利于CAR-T细胞的制造3.3. CRISPR-Cas9成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关蛋白9（Cas9）系统，简称CRISPR-Cas9，提供了一种高度精确的基因组编辑方法。因为基因插入的靶位点可以由指导RNA的序列限定，所以与非特异性载体相比，异常基因插入大大减少。 CRISPR编辑具有相对较低的效率，这对于诸如CAR的大序列可能是有问题的，尽管其极高的特异性使其成为一种有吸引力的方法。将CAR序列靶向基因组的限定区域使得能够修饰特定的细胞类型;因此，在CAR-Tclase的生产过程中，靶向递送至Tclase共有或独特的基因据报道，靶向T细胞受体A恒定（TRAC）基因在转染的细胞中产生均匀的CAR表达，减少紧张性信号传导，并导致抗原暴露后CAR的内化和再表达，以延迟耗竭并延长细胞存活[122];然而，出现了这样的问题，即在所得CAR+细胞产物中可能发生促炎性T细胞亚群的污染，除非在基因编辑之前从大量T细胞群中成功分离出CD 4+CD 25+ FOXP 3+群体。应该探索对Treg亚群更专有的其他敲入靶点，例如FOXP3。那里是关切的同源定向修复（HDR）-介导的基因插入对内源靶基因是破坏性的。然而，通过利用内含子靶向和同源性非依赖性整合来保留内源序列的研究已经解决了这个问题[123，124]。通过使用CRISPR-Cas9技术在共享相同的单向导RNA（sgRNA）靶标的供体质粒和靶基因中产生双链断裂，供体模板可以以非同源方式有效整合，而不破坏内源性靶基因的表达[124]。这为CAR插入提供了一种更好的方法，并使真正的Treg特异性基因（如FOXP3）成为一种可行的选择[122，123]。4. 的细胞4.1. 自体自体免疫球蛋白表达患者的MHC库，因此不是固有的免疫原性，使其成为治疗用途的更安全和更可行的选择。细胞必须在输注前几周分离，以便有时间进行遗传修饰和扩增，自体CAR-T细胞的生成需要14至51天[105]。必须记住，Treg移植治疗的目的是避免与长期药理学治疗S.赖特角，澳-地Hennessy，J. Hesteret al.工程10（2022）3037免疫抑制和在Treg扩增期间移植后立即短期使用标准三联疗法非转基因THBE的临床试验在手术后进行了延迟输注，直到患者接受自体细胞后逐渐减少的药物治疗[52，125]。4.2. 同种异体使用第三方TCRs进行CAR治疗具有明显的优点和缺点。一方面，已经设想使用来自第三方供体的细胞将允许细胞培养物扩增和储存，以便在需要时以方便的“现成”方案可用于此外，在使用前可以对细胞进行广泛的质量筛选[126]。小鼠模型已经表明，将同种异体Treg过继转移到完全MHC错配的受体中可以防止具有与Treg供体相同的MHC谱的同种异体移植物的排斥[127]。另一方面，同种异体细胞的免疫原性潜力可能对其长期持久性产生不利影响Kebriaei等人[121]报道了在人造血干细胞移植（HSCT）受者中，与具有相同特异性的自体CAR-T细胞相比，输注的同种异体CAR-T细胞的检测期显著更短（分别为最长180天和360天）;这一结果突出了由此类细胞的免疫原性引起的并发症（研究人员将存活率降低归因于他们使用伴随的免疫抑制来控制GVHD 以及他们的方案中缺乏淋巴细胞耗竭）。为了降低免疫原性，可以采用进一步的细胞修饰来消除MHC的表达，从而避免免疫清除[128]。虽然这种潜在的解决方案可以允许许多移植患者用单一供体来源的CAR-T细胞迅速治疗，但必须产生许多不同的特异性以覆盖整个群体中大量的MHC考虑到这一点，自体细胞很可能是ACT近期的首选TCFs来源5. 不良反应和安全性问题尽管CAR疗法具有明显的治疗益处及其对某些恶性肿瘤的临床批准，但该技术仍处于起步阶段。有许多未回答的问题，理论上的风险，以及文献中必须解决的副作用。许多安全性问题对CAR-Treg疗法应用于人类移植患者构成障碍，特别是在重要器官是免疫抑制靶点的情况下。在这个阶段，关于CAR-Tribunal在体内的行为、疗效和安全性的已发表文献仍然非常有限。以下章节列出了当前相关文献中突出强调的重要安全问题，并提供了可能的解决方案。5.1. 靶细胞毒性颗粒酶B的产生长期以来被认为是Treg介导的抑制机制。这在移植的情况下是有问题的，因为供体器官在递送致耐受性细胞后变得易受细胞毒性损伤[10，94]。Boroughs et al.[94]表明CAR-Tclase能够通过颗粒酶B/穿孔素途径诱导表达靶抗原的细胞凋亡。虽然细胞毒性测量由于上皮破坏和增生-在他们的研究中是最小的，他们的结果保证了对如何减轻CAR-Treg抑制的破坏性机制的研究。研究人员报告了在培养期间用磷脂酰肌醇3-激酶-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI 3 K-mTOR）通路抑制剂雷帕霉素（西罗莫司）处理CAR-T细胞时抑制颗粒酶B的产生，这反映了先前关于PI 3 K-mTOR通路抑制剂对颗粒酶B影响的发现[129]。研究人员还建议敲除GZMB基因;这种遗传修饰策略的效果将在体内持续存在，而无需重复施用mTOR抑制剂[94]。降低细胞毒性的另一种直接方法是减少每次输注的细胞数量;然而，这需要熟练了解介导对同种异体移植物耐受性所目前，尚不清楚实体器官移植中抗原特异性CAR-T细胞的最佳剂量是多少。靶向、离器官结合是继细胞过继转移之后的另一个靶抗原在治疗上不相关的细胞上的表达在CAR-T细胞治疗恶性肿瘤领域中存在实质性障碍[130]。然而，与癌症免疫疗法不同，癌症免疫疗法通常依赖于在健康组织上以较小程度存在的肿瘤相关抗原的过表达，移植环境中的CAR可以靶向受体不表达的供体HLA等位基因，降低由CAR的错误结合导致的毒性风险。5.2. 与其他肽的脱靶毒性是CAR-T细胞的理论风险，主要是由于HLA特异性肽与其他HLA亚型交叉反应的趋势[92]。Noyan等人[3]通过将其暴露于20种不同HLA单倍型的PBMC，对其HLA-A2特异性CAR-T细胞进行了交叉反应性测试;虽然CAR优先结合HLA-A2，但记录了一个与HLA-A1型PBMC交叉反应性的实例。此外，CAR成功地结合HLA-A2的所有代表性亚型（CAR本身的亚型特异性未说明），表明供体和受体单倍型之间的这种精细水平的区分MacDonald等人[1]证明，他们的HLA-A2特异性CAR-T细胞与HLA-A2四聚体结合，但不与对照HLA-A24四聚体结合;然而，他们没有针对HLA-A2的单个亚型进行测试在另一项CAR-Treg研究中，Boardman等人[2]承认他们选择的抗HLA-A2的scFv已知与HLA-A28和HLA-68交叉反应。Tanigaki等人[92]的一篇论文还指出，A2结合肽可能与HLA-A家族的其他亚型-A24、A26、A28和A29发生交叉反应。他们的结果来自体外结合试验，并没有证明CAR-Tclase在结合后必然会激活和发挥抑制功能。然而，为了回答这个问题并提高CAR治疗的安全性，理想情况下应在一组HLA分子中进行然而，在移植环境中交叉反应性具有积极作用。如Boardman等人[2]所阐明的，交叉反应性允许CAR特异性和供体器官的单倍型的许多不同组合然而，为了利用这种可能性，需要了解每个CAR的结合靶标的全部库，以避免与受体的健康组织的S.赖特角，澳-地Hennessy，J. Hesteret al.工程10（2022）30385.3. 存在内源性TCR特异性除非TRAC基因被抑制或敲除，否则CAR-Treg