人和小鼠出生后肺泡形成的单细胞调控图谱

资源人和小鼠图形摘要亮点d人和小鼠出生后肺泡发育d指导肺泡细胞分化的调控模块的构建d机械拉伸信号传导的时间和种间基因调控d疾病风险变体映射到发育细胞类型作者Thu Elizabeth Duong，Yan Wu，Brandon Chin Sos，.，作者：James S.张昆？哈古德对应kzhang@bioeng.ucsd.edu简言之Duong等人在出生后的关键肺泡发育阶段从人类和小鼠肺中产生单细胞染色质可及性概况。他们提出了一个计算模板来表征发育细胞类型，构建调控模块来提出指导标记基因表达的细胞系特异性转录因子，并确定对发病机制至关重要的调控单位。Duong等人，2022，细胞基因组学2，1001082022年3月9日，作者。https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100108会会~开放获取资源人和小鼠出生后肺泡形成的单细胞调控图谱杜伊丽莎白杨，1严武，2布兰登秦索斯，2董伟秀，2西达斯利马耶，2劳莱恩H。里维尔，3格雷格迈尔斯，3詹姆斯S。Hagood，3，4，5和Kun Zhang2，4，5，6，*1美国加州大学圣地亚哥分校呼吸内科儿科，La Jolla，CA 920932美国加州大学圣地亚哥分校生物工程系，La Jolla，CA 920933美国北卡罗来纳州教堂山市北卡罗来纳大学儿科肺科儿科，邮编：275994资深作者5作者贡献相等6引线触点* 通讯地址：https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100108kzhang@bioeng.ucsd.edu总结肺对呼吸空气的反应的子宫外调节应用单细胞转座体超敏位点测序（scTHS-seq）到超过80，000个细胞，我们组装了出生后人类和小鼠肺泡发育的第一个调控图谱我们定义了调控模块并阐明了指导肺泡分隔的新机制见解除了GWAS，我们将肺功能致病变体映射到肌成纤维细胞，并鉴定了与谱系标记物FGF18相关的致病调节单元，证明了染色质可及性数据在揭示疾病机制靶点方面的实用性。我们的调控图谱和分析模型为研究关键发育过程的年龄依赖性和物种特异性控制提供了宝贵的新资源此外，这些资源补充了现有的阿特拉斯努力，以促进我们对人类整个生命周期的肺部健康和疾病的理解。介绍胚胎和儿童期肺发育为肺的最佳生长、功能和对环境的反应奠定了基础。许多成人肺部疾病的起源可以追溯到这些早期过程中的畸变我们目前对驱动人类肺发育的机制的理解是稀疏的，主要源于询问小鼠模型。然而，小鼠出生时在发育的早期阶段就有肺形态学、细胞和分子差异强烈表明，人类肺部发育的独特方面只能通过直接检查人类细胞和组织来了解。1有限的组织获取一直是研究人类肺部的障碍，特别是在肺泡形成期间，这是肺部疾病中最常见的中断过程。2在人类中，临界肺泡的形成主要（90%）发生在出生后的两个阶段。3第一种以肺泡分隔为特征，其将远端球囊细分为由两种上皮细胞类型内衬的肺泡4，5周围的肺泡间充质含有肌成纤维细胞（myofibroblasts，myoFB），其特征在于α平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，ACTA 2），其收缩形成对于肺泡发生至关重要的隔膜脊2，6，7肺泡myoFB的定位已被证明依赖于血小板衍生生长的产生因子亚基A（PDGFA）通过上皮细胞向同源血小板衍生生长因子受体A+（PDGFRA）间充质祖细胞发出信号。8-[11]肺泡形成的第二阶段包括从成熟的隔膜继续分离，其机制尚不清楚。高通量、单细胞（sc）转录组学方法在人类组织概况方面的开发 和 成 功 应 用 的 激 增 人 类 细 胞 图 谱 （ HCA ，www.humancellatlas.org ） ， 12 人 类 生 物 分 子 图 谱 计 划（ HuBMAP ， www.example.com ） 的 合 作 努 力 。hubmapconsortium.org ） 和 肺 分 子 图 谱 计 划 （ LungMAP ，www.lungmap.net）13正在进行中以产生健康的人肺细胞裂解酶。为了加强这些努力，我们利用scTHS-seq14来生成人和小鼠表观遗传图谱，以在出生后肺发育期间贡献关键的调控维度通过优化存档肺组织的解离并在一次运行中处理所有样品，我们捕获了40，427个人和41，476个小鼠皮下可接近的染色质数据集，每个时间点从出生后第一天开始，在四个时间点上具有最小的批次效应。我们组装了一个计算管道来定义关键的细胞状态，构建关键的物种特异性CellGenomics 2，100108，March 9，2022 <$2022作者。1这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。会开放获取资源2Cell Genomics2，100108，2022一B DECFG图1.通过scTHS-seq染色质谱定义的肺细胞类型(A)从存档肺组织中分离单细胞的工作流程概述，scTHS-seq的应用，以及下游从头细胞类型鉴定和调控模块的人类和小鼠图标表示相应的物种。对于年龄对齐，断奶后、青春期前的人与小鼠估计的1人类年等于3.65鼠标天是使用后产后天1.图15（B和C）使用标记基因的启动子区域中的峰和Cicero基因活性评分预测的人（40，427个细胞）和小鼠（41，476个细胞）细胞类型的UMAP基于每个簇中来自不同供体年龄的大多数细胞，将细胞类型进一步注释为早期（第1天）、中期（2个中间时间点）或晚期（最老时间点）。每个点代表一个细胞，灰色簇代表未分类的群体。（图例接下页）Cell Genomics2，100108，2022年3月9日3资源会开放获取调节模块，并定位在肺病致病变体中富集的致病性调节单元深入研究人类生命的第一天，我们开始更好地了解肺部如何对呼吸空气做出反应，并揭示肺泡分隔所必需的调节机制，以及与子宫外呼吸相关的功能。然后，我们在发育和物种中追踪这些调控信号进行比较。这是第一项表征肺泡化最关键时期人类新生儿和儿童“健康"肺组织单细胞中开放染色质的研究，并证明了染色质可及性特征的强度，以揭示关键发育转变的细胞类型特异性调节。结果生后sc开放染色质图谱的构建人类和鼠标肺我们将scTHS-seq应用于在出生后第1天（D1）、14个月（M14）、3岁（Y3）和9岁（Y 9）收集的4个人供体肺，其具有足月妊娠后的出生史并且没有已知的肺病，来自新生儿肺病研究生物储存库（BRINDL），加上在出生后第1、3、10和28天（P1、P3、P10和P28）收获的年龄相关的野生型C57 B1/6小鼠肺（图1A;表S1 A）。使用优化的nu- clear分离方案来处理快速冷冻的人肺活检组织（STAR方法）。为了使潜在的批次效应最小化，如前所述，使用组合索引和文库生成在一个实验中同时处理所有8个样品。14对于每个物种数据集，仅使用具有> 1，500个独特读段的细胞，导致人和小鼠的每个细胞的中值分别为7，542和7，159个独特映射读段。经过额外的质量过滤后，我们的人类肺数据集由40，427个单细胞谱和427，057个可访问峰以及41，476个单细胞组成，其中小鼠有345，486个可访问峰。scTHS-seq定义了预期的和新描述的肺细胞类型应用我们的计算管道（STAR方法），我们鉴定了由11种主要细胞类型组成的20个表观遗传学上不同的人类簇（图1B）和具有10种主要细胞类型的17个小鼠簇（图1C）。最初，基于Cicero连锁基因活性评分（16，其将开放调节区与基因连接并用作基因表达的估计）和癌标志物（上皮- EPCAM、CDH 1;间充质-COL6A 3、PDGFRA ;内皮-PECAM 1;免疫- PTPRC）启动子区中的相应峰来鉴定主要细胞类型为了进一步分类和预测细胞内的细胞类型，我们使用基因活性进行似然比检验以鉴定每个簇的最高差异标记基因（对数倍数差异> 0.09;STAR方法;图1D和1F）。注释的簇代表预期的细胞类型，除了我们标记为人和小鼠中的间充质祖细胞（Mes.Prog、NFIB+、ZEB 2+、DACH 1+、ID3+、EBF1+）上皮-肺泡隔室由气道（AW、ELF 3+、GRHL 2+）、肺泡2型（AT2 、 SFTPA 1+ 、 ABCA 3+ ） 、 肺 泡 I 型 （ AT 1 、 HOPX+ 、PDPN+、AGER+）和标记为AT 1、AT 2的具有AT 1和AT 2信号的簇在基质群中鉴定了基质成纤维细胞（MFB、COL6A3+、PDGFRA+、WNT 2+）、肌成纤维细胞（MyoFB、ACTA 2+）和巨噬细胞（Peri、PDGRB+在人内皮细胞簇（Endo，PECAM1+）中，我们还鉴定了在小鼠中在该分辨率水平下未明显分离的淋巴细胞（Lymph，TBX 1+）两个种属中均存在小免疫（Imm，PTPRC+）簇为了证实我们的细胞类型预测，我们将簇基因活性标志物与LungMAP肺基因表达分析（LGEA）门户网站上可用的人和小鼠分选的批量RNA-seq（图S1 C和S1 D）、公开的scRNA数据（图S2）17-22-我们在人类和小鼠数据集中鉴定的间充质祖细胞在与间充质细胞和干细胞相关的相似基因（NFIB，ZEB 2，DACH 1，ID3和EBF 1）最近发表的工作确定了一种新的表达Ebf1的小鼠成纤维细胞群体。Xie等人还描述了在成年小鼠中观察到的类似于LGEA胚胎第16.5天（E16.5）增殖性间充质祖细胞（PMP）的间充质祖细胞（MP）群体。[26]我们为我们的Mes.Prog簇鉴定了182个人类和499个小鼠差异活性（DA）基因（p值比较成年小鼠MP和E16.5 PMP中的差异表达（DE）基因，存在重叠的基因特征（MP DE基因中152/182个人和415/499个小鼠Mes.Prog DA基因，PMP DE基因中6/182个人和13/499个小鼠Mes.Prog DA基因）（表S3）。总的来说，通过结合标记基因启动子区的峰和基因活性谱的存在，我们对人类和小鼠的预期细胞类型和间充质祖细胞状态进行了分类。人类生命第1天的肺细胞多样性尽管人类和小鼠出生时肺处于不同的发育阶段（肺泡与囊状），但这两个物种都能够在子宫外成功进行气体交换。为了更好地了解这些生物学途径中涉及的细胞类型和过渡状态，我们进一步分析了人类生命第1天的上皮和间充质簇，并将活性基因与发育相关的生物学过程和疾病联系起来。D1细胞的迭代聚类提高了下游调控分析我们收集了图1B中属于注释细胞类型的所有D1细胞，并进行迭代聚类以生成更高分辨率的UMAP嵌入（图S3A）。差异基因活性谱用于预测细胞类型（图S3B）。（D和F）每种细胞类型中所选基因的对数归一化基因活性评分的点图每个点的大小对应于该细胞类型中具有非零基因活性的细胞的百分比，而颜色对应于平均基因活性。（E和G）来自人和小鼠肺发育时间点的细胞类型贡献，捕获为总细胞的比率。另见图S1和S2以及表S1和S2。4Cell Genomics2，100108，2022会开放获取资源~还完成了D1的相应LGEA scRNA-seq的独立分析（图S4 D和S4E）。为了提供对细胞类型特异性调节的了解，我们应用ChromVAR来鉴定每个簇的差异TF活性（STAR方法;图S3C）。27，28每种细胞类型的几种顶级TF与先前的描述一致，例如纤毛细胞的调节因子X（RFX），29，30肺泡上皮细胞的NK 2同源框 1 （ NKX 2 -1 ） ， 31 ， 32 肌成纤维细胞的血 清 应 答 因 子（SRF），33内皮细胞的Ets变体2（ETV 2），34和骨髓和淋巴谱系的Spi-1原癌基因（SPI 1），35以及先前未描述的细胞类型特异性TF。对小鼠P1完成的相同分析也改善了细胞类型分辨率（图S5）。远端肺泡祖细胞和上皮细胞的特征我们在D1时鉴定了两种上皮祖细胞状态：Alv.Prog和AT 1.AT2。AXIN2 +Alv.Prog细胞含有与NAV 2相关的调节元件，其在细胞生长和迁移中起作用，以及FZD 2，其是支气管肺泡干细胞的受体，在干细胞维持和分化中起作用（图S3 B）。36、37Fzd2表达见于E18.5时来自小鼠远端上皮Axin2和Fzd2都可以抑制WNT途径，促进肺上皮细胞中的祖细胞样状态并阻止分化。在AT1和AT2基因（PDPN和MUC1）和特征基因（EGFR和SHH）（图S3 B）上具有活性的36、39、40个AT1.AT2细胞被定义为E18.5和P1时AT1和AT2细胞的中间体或双能祖细胞。我们的分析另外证明了在LIMD1、KRT8、KRT19和CLDN4附近AT1.AT2细胞的显著高活性（图2A和2B）。LIMD1的表达可能与出生时肺部快速适应充气呼吸和周期性拉伸有关，因为LimD1是张力依赖性途径的一部分，该途径限制了需要细胞增殖的Hippo活性。42免疫荧光染色证明在第1天在三个供体中的AT1.AT2细胞中LIMD 1与SFTPC和AGER共染色，包括收集scTHS-seq数据的供体1（图2C）。在Y3供体中存在较少的三重阳性细胞，并且在成年供体中未观察到三重阳性细胞（图2C和S3D）。Wang等人snRNA-seq数据集中，在约30周胎龄和约3岁供体的D1时在AT 1/AT 2样细胞中观察到LIMD 1基因表达（图2D）。Limd1基因活性也存在于小鼠AT1.AT2细胞中，在肺泡分隔期间，从P3开始，在P10达到峰值（图S5 D）。 通过放大D1时的上皮区室，我们发现了与可能刺激AT 1细胞分化的生物力学途径相关的LIMD1 + AT 1.AT 2细胞状态。动态AT 1细胞调节AT 1细胞分为两个亚群（AT 1_1和AT 1_2）（图2A）;基因组区域富集注释工具（GREAT）43分析表明AT 1_1的生长状态（上皮细胞分化中的形态发生和胰岛素受体信号传导），而AT 1_2细胞表现出更成熟的特征（内膜组织）（图2E）。AT 1簇在典型标志物PDPN附近以及更现代的标志物：RTKN 2、VEGFA、GPRC 5A和MYRF附近有活性（图2F）。5、18、38、44两者AT1细胞的状态与细胞极性的建立和PDGFR信号通路的调节顶端-基底极性在细胞命运决定中起作用，肺上皮细胞的分化。45AT1_2对EGFR/ERBB信号的负调节作用可能影响AT1.AT2细胞的定向分化，因为EGFR/ERBB信号可诱导AT 2更新。 20 ， 41AT1_2细胞与细胞连接组装和细胞外基质（ECM）肌动蛋白相互作用在功能上增强肺泡上皮屏障。四十六、四十七AT1调控模块的构建为了确定控制出生后AT1从AT1.AT2细胞分化和AT1增殖的机制，我们通过比对细胞类型特异性TF和富含活性峰的TF基序（与表达的标记基因连接的调控区）构建了调控模块（图3A）。首先，对人D1 AT1、AT2和AT1簇的荧光ChromVAR TF活性进行检查，确定KLF、NKX2和TEAD为顶级谱系定义TF候选物（图3 B和S3 C）。这些TF的表达见于出生时的早产（30周孕龄）人供体中（图3C）。接下来，我们定位了在与细胞类型定义基因相关的差异可及（DA）区域中过度表达的TF基序（STAR方法;表S4）。基序富集分析表明TF与基因特异性调控元件结合靶基因表达的定向调节（激活或抑制）基于来自相似年龄的BRINDL供体的sc或单核（sn）RNA-seq推断（图3E）。21-24在图3D中，我们检查了与富含KLF4、NKX2和TEADTF基序的DA基因相关的可及区域。AT1、AT2基因LIMD1、KRT8和EGFR的调控峰在KLF4基序中富集 NKX2基序富集存在于AT 1标记物（GPRC 5A、CLDN18和LMO 7）、顶基底极性基因（LAMA 3、PATJ和PRKCZ）、一般上皮标记物KRT7和TEAD 1中。AT1_2 DA基因WWC2、LMO7和MYRF在TEAD基序中富集通过比对细胞类型特异性TF和在细胞类型标记基因的活性峰中富集TF结合基序，我们构建了控制D1时AT 1分化的调控模块（图3F）。NKX 2TF可能在人AT 1细胞分化中发挥作用，这得到了最近在小鼠中的研究结果的支持，这些研究表明Nkx 2 -1对于AT 1细胞的启动、发育和维持是必需的。 31 ， 48AT1_1细胞含有富含NKX2基序的开放TEAD 1峰，表明NKX2结合可触发TFTEAD 1的表达（图3D）。TEAD 1在LGEA D1时由AT 1细胞表达（图3E）。跨膜TEAD 1可接近性和表达可能允许TEAD结合到AT 1可接近性元件，如MYRF。MYRF是一种新的、潜在的成人和小鼠AT 1细胞的主调节因子。18小鼠AT1细胞在P1时显示出相似的Nkx2和TeadTF活性（图S5C）。通过使用scTHS-seq和sc/sn-基因表达组装调控模块，我们形成了新的发育机制假说，涉及KLF 4指导的LIMD 1+KRT 8+AT 1前体的分化和TEAD指导的AT1细胞成熟以及支持NKX 2指导的肺泡上皮细胞分化。对所有时间点的人AT 1簇的评价显示，与较早时间点相比，AT1晚期细胞显示出不同的TF活性;在较晚的小鼠AT 1细胞中未观察到这种变化（图S6A和S6 B）。TEADTF活性在两个物种中再次对AT1簇更具特异性与人类AT 1.late clusters不同，在JunCell Genomics2，100108，2022年3月9日5C资源会开放获取一BEF图2.表征D1肺泡上皮细胞状态(A) 注释的D1肺泡上皮簇的UMAP。(B) 显著的AT1.AT2细胞差异可及基因的基因活性水平的小提琴图。(C) D1、Y3和来自不同供体的成人肺中人肺泡区域的免疫荧光LIMD 1、AGER和SFTPC染色白色箭头表示三重阳性AT1.AT2细胞。黄色箭头表示AT 1细胞中的AGER和LIMD1scTHS-seq数据收集自每个年龄组中的供体1，除了成人样品。每个图像的左下角列出了比例尺单位。另见图S3D。(D) AT 1/AT 2样细胞中AT 1.AT 2标记基因表达的点图，来自Wang et al.snRNA-seq按供体年龄、~30周胎龄和3和31岁(E) 基于-log10（二项式p值）43的前2k差分峰的D1 AT 1簇的GREAT显著GO生物过程。(F) 肺泡上皮细胞簇中AT 1标记基因的基因活性评分点图。另见图S3和表S4。原癌基因（JUN）、Fos原癌基因（FOS）和核因子红细胞2（NFE 2）。Jun在维持肺泡内环境稳定中起着关键作用，Jun的缺失会导致肺部炎症和肺气肿。49，50NFE 2与肺宿主反应和抗氧化应激的细胞保护有关。51通过确认AT 1群体中适当TF和相应可用结合位点的可用性，实现了对推断的AT 1在人类时间点的调节的验证。在图S6C中，使用TF基因活性评分确定TF的时间可用性。调节区域的对齐使用ReMAP 2018中针对各种人类细胞系的策展ChIP-seq分析，在AT 1标记基因GPRC 5A和MYRF的转录起始位点（TSS）附近检查了具有NKX 2 -1、TEAD 1和JUN结合位点的AT 1簇（图S6C）。52远端GPRC 5A元件仅含有早期和中期AT 1细胞的可接近峰以及NKX 2 -1和TEAD 1的ChIP-seq峰。在AT1.late簇中，一个占主导地位的可访问元素与丰富的JUNChIP-seq峰重叠。TF跨发育时间点的分析表明，TF的可及性和直接AT1细胞的结合的同步模式D6Cell Genomics2，100108，2022会开放获取资源一BDE图3.识别肺泡分隔期间驱动AT 1分化的D1调节模块(A) 涉及I.确定候选工作队，以及II.与活性细胞类型标记基因相关的峰的基序富集分析。(B) 来自图S3A的UMAP用关键肺泡上皮TF的TF活性水平重新着色。(C) TF基因表达调节AT 1细胞分化的点图，Wang et al.在~30周龄1天大（~30周龄D1）供体中通过细胞类型的snRNA-seq(D) 具有KLF 4、NKX 2和TEAD基序富集的所选活性基因（AT 1、AT 2或AT 1细胞中与基因和SE相关的>1个峰）的-log10（p值）条形图(E) LGEA D1 scRNA-seq数据集中活性AT 1基因表达的点图。(F) D1 AT1.AT2和AT1细胞的拟议调控模块矩形中的所有标记基因含有富集KLF4、NKX2或TEAD基序的峰红色列出的基因在LGEA D1 AT1细胞中表达。+存在于AT 1/AT 2样细胞中的基因表达。参见图2D。另见表S4。FC会开放获取资源Cell Genomics2，100108，2022年3月9日7~A图4. 肺泡myoFB调节单位富含肺功能致病变异体(A) 来自LGEA Lung Imaging的D1、M14和Y3时人肺肺泡薄壁组织中NKX 2 -1、KI 67、ACTA 2、FN 1和ABCA 3的蛋白荧光免疫染色箭头表示中隔嵴处的ACTA 2+染色。从每个年龄组的供体1收集的scTHS-seq数据。(B) 预 测 疾 病 中 的 细 胞 类 型 靶 点 使 用gChromVAR，富集scTHS-seq人肺簇中各种肺性状和疾病的GWAS致病黑点表示Z分数> 3.1的显著富集。(C)显示独特MyoFB的基因组浏览器图。早期调控区重叠识别出高因果概率肺功能风险单位和最近的基因FGF18。(D) scTHS-seq人基质细胞中FGF 18基因活性和my-oFB 中 基 因 表 达 的 点 图 ， 来 自 Wang et al.snRNA-seq.另见表S5。肌成纤维细胞及其调控的如图1 E和1G所示，在所有时间点捕获的98%（949/971）的人my-oFB来自D1;然而，63%（1，488/2，358）的小鼠myoFB来自P10。来自P10的myoFB贡献的显著增加（与来自P1和P3的约15%相比）可能反映了在小鼠肺泡分隔峰值期间（P4至P12）所需的myoFB激增。随后在P28时myoFB降低至6%（146/2，358）与先前的谱系追踪2，53和scRNA-seq研究一致。[54]在人类中，估计肺泡分隔发生在妊娠36周至3岁之间。通过来自相似年龄的BRINDL健康肺供体的scTHS-seq和LGEA蛋白荧光免疫染色捕获的ACTA 2+myoFB证实了在D1时在中隔脊处存在myoFB，在M14和Y3时在该位置检测到较少myoFB（图4A）。24使用我们的组织处理方案通过scTHS-seq捕获的出生后细胞组成表明在人和鼠肺泡分隔期间myoFB的类似肺泡myoFB调节单位在肺功能致病变异体中富集通过结合肺性状的因果变异和我们的scTHS-seq数据，我们将致病风险追溯到特定的发育肺细胞类型和调控单元。肺部疾病的精细映射的致病变异体从CAUSALDb获得，CAUSALDb是一种鸡-统一处理的GWAS汇总统计数据库，55以及来自UK Biobank和SpiroMeta Con的一项关于肺功能的大型GWAS研究。56我们使用两个特征，FEV 1（1秒用力呼气量）和FEV 1/FVC比值（FVC，用力肺活量），这两个指标都是阻塞性肺疾病的标志物，来评估肺功能。在图4B中，我们将g-chromVAR57应用于计算来自图1B的20种表征的人细胞类型的调节区中的致病变体的富集早期myoFB富含与FEV 1和FEV 1/FVC相关的致病变异体（Z评分> 3.1）。此外，肺功能单核苷酸多态性（SNP）与可接近峰重叠的评价显示，在5号染色体（chr 5：171，474，530-171，474，621）中MyoFB.早期FVC与因果概率（图4C和表S5）。与该肺功能调节风险单元最近的基因是位于下游15kb的成纤维细胞生长因子18（FGF 18）。Fgf18标记肺泡分隔期间的myoFB，53和成人小气道myoFB与慢性阻塞性肺疾病的肺功能降低相关。在约30周的人肺供体中，FGF18的58个MyoFB表达对应于活性FGF18调节区（图4D）。肺部疾病致病变异的富集肺泡上皮细胞信号转导和肌成纤维细胞的构建监管模块为了进一步探索myoFB在肺泡分隔期间的作用，我们鉴定了在D1具有myoFB特征的两个间充质簇（myoFB_1，myoFB_2）（图5A和S3A）。myoFB_1簇表现出PDGFRA的最高基因活性，myoFB_2簇表现出ACTA 2的最高基因活性（图5B）。在小鼠中BCD会开放获取资源8Cell Genomics2，100108，2022一BCDEFG图5.探索D1时的肌成纤维细胞状态和引导肺泡分隔的上皮-间充质调节模块(A) 注释的D1AT1.AT2、AT1和myoFB簇的UMAP。(B) PDGFA和选择的myoFB DA基因的对数归一化基因活性评分的点图(C) 来自图S3A的UMAP用关键myoFB TF的TF活性水平重新着色。(D) 具有显著NFATC、MEF 2和SRF基序富集的myoFB_1或myoFB_2细胞中所选活性基因的-log10(E) Wang et al.根据BRINDL供体年龄、~30周胎龄、3岁和31岁分组的myoFB的snRNA-seq中TF基因表达的点图。(F) Wang et al. snRNA-seq中活性基因表达的点图，按供体年龄分组。(G) D1 PDGFA的拟议调控模块：PDGFRA信号传导和myoFB分化。矩形中的所有标记基因含有富含TF基序的峰，并且在Wang等人的sn RNA-seq中在约30周D1时在AT 1或myoFB簇中表达。另见表S4。当肺泡发生开始时，Pdgfra+祖细胞产生Acta2+肺泡myoFB。2，7，59，60PDGFRA+人myoFB_1可能是myoFB祖细胞或中间体，这在前面已经描述过。61-MyoFB_2显示出额外的肌球蛋白重链11（MYH11）和肌心蛋白（MYOCD）基因活性以及SRFTF活性（图5C和S3C）。MyoFB_1与IGF_1接近，IGF_1刺激肺成纤维细胞增殖和分化为MyoFB。在myoFB_1簇中，差异TF分析揭示了参与肌肉发育、细胞生长和ECM重塑的肌细胞增强因子2A（MEF2A）的最高活性（图5C和S3C）。66PDGFRA配体PDGFA在D1时在AT1和AT1.AT2簇中可接近（图5B）。在小鼠发育中，PdgfamRNA在P1和P7，9时激增，并且sc表达在E18.5时存在于AT 1/AT 2、 AT 1和AT 2细胞在D1时对肺泡上皮细胞和myoFB细胞中的PDGFA-和PDGFRA-特异性调节区的评估分别揭示了显著的细胞类型特异性TF活性和KLF 4（图3B和3D）和活化T细胞核因子（NFATC）结合基序（图5C和5D）的富集。Nfat是控制myoFB分化和收缩的信号网络中的关键成员;平滑肌中的67 -69 Acta 2表达需要Nfat和Srf之间的协同相互作用。69我们的分析表明，KLF4与PDGFA调节因子结合，AT1、AT2和AT1细胞中激活PDGFA表达的区域（图3D、5F和5G）。在间充质中，NFATC调节myoFB祖细胞中的PDGFRA表达基序富集会开放获取资源Cell Genomics2，100108，2022年3月9日9图6.发散Piezo2机械传导信令在成纤维在产后天1和跨发育（A-D）PIEZO2基因活性和D1和P1时的表达。所有D1（A）和P1（C）细胞类型的对数归一化基因活性来自LGEA scRNA-seq数据库的D1（B）和P1（D）肺的平均表达量（单位：每百万转录本（连接的高度表示连接的峰之间的Cicero共可及性得分。(G) 按年龄分组的所有人基质成纤维细胞的PIEZO 2（图例接下页）会开放获取资源10Cell Genomics2，100108，2022对与两种D1 myoFB状态的靶基因连接的调节区的分析鉴定了在LTBPI和MYLK调节元件中过度表达的MEF2基序以及在ACTA 2和MYH 11峰中的SRF基序（图5D），这表明调节模块首先涉及MEF2激活LTBPI转录、TGFB途径刺激和随后SRF与可接近的ACTA 2区结合，从而驱动myoFB细胞身份的表达和建立（图5G）。通过对D1人群中PDGFA-PDGFRA受体-配体活性和肌成纤维细胞的研究，我们组装了上皮-间充质通讯和肌成纤维细胞分化的调控模块，这些模块可能指导关键的肺泡隔嵴形成。人基质细胞中的发散性机械传导信号细胞PIEZO 2，一种将物理应激转化为细胞通讯的化学信号的机械活化通道，70 - 72是人D1 MFB_1中最重要的DA基因（图6A），在相应的基质FB-1中具有LGEA SE（图6 B）。在小鼠中，在P1内皮细胞中观察到最高的平均Piezo2基因活性（图6C），这与LGEA P1 sc数据无关（图6D）。连接图直观地总结了远端调节元件和连接至PIEZO 2的启动子之间的Cicero共可及性评分（共可及性截止值= 0.25）（图6E）。对于P1，捕获的顺式调节元件较少（共可及性截止值= 0.1，表明连接的置信度较低）（图6F）。 随着发育时间点的变化，PIEZO 2可及性在D1达到峰值，并随时间推移在人体内减弱（图6 G），与LGEA sc和散装RNA结果（图S7 A和S7B）和蛋白质免疫染色（图6 H和S7 C）一致。 在小鼠内皮和FB群体中，含有活性区域、基因活性和大量RNA表达的细胞百分比在各时间点保持较低（图S7 D和S7 E）。人D1 MFB的特征在于PIEZO 2可及性和表达，这在小鼠中不类似地存在。为了阐明PIEZO 2表达的调节，差异TF活性分析显示，在D1时MFB_1中的大多数顶级TF来自参与胎儿发育的碱性螺旋-环-螺旋-拉链（bHLH-ZIP）TF的不同家族。有趣的是，最先鉴定的活性TF是无毛鳞片家族bHLH TF 2（ASCL2），一种罕见上皮细胞、化学传感簇或刷状细胞的标记基因（图S3C）。属于bHLHTF家族的110个TF中的40个在MFB_1中具有显著活性（p值0.01，平均logFC> 0.69，表S4B）。PIEZO 2调控区的基序富集分析未发现显著的ASCL 2富集，然而，MFB_1中40个活性bHLH TF基序中的7个在PIEZO 2调控元件中富集（p值0.05），其中7个基序中的一个是NHLH2。在图S7F中，在所有人基质簇中，NHLH2TF活性随着年龄的增长而降低MFB_1标记显示出显著的基因活性，在图6I、6J和S7G中描绘了具有NHLH2结合基序富集的表达总之，PIEZO 2被鉴定为人D1时基质FB亚型的新型标记基因，其表达可能受bHLH TF调节，并且Piezo 2在所有采样时间点的小鼠基质FB中均无活性，表明拉伸的早期发育反应途径存在物种特异性差异。讨论为了为人类和小鼠出生后肺发育的综合sc调控图谱奠定基础，我们提供了约80，000个单细胞的高质量数据，表征了存在的细胞类型，并揭示了在肺泡分隔期间驱动细胞分化和跨室相互作用的新机制见解。鉴定的注释scTHS-seq细胞类型是预期的，但我们还描述了人和小鼠中共享相同特征基因活性谱（NFIB、ZEB 2、DACH 1、ID 3和EBF 1）的大型间充质祖细胞样群体这并不令人惊讶，因为我们对间充质细胞类型的理解还远未完成。Nfib控制妊娠晚期上皮细胞和间充质细胞分化。76Zeb2参与维持干性。77Id3调节干细胞的多能性，并在小鼠胚胎发生期间在肺间充质中表达。78，79两项研究在小鼠中鉴定了Ebf1+Liu等人还在来自健康成人和M21供体的LGEA人scRNA-seq数据集中鉴定了同源EBF1+间充质群体。80我们的Mes.Prog集群可能代表类似的祖先状态。为了更好地对这些人群进行分类，需要进一步的研究在Dl时的上皮和间充质区室内，scTHS-seq允许表征LGEA数据集中scRNA-seq未捕获的上皮和间充质亚型，例如对于AT 1细胞和肌成纤维细胞所见的那些（图S3）。AT1.AT2KRT 8、KRT 19和CLDN 4基因活性与损伤后小鼠AT 1移行细胞状态中鉴定的关键基因重叠;81我们发现了对肺泡分隔至关重要的调控模块，包括AT 1和myoFB细胞分化，AT 1与myoFB配体-受体相互作用和机械转导信号。在肺泡上皮细胞分化过程中，基因和TF活性与Hippo信号的联系对于中间型AT 1、AT 2和AT 1细胞是值得注意的。Hippo通路调节器官大小、机械传导和细胞向空气呼吸的转变。Hippo激酶LATS 1/2需要Limd 1用于张力依赖性粘附连接定位。高张力和低细胞密度导致Limd 1介导的LATS 1/2的募集和抑制，然后使YAP/TAZ与TEAD复合。42 LIMD 1的基因可及性和表达(H) D1、Y3和来自不同供体的成人肺中人肺泡区域中PIEZO 2和ACTA 2的免疫荧光染色scTHS-seq数据收集自每个年龄组中的供体1，除了成人样品。每个图像的左下角列出了比例尺单位。另见图S7C。(I) LGEA D1 scRNA-seq数据集中活性基因平均表达的点图。(J) D1 MFB_1的拟定监管模块矩形中的所有标记基因含有富含NHLH2基序的峰，并且在LGEA D1人中以MatrixFB 1簇表达另见图S7和表S4。会开放获取资源Cell Genomics2，100108，2022年3月9日11图7.在D1时肺泡分隔期间AT 1和myoFB细胞的拟议调节出生后的调节机制假设的示意性总结（A）AT 1分化和（B）AT 1和myoFB细胞-细胞通讯，从scTHS-seq基因和TF活性、基序富集和可用的sc/ snRNA-seq数据集的分析推断。AT 2细胞中的TEAD TF活性（图2）和AT 1细胞中的TEADTF活性（连同先前的TEAD基因表达和AT 1基因调控区中的ChIP-seq结合位点）（图3和S6）建立了出生时来自充气拉伸的生理变化与通过Hippo途径失活 在手册修订期间，应用遗传小鼠模型48、86、87和人2D原代培养模型88的最新出版物进一步支持Yap/Taz和Tead在AT 1细胞发育中的作用。尽管AT1细胞在气体交换和肺部疾病中起重要作用，但AT1细胞的我们提出了一种新的牵张诱导的途径，其向人AT1.AT2细胞发出信号以分化成AT1细胞和TEAD，TEAD作为参与AT1谱系特异性成熟的伴随TF家族（图7A）。小鼠条件性基因敲除研究表明，TAZ对肺泡形成至关重要，而YAP对气道形态发生至关重要;89因此，Hippo信号转导的失活可能使TAZ与TEAD复合。LIMD1连接的差异峰和重建的TEAD基因可及性模块鉴定了潜在的细胞类型特异性拉伸敏感性基因增强子，其随年龄变化，需要进一步评估（图3）。AT1.AT2细胞的显著KLFTF活性和富含与LIMD1连接的KLF 4TF基序的调节区（图图7中的假设包括KLF4与AT 1中可接近的染 色 质 的 结 合 。 AT2 和 AT1 细 胞 激 活PDGFA信号传导。在Klf 4缺失的肺中，结缔组织-在隔端肌纤维母细胞中不表达细胞凋亡相关基因和肌动蛋白。在间充质中，来自空气膨胀的机械拉伸可能发出NFATC4结合的信号，以驱动PDGFRA表达，促进myoFB分化。机械反应和上皮信号传导的协调可能指导肌纤维母细胞的正确定位以进行分隔。应用scRNA-seq和原位杂交，一项新发表的研究支持AT 1细胞和myoFB在P3和P7的空间相互作用;发现该AT 1信号传导节点在人肺中是保守的，2个月Zepp等人还假设Klf和TeadTF在P3时利用scATAC-seq参与AT 1细胞发育和间充质该小组将PDGFRA+暂时性次级嵴肌成纤维细胞（SCMF）描述为仅在出生后早期肺泡分隔期间存在的功能特化的施力谱系，这与我们的结果一致SCMF可能类似于D1myoFB_1，并可能解释在人类和小鼠肺泡发生期间捕获的肌成纤维细胞的较高比例我们发现myoFB中富集的离散肺功能调节风险单位（图4）进一步强调了更好地描述上皮-间充质相互作用的重要性，因为异常肌成纤维细胞可能导致异常肺泡分隔和肺生长，随后肺功能降低。图3B和3D）表明KLF4结合刺激LIMD1表达的开放增强子K