肿瘤内空间异质性与肺腺癌生存：正交分子谱技术鉴定不同模式与细胞运动性差异

文章肿瘤内空间异质性与肺腺癌患者生存相关图形摘要亮点D 肺腺癌表现为D 随机GD肿瘤的生存率d随机GD肿瘤的特征在于细胞粘附分化的GD肿瘤具有高水平的肿瘤细胞相互作用的内皮细胞，作者Hua-Jun Wu，Daniel Temko，Zoltan Zurga，...，尼古拉斯·纳文，Robert J.弗兰齐斯卡？米乔？唐尼通信downeyr@mskcc.org（R.J.D.），michor@jimmy.harvard.edu（F.M.）简言之使用三种正交空间分辨分子谱技术，等人鉴定了两组具有不同地理多样化模式的肺腺癌。他们发现这两组在生存结果上存在差异，并发现证据表明观察到的模式可能与肿瘤细胞运动性的差异有关Wu等人，2022，细胞基因组学2，1001652022年8月10日-作者。https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100165会会~开放获取文章肿瘤内空间异质性与肺腺癌患者生存吴华君，1，16丹尼尔·特姆科，2，3，4，16佐尔坦·科雷亚，5，16安德烈·L.莫雷拉，6埃米塞伊，7，8达尔兰孔特诺米努西，7，8杰米迪恩，2，3，4夏洛特李，2，9琼徐，2纪尧姆霍查特，10康纳A。雅各布森，5克拉伦斯亚普，5丹尼斯夏皮罗，5，11彼得K。索格，5，12艾琳H。西利，13尼古拉斯纳文，7，8罗伯特J。Downey，14岁，*和Franziska Michor2，3，4，11，12，15，17，*1北京大学医学部基础医学院、北京大学肿瘤医院与研究所精准医学多组学研究中心，中国2数据科学系，Dana-Farber癌症研究所，波士顿，MA 02215，美国3哈佛大学生物统计学系Chan School of Public Health，Boston，MA 02115，USA4哈佛大学干细胞与再生生物学系，剑桥，MA 02138，USA5系统药理学实验室和系统生物学系，哈佛医学院，波士顿，MA 02215，美国6纽约大学病理学系Langone Health，New York，NY 10016，USA7遗传学系，德克萨斯大学MD安德森癌症中心，休斯顿，TX 77030，美国8德克萨斯大学MD安德森癌症中心生物医学科学研究生院，休斯敦，TX 77030，美国9哈佛-麻省理工学院健康科学与技术项目，哈佛医学院，波士顿，MA 02215，美国10ImaBiotech SAS，59120 Loos，法国11Broad Institute of Harvard and MIT，Cambridge，MA 02142，USA12Ludwig Center at Harvard，Boston，MA 02215，USA13美国得克萨斯大学奥斯汀分校化学系14胸外科，纪念斯隆凯特琳癌症中心，纽约，NY 10065，美国15癌症演变中心，Dana-Farber癌症研究所，波士顿，MA 02215，美国16作者贡献相等17引线触点* 通信：downeyr@mskcc.org（R.J.D.），michor@jimmy.harvard.edu（F.M.）https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100165总结人类肿瘤的肿瘤内异质性（ITH）对于肿瘤进展、治疗反应和耐药性非常重要然而，ITH的空间分布仍然不完全清楚。在这里，我们使用多区域质谱技术对147例肺腺癌患者的ITH进行了空间分析。> 5，000个区域，2，000个单细胞的单细胞拷贝数测序，以及> 1000万个细胞的循环免疫荧光。我们确定了两种不同的空间模式之间的肿瘤，称为集群和随机地理多样化（GD）。使用蛋白质组学和基因组学数据在相同样品中观察到这些模式。在两个独立的患者队列中，随机蛋白质组学GD模式（其特征为细胞粘附减少和肿瘤相互作用内皮细胞水平降低）与复发或死亡我们的研究提供了肺腺癌中ITH的全面空间映射，并提供了对GD机制和临床结果的见解介绍肺癌是最常见的癌症类型，也是全世界癌症死亡的主要原因。1肺腺癌是非小细胞肺癌（NSCLC）中最常见的亚型，其特征在于个体肿瘤之间2和单个肿瘤区域之间的异质性。3区域之间的异质性，称为肿瘤内异质性（ITH），已被证明有助于治疗失败和耐药性，通过扩大预先存在的耐药亚克隆及其衍生物。4-7此外，一些研究表明，ITH的模式，主要以亚克隆改变负荷来衡量，与包括NSCLC在内的多种癌症类型的不良临床结果相关3，8-10以前的研究试图解码的空间模式，这种异质性使用多区域剖析。3，11这一警告导致我们对肿瘤空间异质性及其对肿瘤进展和肿瘤免疫生态系统组织的贡献的理解存在重大差距，16-18鉴于免疫检查点阻断的最近成功，这一19在这里，我们提出了一个大规模的，综合分析的ITH及其空间组织在肺腺癌的基础上，CellGenomics 2，100165，August 10，2022？作者。1这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。会开放获取文章2Cell Genomics2，100165，2022图1. 本研究中用于研究肿瘤内空间异质性的方法概述(A) 多区域MALDI-TOF概述。(B) 循环免疫荧光概述。(C) 多区域单细胞拷贝数测序概述。多个正交方法，其能够对肿瘤样品中的多个区域和/或单个细胞进行分析，同时保留它们的空间背景。这些分析包括来自两个独立群组中的147名患者的约5，000个区域光谱的多区域MALDI-TOF（基质辅助激光解吸电离-飞行时间）（图1A）、来自12名患者样品的> 1000万个细胞的CyCIF（循环免疫荧光）（图1A）和来自7名患者样品的51个区域的约2，000个单细胞的多区域单细胞拷贝数测序（图1C）。这些数据旨在阐明ITH的程度及其在肺腺癌蛋白质组和基因组空间中的空间模式，并探索患者之间的这种空间异质性变化如何与肿瘤微环境和拷贝数变异相关，以及它如何影响临床结果。结果肺腺癌的多区域MALDI-TOF分析为了研究肺腺癌在蛋白质组空间中的空间异质性，我们对切除的冷冻人肺腺癌标本进行切片，并为每个活检的肺腺癌收集成对的相邻切片-一个用于鉴定肿瘤细胞或正常肺泡和支气管上皮组织的组织学模式，一个用于MALDI-TOF分析。可鉴别的腺内组织学亚型包括：鳞片型、腺泡型、乳头型、微乳头型、实性、复合腺型和筛状型。20个来自这些不同肿瘤内的区域选择组织学亚型用于质谱分析，使得每个位点产生光谱分布及其在肿瘤切片中的地理位置（图1A）。所有肿瘤切片均取自给定肿瘤的最大横截面，并尽最大努力对整个切片进行取样，以明确代表上述7种经典组织学类别图2A显示了一个组织逻辑注释的例子在发现队列中，我们从95名患者中收集了4，007个感兴趣区域（ROI）（直径200mm），平均每个患者有30个肿瘤光谱和12个正常光谱（图2B）。此外，对三种间充质干细胞（MSC）和三种基底干细胞样品进行了分析，以获得干细胞蛋白表达谱作为进一步分析的参考，因为发现癌症样品与干细胞的分子距离与多种癌症类型中的更差结果相关。21对不同组织学亚型的每个样品的110-935个光谱的范围对于每个区域样品，鉴定了总共525个蛋白质峰，并对峰的信号强度进行积分以捕获单个蛋白质的表达水平（参见STAR方法和图1A）。基于距离矩阵的主成分分析（PCA）证明了蛋白质组空间中从正常肺组织到肿瘤到干细胞的连续轨迹，后者离正常肺组织最远（图S1B）。不同组织学亚型之间没有明确的分离，无论是在单个患者中还是当所有患者被视为一组时（图S1B和S1 C）;对于转录组，这也是真实的。CB一Cell Genomics2，100165，2022年8月10日3文章会开放获取A B CD EF G HI J图2.肺腺癌蛋白质组空间异质性研究(A) 组织学注释和样本分析示例。(B) 来自发现队列的患者中的正常和肿瘤谱的数量(C) 肿瘤内GD的拟定模式。（图例接下页）4Cell Genomics2，100165，2022会开放获取文章癌症基因组图谱数据集。2未发现组织特异性表达的蛋白质。然而，在肿瘤和正常组织之间观察到差异表达蛋白的明显差异，这些差异产生了一个中间聚类（图S1 D和S1 E），其中包含大比例的正常样本和低级别组织学，以及低比例的临床侵袭性更强的组织学（微乳头除外）（Pearson相关系数= -0.72; p 0.05）<。当在PCA空间中相对于MSC和正常分化组织进一步研究样品的轨迹时，最具侵袭性的组织学（例如实体）与MSC聚集，而最不具侵袭性的亚型（例如麻风病）与正常分化组织聚集（图S1B）。肺腺癌接下来，我们试图使用MALDI数据研究ITH在蛋白质组空间中的程度。香农指数（熵的量度）先前已被用于当“物种"（具有独特特征的细胞或样本）可清楚识别时量化肿瘤中22然而，在整个肿瘤蛋白质组或转录组的系统研究中通常无法获得这些物种。我们最近使用平均细胞间距离来基于单细胞RNA测序（RNA-seq）数据定量ITH。23在这里，我们定义了一个类似的度量标准，缩放平均成对距离（sMPD），以量化来自MALDI数据集中患者样本的区域样本之间的ITH（图S2A和S2 B）。为了测试该度量在MALDI数据设置中的准确性，我们进行了模拟研究，以通过使用亚克隆信息将sMPD与通过Shannon或Simpson指数量化的真实ITH进行比较（参见STAR方法;亚克隆信息对sMPD计算是盲的）。我们获得了sMPD的高预测准确度（图S2C和S2 D; ROC曲线下的受试者工作特征面积范围为0.8至0.99）。下采样分析表明，sMPD对样本量具有稳健性（图S2E;当样本量大于10时，所有样本的ITH秩变化均小于10%我们发现，通过sMPD定量的较高ITH与患者死亡风险增加之间存在趋势（图S2F; p= 0.063，对数秩检验）;当控制已知的临床病理风险因素时，相关性不显著（表S1和S2;p = 1，具有连续sMPD的Cox比例风险模型）。接下来，我们研究了蛋白质组学空间中样本的地理多样性（GD）的空间组织。已经提出了各种方法来研究蛋白质组和转录组的空间模式。24、25然而，这些方法并没有被设计成通过以空间分辨的方式整合所有测量的特征来量化肿瘤内的空间异质性。因此，我们设计了一种新的分析方法：我们将GD定义为分子特征和地理位置之间相关性的量度，使用Mantel相关性检验26进行量化（参见STAR方法）。肿瘤可具有两种GD模式之一：成簇模式，其中分子相似的细胞在空间中聚集在一起，或随机模式，其中分子相似的细胞在空间中随机分布（图2C和S3A）。当应用于我们的数据时，Mantel相关性检验提供了从蛋白质表达模式获得的成对分子距离与成对地理距离之间的相关程度及其意义（图S3B）。我们再次使用下采样分析来证明该指标的稳健性（图S3C;当样本量大于20时，所有样本的GD秩变化均小于10%）。我们鉴定了两组肿瘤：Mantel相关性为显著正的那些和相关性与零无显著差异的那些（p值截止值：0.01;图S3 D）。为了将我们的 发 现 与 使 用 现 有 方 法 获 得 的 发 现 进 行 比 较 ， 我 们 使 用PhenoGraph27基于其MALDI谱对每个肿瘤样本内的ROI进行聚类，并可视化不同蛋白质组簇的空间分布（图S3E）。我们发现，来自相同蛋白质组簇的ROI倾向于在簇状GD肿瘤中彼此靠近定位，而来自不同蛋白质组簇的ROI倾向于在随机GD肿瘤中混合。使用PhenoGraph获得的该模式的定量显示了簇集和随机GD肿瘤之间的显著差异，如通过Mantel检验所定义的（p =0.00041，Wilcoxon检验;图S3 F）。总之，我们的观察表明，具有相似蛋白质的组织(D) 集群GD模式的图示（患者P137149）。左图：蛋白质组空间中区域样品及其最近邻的地理右图：地理和分子距离的散点图。每个点代表两个区域样本之间的成对距离。R，Mantel相关系数; P，Mantel检验p值。(E) 随机GD肿瘤的图示（患者P132654）。左图：蛋白质组空间中区域样品及其最近邻的地理位置。右图：地理和分子距离的散点图。每个点代表两个区域样本之间的成对距离。r，Mantel相关系数; P，Mantel检验p值。(F) Kaplan-Meier生存曲线显示了来自发现队列的具有聚集和随机GD模式的患者。随机型GD患者的预后显著差于聚集型GD患者。HR，风险比; P，对数秩p值。在图S3D中定义了随机和随机GD图案。通过控制临床病理风险因素，采用连续GD评分进行的多变量Cox比例风险回归分析见表S3。(G) 来自验证队列的患者中的正常和肿瘤光谱的数量(H) Kaplan-Meier生存曲线显示了验证队列中具有聚集和随机GD模式的患者。随机型GD患者的预后显著差于聚集型GD患者。HR，风险比; P，对数秩p值。在图S3F中定义了随机和随机GD图案。通过控制临床病理学风险因素进行的连续GD评分的多变量Cox比例风险回归分析见表S5。(I) 簇状和随机GD肿瘤中存在的生长模式y轴显示当比较具有至少一个样品的成簇和随机肿瘤的数量时，来自Fisher精确检验的比值比的以2为底的对数值0表示随机GD肿瘤不太可能具有具有所示生长模式的区域点表示估计值，而条表示95%置信区间。国家安全局不显著(J) 集群和随机GD肿瘤的分级。显示了FisherCell Genomics2，100165，2022年8月10日5文章会开放获取在聚集的GD肿瘤中，组合物在空间上共定位，并且在随机GD肿瘤中分布更均匀。来自每组的代表性肿瘤显示在图2D和2E中。然后，我们研究了这两组患者的总生存时间，观察到随机GD模式与患者死亡风险增加显著相关（图2F; p = 0.008，对数秩检验）;当在多变量Cox比例风险回归分析中控制临床病理风险因素时，这种关联是稳健的，并且不依赖于GD截止值（表S3; p =4.41E连续GD的比例风险模型为了验证这一发现，我们对另外52名患者的验证队列进行了MALDI TOF分析（1，016个直径为200mm的额外ROI;图2 G、S3G和S3 H）。确认队列是在所有详细队列分析完成后生成的在该验证队列中，由于死亡事件数量较少，我们关注患者的无进展生存期（PFS），并使用Kaplan-Meier分析检测到GD模式与患者PFS之间与发现队列中相同的趋势（图2H; p = 0.099，对数秩检验）。多变量Cox回归分析进一步显示，在调整已知临床病理风险因素后，随机GD模式与PFS风险增加显著相关，并且不依赖于GD临界值（表S4和S5; p = 0.0038，风险比（95% CI）=1.36（1.10-对总生存期的进一步分析表明，在多变量Cox回归分析中，GD模式也与患者死亡显著相关，即使该队列中的死亡人数较低（表S4和S6; p = 0.017 ，风险比（95% CI）= 1.35（1.05样本协变量与GD模式相关为了进一步了解所观察到的空间模式的病因，我们研究了发现队列中随机GD和样本协变量之间的相关性。随机GD肿瘤患者在吸烟史、辅助治疗类型、肿瘤大小、分期或局部肿瘤或正常样本数量方面无显著差异。然而，来自随机GD肿瘤的区域样品的总数较小（p = 0.012，Wilcoxon检验;图S4此外，随机GD肿瘤较少包含具有腺泡生长模式的样本（p = 0.001，Fisher出在单变量分析中，样本总数、腺泡组织学的存在和等级，仅等级与存活率显著相关（p = 0.03;图S4重要的是，在Cox比例风险模型中，当分级作为附加变量时，GD和生存率之间的相关性仍然显著（p =1.02E-7），而分级不显著（p = 0.94和p = 0.52，2级和3对1级）。这些发现表明GD与肿瘤分级相关，但GD包含与分级编码信息以外的结果相关的额外信息。癌旁正常组织的细胞间异质性最近的一项研究表明，邻近肿瘤的正常组织（NAT）表现出介于正常组织（远离肿瘤）和肿瘤本身之间的转录程序。[28]由于这一观察结果，我们试图量化蛋白质组空间中的细胞间NAT异质性。选择NAT作为距肿瘤0.1- 0.5cm距离内的正常细支气管或正常肺泡组织，并如上所述进行分析。我们没有检测到肿瘤和NAT样品之间在ITH（Pearson r = 0.289，p = 0.0568;图S5 A）和GD（Pearson r = 0.07，p = 0.65;图S5 B）方面的显著相关性此外，NAT GD与总生存期无显著相关性（图S5C）。与GD相关的转录程序我们推测，在MALDI数据中观察到的GD簇集与随机簇集的不同模式可能反映了这些肿瘤中细胞运动的 为了测试这种假说并研究与不同GD模式相关的转录程序，我们对来自发现队列的53个肿瘤进行了批量RNA-seq。我们发现，细胞间粘附相关的途径，如钙粘蛋白结合（NES = -2.16;q = 0.05）、跨膜转运（NES= -2.32; q = 0.04）和细胞外基质基因（NES = -2.27; q = 0.05）是最高富集的基因集，与成簇GD模式相比，在随机GD模式的肿瘤中具有显著较低的表达（图S6 A;表S7）。钙粘蛋白家族基因表达减少与细胞间粘附减少相关，并可促进细胞迁移和侵袭，29这可能导致肿瘤中的随机GD模式（图S6B）。或者，随机GD肿瘤中细胞粘附标志物表达的减少可能反映了这些样品中上皮细胞含量的减少。然而，需要详细的功能研究，以验证细胞-细胞粘附途径基因是否确实与不同的GD模式，并确定这一结果的机制基础，在一个大的样本集。相比之下，随机GD肿瘤显示与免疫应答途径相关的基因表达增加，作为最高调节基因集（图S6C和S6 D;表S7），尽管该发现不具有统计学显著性。由于之前已经证明免疫浸润与原发性肿瘤的患者结局相关，16，30，31我们假设免疫激活可能与随机GD肿瘤的形成有关。为了检验这一假设，我们利用RNA-seq数据通过使用先前应用于NSCLC的特征来估计各种免疫细胞类型的比例32，3331该标记由约60个标记基因组成，其表达水平测量14个免疫细胞群体（参见STAR方法）。不同免疫细胞类型的推断比例与基于相同样品的CyCIF成像的估计值相关（参见下一节;平均Pearson0.95对于不同的免疫细胞;图S7 A）。我们发现，除了中性粒细胞（p = 0.03，Wil- coxon检验）之外，没有免疫浸润与ITH相关（图S7B）。相比之下，CD 8+ T细胞的数量与随机GD肿瘤显著相关（图S7C; p = 0.036，Wilcoxon检验），6Cell Genomics2，100165，2022会开放获取文章EA BCH图3.与蛋白质组空间异质性相关的肿瘤免疫景观(A) 代表性患者活检的HE和免疫荧光的示例图像(B) 代表性组织学区域的HE和免疫荧光的示例图像第一行，HE图像;第二行，免疫荧光图像;第三行，单细胞定量结果;第四行，细胞类型分类结果;显示了200×3200μ m区域，其代表与MALDI数据中相同大小的区域(C) 通过CyCIF分析的所有单细胞中5%的t-SNE图上图显示了所有鉴定细胞的降维结果;对除S100 A11外的所有蛋白质进行t-SNE下图显示了所有鉴定的免疫细胞的降维结果;对免疫标志物CD 45、CD 8A、CD 3D、CD 4、CD 163、FOXP 3、CD 20、CMA 1、CD 11 C、PD 1和GZMB进行t-SNE(D) 关于免疫细胞浸润的肿瘤间和肿瘤内异质性上图：每个肿瘤标本中不同细胞类型的比例下图：每个肿瘤标本中不同免疫细胞类型的比例。（图例接下页）DFG会开放获取文章Cell Genomics2，100165，2022年8月10日7其它浸润性免疫细胞，如B细胞、自然杀伤细胞和调节性T细胞显示出相同的趋势，尽管没有统计学意义。进一步的分析显示，不同免疫细胞类型的比例与患者的总体存活率无关（图S8 A; p >0.05，Cox比例风险模型），表明GD比从大量RNA-seq数据估计的免疫细胞浸润程度更显著地与总体存活相关，即使GD可能部分地由免疫细胞组成驱动。为了表征聚集和随机GD肿瘤中T和B细胞受体的库，我们将RNA-seq免疫分析（RIMA）（https://kateyliu.github.io/RIMA/index.html）管道应用于我们的批量RNA-seq数据。我们发现在量化B细胞体细胞超突变或T和B细胞受体多样性水平的统计学上没有显著差异（p > 0.05，Wilcoxon检验;图S9A和S9 B）。然而，我们发现随机GD肿瘤具有显著更高的B细胞受体读数分数（p = 0.044，Wilcoxon检验;图S9 A），这与我们早期的结果一致，表明随机GD肿瘤中的B细胞浸润水平高于簇集GD肿瘤。随机GD肿瘤中T细胞受体读数的分数高于成簇肿瘤，但差异不显著（图S9B）。总之，这些结果表明，随机GD肿瘤的形成与细胞粘附抑制和免疫浸润增加的组合有关肿瘤细胞组成和微环境相互作用为了进一步表征肿瘤组成和肿瘤与微环境细胞（如浸润免疫细胞、内皮细胞和间充质细胞）之间的空间相互作用，我们使用抗角蛋白、CD45、PCNA、CD8A、CD3D、CD4、KI 67、PD1 、 CD 163 、 CD 11C 、 FOXP 3 、 CD 20 、 VIM 、 CK 7 、GZMB、CMA 1、CD31和S100 A11对来自发现队列的12个肿瘤的作用。我们将切除的、福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤切片，并为每个活检的肿瘤收集成对的相邻切片-一个用于常规HE染色以进行组织病理学分析，一个用于CyCIF（图1B）。重叠成对图像（图3A和3B），基于组织学模式鉴定感兴趣区域，然后基于全细胞荧光强度对CyCIF图像中的相应细胞进行分割和定量（参见STAR方法）。由于S100 A11表达通过CyCIF和MALDI两者测量，我们使用该标志物在正交方法之间进行比较为了基于染色模式鉴定单个细胞类型，我们采用了以下策略：（1）通过角蛋白和CD 45蛋白水平的门控强度分布鉴定上皮细胞和免疫细胞（图S10B和S10 C）;（2）上皮细胞和免疫细胞的复杂性（图S10B和通过使用谱系特异性标志物（例如，CD 8A、CD 3D、CD 4等;图S10通过与所有标志物的表达进行比较，在局部区域评价细胞类型分配，示例见图S11我们观察到在肿瘤之间以及在单个肿瘤的不同区域之间，免疫细胞作为所有保留细胞的分数的百分比的可变性（图3D和S14A）。当研究不同组织学分级区域中的免疫细胞数量时，我们发现免疫浸润程度与分级相关，因此高分级/低分化组织学与较低程度的免疫浸润相关（图S14B和S14 C）;不同组织学区域的示例见图3B。我们还发现，与其他组织学亚型相比，通过PCNA染色测量，鳞屑性肿瘤（低级别且分化良好）的增殖率较低，巨噬细胞丰度较高（p 0.001，Wilcoxon检验;图S14 C和S14 D）。为了研究免疫浸润和ITH的空间模式然后，我们量化了每例患者中各区域的%免疫异质性程度，以确定免疫相关异质性是否与MALDI数据确定的异质性程度相关（参见STAR方法）。我们发现蛋白质组学GD与%免疫GD无显著相关性（Pearson类似地，不同组织学区域中不同免疫细胞类型的比例和细胞总数也与蛋白质组学GD无关（Pearson此外，我们发现蛋白组学GD与肿瘤相互作用免疫细胞的百分比（Pearson然而，蛋白质组学GD和免疫相互作用肿瘤细胞百分比之间存在负相关趋势（Pearson细胞（Pearson细胞相互作用被定义为肿瘤或上皮细胞和免疫细胞具有小于30μ m的物理距离（参见STAR方法）。对于大多数免疫细胞类型，观察到蛋白质组学GD与免疫相互作用肿瘤和上皮细胞的百分比之间的负相关性，并且对于巨噬细胞和T细胞群体最明显（图S14H和S14 I）。这些结果表明，更大比例的肿瘤细胞与免疫细胞的相互作用，在随机比集群GD肿瘤。(E) 蛋白质组学GD与免疫相互作用肿瘤细胞百分比之间的相关性(F) 蛋白质组学GD与肿瘤相互作用内皮细胞百分比之间的相关性(G) 蛋白质组学GD与肿瘤相互作用间充质细胞百分比之间的相关性(H) 具有高频率和低频率肿瘤相互作用内皮细胞和间充质细胞的患者活检的示例。不，免疫细胞;非肿瘤表皮细胞，非肿瘤上皮细胞;肿瘤，肿瘤细胞;内皮，内皮细胞; Mes，间充质细胞; Other，其他细胞。会开放获取文章8Cell Genomics2，100165，2022为了研究肿瘤细胞在更广泛的微环境中的空间排列，我们还进行了类似的分析，以评估肿瘤细胞与内皮细胞和间充质细胞之间的相互作用。我们发现蛋白质组GD与内皮细胞相互作用肿瘤细胞的百分比（Pearson r = 0.16，p = 0.61;图S15 A）或内皮细胞相互作用上皮细胞的百分比（Pearson r =-0.14，p = 0.66;图S15 B）不显著相关类似地，蛋白质组学GD与间充质细胞相互作用肿瘤细胞的百分比（Pearson's r = 0.42，p = 0.18;图S15A）或间充质细胞相互作用上皮细胞的百分比（Pearson's r =0.26，p = 0.42;图S15 B）不显著相关然而，蛋白质组学GD与肿瘤相互作用内皮细胞的百分比（Pearson r = 0.71，p = 0.0099;图3 F）、上皮细胞相互作用内皮细胞的百分比（Pearson r =0.59，p = 0.046;图S15 C）和肿瘤相互作用间充质细胞的百分比（Pearson r = 0.74，p = 0.0059;图3 G和S15 D）显著相关说明这些相互作用的不同肿瘤-免疫景观的代表性实例显示在图3H中。为了进一步研究这些结果，我们检测了间充质细胞、内皮细胞、上皮细胞、肿瘤细胞和免疫细胞在随机GD和成簇GD肿瘤中的比例。如基于RNA-seq数据所预期的，我们发现免疫细胞的比例在随机GD肿瘤中更高，尽管基于我们的CyCIF数据该趋势不显著（p = 0.34，Wil- coxon检验）。相比之下，我们发现，尽管样品数量相对较少，但肿瘤细胞在成簇GD肿瘤中显著富集（p= 0.018;图S15 E）。此外，我们发现，在成簇GD肿瘤中，内皮细胞30mm范围内的肿瘤细胞数量和比例均显著较高（两项比较均为p = 0.005，Wilcoxon检验;图S15F），我们对间充质细胞30mm范围内的肿瘤细胞数量和比例进行了类似观察（p0.02;图S15 G）。这一观察结果表明，观察到的蛋白质组GD与上皮细胞和肿瘤相互作用内皮细胞和间充质细胞百分比之间的对应关系可能是由于表现出不同地理多样性的样本之间肿瘤细胞总体水平的差异。这些发现的一个潜在解释可能是，在随机GD肿瘤中，肿瘤细胞运动性增加这些发现支持了我们的假设，即随机GD模式是由更高的肿瘤细胞运动性引起的。需要更多的数据来验证这一假设。基因组肿瘤内空间异质性为了研究在蛋白质组空间中鉴定的GD模式是否也可以在基因组空间中观察到，我们对来自发现队列中的患者的七个肿瘤的多个切片进行了全基因组单细胞拷贝数分析（图1C）。将每个冷冻肿瘤标本宏观解剖成6至8个切片（图4A和S16），然后进行FACS以分离非整倍体细胞，然后以220 kb分辨率对所述细胞进行单细胞拷贝数分析。总共分析了1，942个单肿瘤细胞，每个患者约300个细胞，每个切片约40个细胞（图4B和S16）。二...使用均匀流形近似和投影（UMAP）的三维可视化证明了单个细胞被患者聚集（图4C），表明来自个体肿瘤的大多数细胞在遗传上彼此之间的相关性大于来自其他肿瘤的细胞。多区域单细胞基因组分析方法使我们能够研究每个肿瘤内个体拷贝数变化的亚克隆分布。有趣的是，我们观察到亚克隆的空间分布的不同模式，如所鉴定的簇所示（图4B、4D、S16和S17A）。在一些肿瘤中，例如来自患者P132630的那些，来自每个切片的单细胞在UMAP（图4D）和聚类分析（图4B）中聚类在一起，显示共享共同祖先谱系的单细胞在有限的空间位置增殖，代表聚类的GD模式。相反，在其他肿瘤中，如P137974，来自不同切片的单细胞在UMAP和聚类分析中共定位（图4D和S16F），表明对运动性的限制可能丧失，导致随机GD模式。这些结果表明，我们在蛋白质组数据中观察到的GD模式也存在于基因组空间。为了研究个体肿瘤样品中肿瘤演变的动力学，我们从单细胞拷贝数数据构建了系统发育树（图S18）。系统发育树的构建使用最小平衡进化树的距离矩阵的基础上分段的log2拷贝数比。将树用所有区段中具有零log2拷贝数比率随机GD样本的系统发育树显示，来自不同切片的肿瘤细胞倾向于在系统发育树的叶中混合，如P132234所示（图S18A）。相比之下，成簇GD样品的系统发生树显示，来自相同切片的肿瘤细胞倾向于在系统发生树上聚集在一起，因为它们具有相似的拷贝数谱，如样品P132630所例示的（图S18B）。其余样品的系统发育树显示在图S18这些结果阐明了使用系统发育重建的个体肿瘤的进化动力学接下来，我们试图量化基因组ITH的程度，并将此数量与已鉴定的蛋白质组异质性模式进行比较。使用拷贝数改变（CNA）的缩放平均细胞间距离23以及亚克隆CNA的比例3测量基因组ITH（参见STAR方法和图4E）。这两个度量彼此一致（Pearson’s r= 0.76，p = 0.048;图S19 A），但证明与从MALDI数据估计的使用基于k最近邻的方法定量基因组GD，该方法测量遗传相似的肿瘤细胞是否存在于相同或不同的肿瘤切片中（参见STAR方法，图4F、S19D和S19 E）。与ITH相反，我们观察到从基因组拷贝数估计的GD与蛋白质组数据之间的临界显著相关性这些结果表明，肿瘤细胞在基因组和非基因组特征方面的空间分布可能具有相似性，而细胞间ITH的程度在基因组和非基因组特征之间的相关性较小。鉴于样本会开放获取文章Cell Genomics2，100165，2022年8月10日9一CDEHF G图4.肺腺癌基因拷贝数的空间异质性(A) 患者P132630冷冻肿瘤标本的大体解剖将每个患者样本切成6至8个切片。(B) 热图显示患者P132630中非整倍体肿瘤细胞的拷贝数谱沿y轴绘制单细胞，并沿x轴以基因组顺序绘制拷贝数改变（CNA）单细胞簇显示在左侧。来自不同区域的单个细胞在左侧进行颜色编码(C) 来自七名患者的非整倍体肿瘤细胞的UMAP图单个细胞由个体患者着色颜色的阴影表示同一肿瘤的不同区域(D) 来自患者P132630的非整倍体肿瘤细胞的UMAP图，该患者表现出聚集性GD模式。来自不同区域的单个细胞被颜色编码。(E) 基因组ITH由缩放的平均细胞间距离（左图）和CNA克隆性（右图）表示。(F) 从单细胞拷贝数数据定量的基因组GD。(G) 蛋白质组学GD和基因组GD之间的相关性。(H) CDKN2A、TP53、EGFR和MET CNA的克隆性在每个肿瘤的宏观解剖区域中的分布。拷贝数增加以红色绘制，拷贝数损失以蓝色绘制。B会开放获取文章10Cell Genomics2，100165，2022虽然目前还没有足够的证据，但需要进一步的研究来验证这些发现在更大的样本量，并进一步评估基因组和蛋白质组GD模式之间的联系。最后，我们研究了从癌症基因普查和TCGA数据库中获得的肺腺癌癌基因的CNA的GD我们发现，在我们的数据中，在所有1，942个单细胞中，癌基因平均在21%的细胞中经历拷贝数增加（对于不同基因为0.4%-我们观察到不同肿瘤中相同癌症基因的不同CNA克隆性模式（图S20B）。有趣的是，一些CNA在相同肿瘤的不同宏观解剖区域中也显示出不同的克隆性，这通过每个切片中具有相应CNA的细胞比例来说明（图4H和S20C）。例如，在患者P132630的切片中，CDKN2A丢失的细胞比例范围为51%至100%，但在患者P137889的所有切片中均为100%。这一观察结果表明，CDKN2A丢失可能在单个肿瘤的某些区域是克隆性的，而在其他区域是亚克隆性的在其他患者中，CDKN2A损失似乎在整个肿瘤中是克隆的（图4H）。还对癌基因和肿瘤抑制因子的几种其他CNA进行了该观察（图4H和S20C）。当研究从发现队列中87例患者的DNA批量测序获得的EGFR和KRAS突变状态是否与肿瘤内空间异质性相关时，我们发现这些基因的突变状态与随机GD肿瘤无关（p = 0.06和p = 0.096，Wilcoxon检验;图S21 C）。总之，我们的结果表明，克隆性不仅在肿瘤之间不同，而且可以显示不同的ITH模式。讨论在本文中，我们提出了一个综合分析的ITH和它的空间组织（GD）在肺腺癌使用多个正交的方法来配置大量的区域或单个细胞从同一肿瘤，同时保留空间背景。为此，我们对来自2个独立组群中的147名患者的约5，000个区域光谱进行了多区域MALDI-TOF分析（图1A），对来自10个独立组群中的超过1000万个细胞进行了CyCIF分析。12个患者活检（图1B），以及来自7个患者的51个切片的约2，000个单细胞的多区域单细胞拷贝数测序（图1C）。当分析和整合这些数据时，我们发现蛋白质组学ITH与生存期无关，而蛋白质组学GD与发现（图2F）和验证（图2H）队列中的患者生存期显著相关在两个队列中，空间聚集的肿瘤与随机分布的肿瘤相比具有更好的临床结局。为了探索这些特征的生物学基础，我们比较了RNA表达、蛋白质组学和成像数据。大量RNA-seq数据显示，与聚集性GD肿瘤患者相比，随机GD肿瘤患者表现出与细胞-细胞粘附途径相关的程序下调。为了确定这些GD模式是否与肿瘤细胞和肿瘤微环境中其他细胞之间的不同空间相互作用模式相关，我们对来自12个肿瘤的1000万个单细胞进行了CyCIF分析。当分析从MALDI数据中识别的空间聚集与随机GD肿瘤的免疫浸润模式时，我们发现通过成像测量的蛋白质组学GD和免疫浸润GD因此，我们得出结论，蛋白质组学GD并不简单地反映免疫细胞浸润的地理多样性。然而，我们发现蛋白质组学GD与肿瘤相互作用的内皮细胞和间充质细胞的百分比呈正相关。我们还观察到，聚集性GD肿瘤的特征在于肿瘤细胞含量增加，并且在聚集性GD肿瘤中，靠近内皮细胞和间充质细胞的肿瘤细胞的数量和比例都较高这些发现与聚集性GD肿瘤中肿瘤细胞运动性降低导致这些样品中间充质细胞和内皮细胞周围肿瘤细胞高密度的可能性一致。因此，我们对来自发现队列的7个肿瘤的多个切片的约2，000个单细胞进行了单细胞全基因组DNA拷贝数分析使用这些数据，我们能够描述CNA的多样性程度，无论是在一个部门内，以及跨部门和患者。我们证明了在蛋白质组数据中观察到的聚集和随机GD模式也存在于基因组空间中。我们还观察到患者内和患者间亚克隆CNA频率的不同模式（图4H），进一步阐明了肺腺癌中基因组异质性的我们已经提出了一个全面的数据集，该数据集说明了单个组织切片中数十个区域的空间肿瘤内蛋白质组异质性的程度，描绘了肿瘤浸润免疫细胞的空间模式，并阐明了肺腺癌中单个肿瘤细胞的空间肿瘤内总之，这些发现表明，肿瘤微环境的细胞组成，甚至在更大程度上，单个肿瘤细胞的基因组异质性，有助于人类肺腺癌的空间多样化。与ITH不同，ITH没有考虑到许多先前研究中报道的分子不同细胞的空间排列，4，34个体生物标志物的组织分析已广泛用于癌症预后，39例如乳腺癌中雌激素受体的表达40和用于免疫治疗的PDL 1的表达我们的研究结果证明了一种新策略的潜力，即评估高阶肿瘤结构特征，如空间ITH。该策略将为组织切片中预后生物标志物的未来发展提供新的见解。该研究我们的研究有一些局限性。虽然我们能够获得大量的空间分辨ROI的蛋白质组学数据，但在公开可用的数据库中，只有一小部分蛋白质是可识别的。每种蛋白质的表征需要大量的后续研究，这超出了本工作的范围。此外，我们没有进行单细胞单核苷酸变体测序，因为TRACERx研究3显示CNA而不是点突变。会开放获取文章Cell Genomics2，100165，2022年8月10日11突变是肺癌的预后因素。此外，我们的MALDI和CyCIF数据不是从肿瘤材料的连续切片中获得的，这通过阻止这两种数据类型之间的直接比较而限制了我们的结论。由于技术原因，我们也没有使用所有可能的肺