双酚附着的微塑料在水和肠道中的归宿及细胞毒性研究

×环境科学与生态技术2（2020）100027原创研究双酚附着的PVC微塑料在水和模拟肠道液体中的结果归宿吴鹏飞a，b，唐媛媛a，*，金航标c，宋媛媛b，刘云松a，Zongwei Caib，**南方科技大学环境科学与工程学院，地表水-地下水污染综合控制国家环境保护重点实验室，深圳市南山区学苑大道1088号， 518055b中国香港特别行政区香港浸会大学化学系环境与生物分析国家重点实验室c浙江工业大学环境学院浙江省工业污染控制微生物技术重点实验室，浙江杭州，310014A R T IC L EIN F O文章历史：接收日期：2020年2月1日接收日期：2020年2020年4月11日接受关键词：微塑料双酚类脱附行为生物可及性细胞毒性A B S T R A C T微塑料和不同双酚的日益流行使得双酚附着的微塑料的存在成为一个关键问题。在这项研究中，进行了实验，以检查污染的微塑料在水生环境和肠道环境中被生物（冷血/温血）摄入后的解吸行为和细胞毒性性能。动力学研究表明，在模拟暖肠条件下，双酚的解吸速率可提高3倍。Freundlich等温线表明双酚在聚氯乙烯（PVC）微塑料的非均质表面上的多层脱附。双酚在水环境中的吸附/脱附存在滞后现象，而在模拟温血生物肠道条件下没有发现吸附/脱附滞后现象。由于生物可及性增强，解吸结果意味着在摄入高剂量双酚后，受污染的PVC微塑料的环境风险可能会显著增加。虽然IC 50不同，但在温血生物肠道条件下释放的五种双酚比在水中释放的双酚对鱼类和人类细胞系的增殖抑制作用更大。这项研究有助于阐明受污染的微塑料的后果和潜在的细胞毒性，以及微塑料作为双酚的关键载体增加潜在健康风险的可能影响。©2020由Elsevier B.V.代表中国环境科学学会出版，哈尔滨中国环境科学研究院技术研究所 这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍由于目前全球范围的暴露几乎不可逆，据报道，塑料垃圾材料满足了地球边界威胁的基本条件[1，2]。塑料可能最终进入并持续存在于水生环境中，然后经历由物理应力、紫外线辐射、温度变化、氧化条件、波浪冲击和生物过程等影响引起的腐蚀、破碎和降解[3]。一旦这些碎片达到小于5 mm的直径，*通讯作者。**通讯作者。电子邮件地址：tangyy@sustech.edu.cn（Y。Tang），zwcai@hkbu.edu.hk（Z.Cai）。通常由国家海洋和大气管理局定义为微塑料[4]。例如，据预测，北太平洋副热带环流[5]内有45 e129千吨塑料碎片漂浮，而大约高达2.55在粤港澳大湾区内的一个内陆水域的地表水中发现了10 4个项目$ m-3的微塑料[6]。这些微塑料将含有较大的比表面积[7]，因此它们可能作为潜在的载体或吸附剂，用于浓缩污染物，如内分泌干扰物（EDCs）[1]，这可能会导致水生生态系统的进一步污染[5，8]。目前，已经讨论了一系列概念框架，用于原始和/或受污染的微塑料的潜在传播效应。例如，微塑料可以通过引起虚假的饱足感而与藻类摄食相互干扰[9]。在https://doi.org/10.1016/j.ese.2020.1000272666-4984/©2020由Elsevier B. V.代表中国环境科学学会、哈尔滨工业大学、中国环境科学研究院发布。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表环境科学与生态技术期刊主页：www.journals.elsevier.com/environmental-science-and-www.example.com2P. Wu等人 /环境科学与生态技术2（2020）100027-¼¼在接触后，在螃蟹的胃中发现了更高营养级的硬质可生物降解微塑料先前的几项研究表明，微塑料和多氯联苯（PCB）之间的关联可能会增加脂质积累和死亡率，从而增加公共卫生影响[11，12]。另一方面，Diepens和Kolemans [13]发现，更多地摄入微塑料可以通过削弱其生物可及性来降低多氯联苯在刺激食物网中的毒性。尽管这些影响仍存在争议，但人们普遍认为，污染微塑料可通过以下两种途径对水生生物产生毒性[14e16]：小微塑料可穿透细胞膜，直接诱导细胞内产生巨大的氧化应激，附着的污染物可从污染微塑料中释放出来，产生进一步的影响。因此，受污染的微塑料的转移和释放行为对于探索它们作为上述毒性的罪魁祸首和/或载体的作用至关重要因此，本研究对污染微塑料的脱附行为和细胞毒性进行了系统的实验研究。解吸可以发生在水生环境中或微塑料被生物体（冷血或温血）摄入后的肠道环境中[15，17]。由于聚氯乙烯（PVC）微塑料沿着水柱广泛分布[6，18，19]，并且是健康儿童健康世界[20]所描述的毒性最大的塑料之一，因此它们被选为本研究中的代表性微塑料此外，双酚（例如，双酚A、双酚AF、双酚B、双酚F和双酚S）广泛用作PVC塑料生产中的增塑剂[3，19]。由于它们被确定为典型的内分泌干扰物，因此双酚被进一步选为我们研究中的代表性污染物双酚可以破坏激素合成并诱导鱼类细胞中的肝应激[21，22]。此外，由于环氧树脂和聚碳酸酯塑料等塑料产品的悠久历史，BPA及其类似物也在人类尿液[23]，血液[24]甚至母乳[25]中发现相对较高的水平（ng$ mL-1）[24，25]。大量文献已经报道了双酚对生物体或人类的毒性[23，26，27]。例如，在暴露于双酚的人红细胞中发现了人细胞中的氧化应激和损伤[23据报道，双酚类似物含有雌激素/抗雄激素效力，其与BPA相似或更大，约为数十或数百纳克/毫升[26，27]。因此，为了进一步评价双酚附着微塑料的细胞毒性，本研究选择了两种模型细胞系（草鱼肝细胞系L 8824;人乳腺癌细胞MCF-7），分别代表冷血和温血生物细胞系，这两种细胞系通常用作肝毒性[28]或雌激素毒性[29]研究本研究首次阐明了双酚A的脱附行为，在不同的情况下，如水和模拟肠道条件下的冷血和温血生物体的双酚附着的PVC微塑料的nol。随后，对L 8824和MCF-7进行了原始微塑料和双酚的细胞毒性试验然后，从吸附的微塑料释放的双酚的潜在影响进行了评估。通过探索污染微塑料的迁移行为和潜在的细胞毒性，这项研究将有助于更好地了解它们作为新兴污染物的来源或载体的作用，这可能有助于填补污染物相关微塑料影响研究的知识空白。2. 材料和方法2.1. 原料PVC微塑料（d5013.2m2; r1.4gcm-3 ）得自Goodfellow Company（Huntington，UK），支持信息（SI）的图S1双酚（包括BPA、BPS、BPF、BPB和BPAF）购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯），相应的辛醇-水分配系数（logDow）列于SI的表S1中。最佳等级的甲醇从Fisher Scienti fic（Pittsburgh，USA）获得。氯化钠（NaCl）为分析级（Aladdin Chemistry Co.，中国上海），碳酸钠（Na2 CO 3）和叠氮化钠（NaN 3）购自Fisher Scienti fic（渥太华，加拿大）。关于这些原材料的其他详细信息，请参见SI的“第1.1节“。2.2.双酚类物质在PVC微塑料中的吸附与脱附首先，根据Wu等人报告的程序检查双酚在PVC微塑料上的吸附[3]。总之，将每种双酚溶解在乙醇中，然后在玻璃瓶（IL）中稀释，初始浓度范围为0至100 mg/L。1.0 mg L-1，代表一般和限制条件[24，30，31]。1.5然后加入100gPVC微塑料，并将容器在室温下以200rpm摇动48小时以达到吸附平衡。每个吸附实验重复进行三次。然后，测量PVC上吸附的BPA、BPAF、BPB、BPF和BPS的量，结果分别为0.19、0.24、0.23、0.16和0.15 mg g-1（如SI的“第1.2节“中所述根据以前研究中报道的方法[17，31]，将每个双酚附着的PVC微塑料的解吸转移到三种不同的条件下，包括水和模拟肠内环境。冷血生物和温血生物（分别简化为“冷- I 00”和“暖- I 0 0 "）的缩写。简而言之，模拟的肠内液体由氯化钠（0.12 M）、碳水化合物钠（0.02 M）和牛磺胆酸钠（15.50 mM）组成，具有不同的pH值和温度[32，33]（冷I：7.5，291 K;温I：6.5，311 K;水生：7.0，291K）。详细描述了用于制备上述三种类型的解吸条件的程序。将用于解吸实验的用Te Reinion螺旋盖密封的玻璃瓶（1L）置于油浴中，以200rpm旋转搅拌，直到达到解吸平衡。对于水系统和冷血系统，温度设定为291 K，对于温血系统，温度设定为311 K。通过在0至75 h的不同时间间隔 解吸等温线获得的双酚附着的PVC微塑料从吸附过程中与初始双酚浓度在0.10 e 1.00 mg $L-1的范围。使用0.45 μ m玻璃微纤维过滤器（Whatman，UK）过滤每个系列的上清液后，根据SI“第1.4节“中描述的方法测量双酚的浓度。在分批实验之前，进行了两个系列的对照实验，其详细参数总结在SI的表S2对照实验的结果表明，在仅存在PVC微塑料的吸附/解吸过程中没有测定双酚，并且在没有微塑料的过程中每种双酚的损失低于3%这么低P. Wu等人 /环境科学与生态技术2（2020）1000273损失，解吸平衡后各浓度的双酚几乎与检测值所有实验均一式三份进行。2.3.细胞培养和细胞毒性测定L 8824 和 MCF-7 细 胞 系 购 自 Wuhan Cell InstitutionalRepository （ Wuhan ， China ） 和 American Type CultureCollection （ ATCC NO. ： HTB-22 ， Manassas ， USA ） 。 将L8824细胞在添加有10%胎牛血清（FCS，四季青，杭州，中国）的最低Eagle培养基（MEM，Sigma，USA）中培养。按照Wei等人[ 34 ]描述的方法，将MCF-7细胞保存在含有10%胎牛血清（FBS，Thermo Fisher Scienti fic，USA）的无酚红Dulbecco改良Eagles培养基（DMEM，ThermoFisherScientific，USA）中。在L 8824和MCF-7的培养物中，青霉素和链霉素的浓度分别为100单位$mL-1和100 mg $mL-1。在291 K（L 8824）和311 K（MCF-7）下，在含有5%CO2的潮湿气氛中进行孵育每隔24 h更新培养基，待细胞接近80%时进行传代培养。通过将两种细胞系接种到96孔板上进行细胞毒性测定将两种细胞在相应的培养基中培养48 h，然后用0.25%胰蛋白酶收获。然后，将每种类型的细胞再次悬浮并转移到新的然后，将上述溶液（0.10mL）接种至各孔中，再孵育24 h。从两个方面考虑和确定细胞毒性试验：原始PVC微塑料和每种双酚类似物。将原始PVC微塑料（量为1.50 g$ L-1）首先在MEM或DMEM中超声处理10 min，然后立即涡旋以获得稳定溶液，然后加入细胞中。将每种双酚以一系列浓度（0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、150.00和200.00mM）溶解在二甲基用于细胞毒性测量。孔中的培养基用PVC微塑料或含系列双酚的培养基替换。将所有暴露的细胞在291 K（对于L 8824）和311 K（对于MCF）下再培养72小时。将在磷酸盐缓冲盐水（PBS，Sigma-Aldrich，USA）中的7. 3-（4，5-二甲基-噻唑-2-基）-2，5-二苯基-溴化四唑（MTT）（10. 00mL，5 g/ L-1）加入到每个孔中。4小时后，除去培养基，并加入DMSO（100 mL）以溶解紫色甲瓒沉淀。最 后 ， 使 用 多 标 记 板 计 数 器 （ VICTOR X3 ， Perki nElmer ，Washington，USA）测定490 nm处的吸光度每个细胞毒性实验重复进行六次。还通过将细胞暴露于不含双酚的含0.5%DMSO的培养基对细胞进行对照研究3. 结果和讨论3.1. 双酚类化合物在微塑料中的迁移行为我们的初步研究发现，可逆过程总是伴随着双酚吸附到PVC微塑料上[3]。进一步研究了双酚在PVC微塑料上的脱附行为，测定了脱附动力学、脱附等温线和吸附/脱附滞后。动力学结果用于说明不同的解吸阶段，而等温线反映了从吸附的微塑料中释放的每种双酚的平衡量。3.1.1. 解吸动力学采用动力学方法研究了在水和模拟温血和冷血生物肠道环境条件下，双酚浓度随解吸时间的变化。图1总结了五种双酚在三种不同环境条件下的解吸动力学，结果表明，双酚的释放在前5小时内大幅增加，然后开始放缓，直到在约35小时达到解吸平衡。基于这些结果，一阶模型（Eqs. S2-S6）来描述双酚的解吸过程，拟合结果总结在表1中。各双酚的快速解吸分数（Frap）在热I环境中最高，表明在温血动物肠液中双酚的解吸率最高。BPA、BPAF和BPB的慢组分（Fslow）在冷I环境中的解吸率最高，表明上述三种双酚在冷血生物肠道环境中的缓慢解吸率最高。同时，在水环境中发现的BPF和BPS的最高F缓慢表明，相对于其他双酚，这些双酚中的每一个的最大部分在水环境中缓慢释放。在非常慢的阶段，与其他两种条件相比，在温暖的I环境中发现Fvs的显著降低。这一现象表明，一定量的吸附双酚可能在很慢的阶段释放，随着热I环境的增强，它们被转移到快速或缓慢的组分中由于Frap值高于其他两个值，对于所有双酚的级分（Fslow和Fvs），快速阶段可以被认为是最关键的过程，应该进一步检查。因此，选择每种双酚的快速速率常数（krap）表1显示了在冷I和热I环境中计算的krap与在水中的k rap之比虽然冷-I/水的比例范围仅为1.01至1.26，观察到相应的暖-I/水的比例的范围更高（2.58至3.28）。每种双酚的krap值在冷I和水中非常接近，表明Fig. 1. 水、冷I和热I条件下的解吸液中五种不同双酚的浓度，代表75 h解吸过程中不同时间双酚从双酚附着的PVC微塑料中的解吸量。水条件：pH 7.0&291 K;冷I条件：pH 7.5&291 K;热I条件：pH 6.5 &311 K。冷-I和暖-I条件分别代表冷血和温血生物的模拟肠液（NaCl 0.12 M、Na2 CO3 0.02 M和C26 H44 NNaO7 S 15.5 mM）。4P. Wu等人 /环境科学与生态技术2（2020）100027FFFFF表1一阶模型拟合水、冷I和群I条件下双酚附着PVC微塑料的双酚解吸结果。在两种环境条件下的解吸速率相似。但从热I与水的krap比值来看，双酚在热I中的解吸速率比在冷I和水环境中的解吸速率提高了约3倍，这可能是由于在较低pH下间隙孔结构的变形所致值和可用的额外能源在较高的对于水中的每种双酚，其相对于热I条件下的相应值更大，这可能是由于水环境中双酚和PVC微塑料之间的亲和力更高[37，38]。也就是说，双酚类物质在PVC微塑料中的脱附程度相对较低在水的条件下。此外，kd（水）>ka的顺序F F温度3.1.2.解吸等温线根据上述动力学结果，在水和冷I条件下观察到类似的解吸行为，而在热I条件下检测到显著差异因此，随后进行等温线研究以比较水和暖I环境。Langmuir和Freundlich解吸等温线模型（Eqs. SI的S7和S8）用于描述解吸后PVC微塑料上的双酚量（q e）与平衡时溶液中的双酚浓度（c e）之间的关系[35]，结果总结见SI的图2和表S3。所有双酚的 Freundlich 模型的相关系数（ R2 ）在水中为0.978 ~0.996，在暖I条件下为0.993 ~ 0.999，这些值高于Langmuir模型的相应值（在水中为0.891 e0.989，在暖I条件下为0.978 e0.997）。Freundlich模型比Langmuir模型更好地拟合实验数据，表明双酚从双酚附着的微塑料中解吸的多层过程，这与我们之前的吸附结果一致[3]。根据Freundlich模型，斜率和截距分别对应于（1/n）和kd。每种双酚的n>1的值表明解吸是非线性的和有利的，这意味着解吸可以随着最初吸附到PVC微塑料上的双酚的量的增加而增强[36]。此外，kd的值（SI的表S3（水）>kd（暖I）也表明滞后可能发生在水条件下而不是暖I条件下。因此，一部分吸附的双酚将不可逆地保留在PVC微塑料在水的条件下。基于这些结果，双酚在这两种环境条件下的解吸途径可能不同，需要进一步研究。3.2.滞后分析吸附/解吸滞后，这是吸附和解吸过程的路线之间的差异的结果，观察到的五个双酚在PVC微塑料在水和热I条件下。表2中总结了从等温线测量获得的参数，以及我们以前研究的吸附数据[3]以及本研究在水和暖I条件下的解吸数据。实验结果表明，在模拟温血生物肠道条件下，各双酚的吸附/脱附无滞后现象，其在温I条件下的kd值均低于其在水中的ka这一现象可进一步解释为双酚在较低pH和较高温度条件下的脱附然而，在水条件下观察到双酚的明显吸附/解吸滞后，表明PVC微塑料对双酚的吸附可能不完全可逆。P. Wu等人 /环境科学与生态技术2（2020）1000275图2. 利用Langmuir和Freundlich模型拟合了五种双酚在水和温I条件下从污染PVC微塑料中的解吸等温线。Freundlich拟合得到的相关系数（0.978e0.996，在水和0.993 e0.999，在暖I条件下）高于Langmuir方程（0.891 e0.989，在水和0.978 e0.997，在暖I条件下），表明Freundlich模型拟合更好。水条件：pH 7.0&291 K。温I条件（pH6.5&311 K）代表温血生物的模拟肠液（NaCl 0.12 M，Na2 CO3 0.02 M，和C26 H44 NNaO7 S 15.5 mM）。表2双酚在PVC微塑料上吸附/脱附的Freundlich模型和滞后分析参数吸附a（水）解吸（水）解吸（温-Ic）FF FΔ HHI是滞后指数。a吸附参数取自Wu等人。3.bka和kd（mg-1/n$ L-1/n$ g-1）分别为吸附和解吸的Freundlich常数n是表面异质性常数。R2是相关系数，F F模型的有效性cWarm-I代表温血生物的模拟肠液滞后结果可分为伪影[39]或真实滞后[40]，伪影主要由吸附质损失和不完全解吸引起。由于降解、挥发和玻璃壁吸附，发生吸附物损失[39]。然而，在我们的情况下，降解不太可能发生，因为NaN3盐被添加到所有的解决方案，以避免任何降解。此外，对照实验表明，所有双酚的质量损失小于3%，这意味着玻璃壁吸附可以忽略不计。此外，在本研究中提供了足够的时间（48 h的吸附和75 h的解吸）达到吸附/解吸平衡的双酚在水的条件下。因此，伪影不太可能是本研究中观察到的滞后现象的主要来源。真正的滞后可能来自两个来源，即吸附剂和吸附剂之间形成不可逆键[38]和吸附剂的固有结构对吸附剂的截留[41，42]。在我们以前的研究中[3]，非共价键（氢键和卤素键）被报道参与双酚吸附到PVC微塑料上，并可能引起吸附/脱附滞后。原始微塑料的比表面积为9.77±0.28 m2$g-1，而解吸后的微塑料的比表面积为8.64 ±0.51（水），11.12± 0.32（warm-I）m2$g-1，表明双酚在水和暖I条件下的解吸行为不同。在水中，双酚可以被捕获在PVC微塑料的致密玻璃状结构中[43，44]，因此在引起不可逆解吸方面起着重要作用。然而，在热I条件下，微塑料的孔隙率越大，双酚的解吸率越高。此外，计算每种双酚的滞后指数（HI）并列于表2中，而滞后回线示于SI的图S2中。结果表明，在水中吸附/脱附过程的HI值按BPS、BPF、BPA、BPB、BPAF的顺序增加。<<<<此外，相关性分析图。图3进一步说明了HI和log D ow数据集之间的良好线性关联（ R21/40.975），显示了kabnbR2bkdbnbR2bHi，kdbnbR2bHi，BPA0.8011.210.9941.0331.5120.9950.2890.3981.2180.997<0BPAF1.4581.140.9931.9331.1550.9940.3260.4651.1540.999<0BPB1.1821.160.9931.5421.2370.9960.3040.4281.1790.999<0BPF0.5751.130.9930.7201.5940.9910.2520.3881.1860.993<0BPS0.5031.150.9950.6021.6490.9710.1970.3411.2070.998<06P. Wu等人 /环境科学与生态技术2（2020）100027¼≤图三. 五种双酚的辛醇-水分配系数（logDow）与在水中吸附/解吸滞后指数（HI）之间的相关性。相关系数为0.975，表明疏水相互作用对双酚从双酚附着的PVC微塑料中的吸附/解吸滞后的关键影响。吸附/脱附滞后与双酚的疏水性呈正相关此外，更疏水的双酚（例如，具有较高logDow值的BPAF和BPB）由于重新填充而更容易被截留在玻璃状PVC微塑料的内部空间中[42]，但这在能量上不利于它们随后解吸到本体水溶液中。然而，疏水性较低的双酚（BPS和BPF）似乎不太可能进入内部聚合物区域，因为PVC微塑料的表面吸附，如Wu等人[3]所报告结果表明，双酚A和双酚F从PVC微塑料中的脱附比其它双酚类的脱附更可逆3.3. pH和温度对双酚类化合物如图4a所示，在pH值低于pKa的溶液中，双酚的解吸从0.070降低到0.080。BPA为0.062 mg$ L-1，BPAF为0.082至0.071 mg$ L-1，BPB为0.070 mg$ L-1， BPF为0.064 ~ 0.059 mg$L-1，0.056mg· L-1。然而，在pH高于BPA（pKa1/49.5）、BPB（pKa1/4 10.1）、BPAF（pKa1/48.2）、BPF（pKa1/4 7.55）、BPS（pKa1/（pKa9.2），解吸量随pH值的进一步升高而略有增加。在较高pH值范围（8.0- 11.0），PVC微塑料与双酚之间产生的电排斥作用使解吸率略有增加。在pH值高于pKa [3]的条件下，大部分双酚会去质子化并以阴离子形式存在，而当pH值高于其pH值时，PVC微塑料表面带负电荷。零点电荷(pHPZC3.41）（图S1（b））。因此，溶液中每种化学品的浓度将通过PVC微塑料和双酚部分离子化的阴离子部分之间的静电排斥而提高。而在pH pKa条件下，双酚主要以分子形式存在，此时电排斥作用不再占主导地位。<然而，溶液中更多的质子将攻击或腐蚀吸附剂的微观结构，导致更大的内部空间[38，42]，导致更多的双酚分子根据填充机制释放[42]。因此，在pH 7.0的溶液中，双酚的数量在较低的pH值下较高。图 4b进一步证明了双酚在不同温度（281，291，301，311 K）的溶液。结果表明，温度越高，脱附量越大，脱附量为0.052e0.0810.058e 0.092，0.055e0.090，0.045e 0.072，和BPA、BPB、BPAF、BPF和BPS的浓度分别为0.041和 0.065mg· L-1双酚解吸随温度升高而增加可以通过化合物的热力学行为来解释[3]。具有极性基团的双酚分子能够与PVC微塑料表面发生静电相互作用。在更高的温度下，平衡将向相反侧移动，导致更多的分子从吸附的微塑料中释放出来。3.4. 双酚型PVC微塑料为了评估双酚附着的微塑料的潜在健康影响，在草鱼肝细胞（L8824）和乳腺癌（MCF-7）细胞系上测试了原始PVC微塑料和双酚的细胞毒性。通过MTT方法测量两种细胞系的相应活力，SI的图5a和图S3中的数据说明了见图4。双酚在不同（a）pH和（b）温度条件下的解吸浓度。解吸实验在291 K下在溶液中进行，以200 rpm搅拌直至达到平衡。五种双酚在PVC塑料上的初始吸附量在0.787~ 1.050 mg·g-1之间。对于不同温度下的解吸实验，溶液pH为7.0。P. Wu等人 /环境科学与生态技术2（2020）1000277图5. （ a）草鱼肝细胞系（L 8824）和乳腺癌细胞（MCF-7）与双酚孵育后的细胞活力。**：p0.01。

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