测定劳拉西泮的反相流动注射分光光度法及其与批处理法的比较

埃及基础与应用科学杂志5（2018）151完整文章分批和反向流动注射分光光度法Maryam Jamal，HindHadi巴格达大学理学院化学系，伊拉克巴格达，Al-Jaderia阿提奇莱因福奥文章历史记录：2017年11月7日收到收到修订版，2018年4月24日接受，2018年2018年5月12日在线提供关键词：劳拉西泮分光光度法反向流动注射分析A B S T R A C T建立了测定劳拉西泮（LOR）的反相流动注射分光光度法，并与批处理法进行了比较。该方法是基于LOR与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐（MBTH）在氯化铁存在下在水介质中的反应。在kmax659 nm处测量水溶性绿色产物。在最佳条件下，线性范围分别为2 ~ 40和25 ~ 400m g/mL，检出限分别为0.61和2.29m g/mL。考察了与逆流系统有关的理化参数，并成功地将两种方法应用于该制剂这些方法简单、高通量，可用于LOR的药物分析。©2018 曼 苏 拉 大 学 。 由 爱 思 唯 尔 公 司 制 作 和 主 持 这 是 一 篇 基 于 CC BY-NC-ND 许 可 证 的 开 放 获 取 文 章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍劳拉西泮（7-氯-5-（2-氯苯基）-3-羟基-2，3-二氢-1H-1，4-苯并-二氮卓-2-酮）是一种苯并二氮卓类药物，适用于治疗焦虑症和术前镇静[1]。LOR的化学式为C15H10Cl2N2O2（图1）. ①的人。由于其镇静和抗惊厥特性，其应用于广泛的适应症和患者类别。在儿科，它用于癫痫持续状态儿童和插管和机械通气患者[2]。劳拉西泮价格便宜，作用时间长（长达72小时）[3]，癫痫复发的风险较小。劳拉西泮的有效期为3年，可静脉（IV）、肌内（IM）和鼻内（IN）给药[4]。先前使用电位测定法和多波长分光光度法[5]、高效液相色谱法（HPLC）[6-在可用于痕量分析的各种方法中，FI分析方法提供了对不同化学品和药物形式的痕量的快速、简单和廉价的分析[14]。文献报道*通讯作者。电子邮件地址：hindhadi13@yahoo.com（H. 哈迪）。只有少数几种FIA方法[15，16]可用于测定LOR，其中一种[15]没有特异性，仅选择UV区域中的一个波长用于LOR的分光光度检测。到目前为止，文献中还没有包含用于测定纯的或剂型的LOR的逆流注射-分光光度法。本研究描述了快速和简单的批量和反向流动注射法作为一种直接的方法，利用比色反应测定药物制剂中的LOR2. 实验2.1. 装置Shimadzu UV-VIS 260型数字双光束分光光度计使用1 cm路径长度的石英流动匹配池（Cecil，50μ L内部体积）进行吸光度测量，对于分批法的吸光度测量，使用匹配的1 cm二氧化硅池。用于泵送试剂溶液的六通道蠕动泵（Ismatec，Analytic，CH-8152型 ， Glatbrugg ， 瑞 士 ） 。 将 具 有 不 同 回 路 的 6 通 进 样 阀（Rheodyne，Altex 210，Supelco-USA）用于进样样品。https://doi.org/10.1016/j.ejbas.2018.05.0012314- 808 X/©2018曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表埃及基础与应用科学杂志杂志主页：www.elsevier.com/locate/ejbas●●152M. Jamal，H. Hadi/Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences 5（2018）151-1562.2.3. 氯化铁（2% V/V）该溶液通过将2 mL氯化铁溶液（60% W/V FeCl3，BHD，UK）稀释于100 mL蒸馏水中制备，OH批次和RFIA方法。每天可使用相同溶剂通过适当稀释制备更多稀释溶液。CL2.2.4. 药物剂型的溶液称取20片劳拉替文缓释片（2 mg LOR）或40片劳拉西泮片剂（1mg LOR），最后制成粉末。将相当于0.0125g LOR的量的所得粉末溶解在Fig. 1.劳拉西泮的化学结构将柔性乙烯基管（0.8 mm i.d.）蠕动泵采用聚四氟乙烯管，反应盘管采用内径0.5mm的聚四氟乙烯管。采用双通道歧管（图2）进行LOR药物的RFIA分光光度测定。药物溶液（LOR）通过该装置中的两个通道之一输送。另一方面，第二通 道用于 输送氯 化铁溶 液。甲 基 -2- 苯并 噻唑啉 酮腙盐 酸盐（MBTH）的试剂溶液所得溶液通过蠕动泵以100 mL/min的总流速推进。以0.6 mL/min的速度进入检测器。形成绿色产物，并在659nm处测量吸光度。2.2. 材料和化学品分析级试剂，化学品和蒸馏水通常用于整个工作。药用级LOR和辅料来自State Company for Drug Industries and Medical Appliance，SDI，Samara-Iraq。含有LOR的药物剂型购自当地商业来源。在本研究中使用了两种通用 版 本 （ Lorativan® ， 2 mg ， Domina pharmacies ， Syria 和Lorazesam®，1 mg，SDI，Iraq）进行分析，每种版本均含有LOR作为其活性成分。2.2.1. LOR溶液（500mg/mL）对于分批和RFIA方法，通过将0.025 g纯LOR粉末溶解在50 mL乙醇中新鲜制备LOR标准溶液（500mg每天可通过使用蒸馏水适当稀释来制备更多稀释溶液。2.2.2. 甲基苯并噻唑啉-2-酮腙盐酸盐（0.05 M）该试剂的酸性溶液通过溶解1.08 2g的MBTH（Sigma Aldrich，Missouri，United States）在100mL的0.2M HCl（Merck，Germany）中的混合物。每天可使用相同溶剂通过适当稀释制备更多稀释溶液（该溶液可稳定超过两周）。将所得溶液振摇并过滤至50 mL容量瓶中，洗涤残余物并用乙醇稀释至刻度，得到250mg/mL LOR。对于批处理和RFIA方法，每天可通过使用蒸馏水进行适当稀释来制备更多稀释溶液。3. 程序3.1. 一般批处理程序将含有20-加入2.0用蒸馏水将烧瓶内容物稀释至刻度，混匀并保持10 min。在659 nm（室温25°C）下测量吸光度，对照含有除LOR外所有材料的试剂空白使用标准校准图计算药物浓度为了优化条件和在所有后续实验中，使用25μg/mL3.2. 一般RFIA程序从储备溶液中预结晶25-将150μ L的0.04 M MBTH注入LOR流中，然后将LOR流与氧化剂溶液（8%V/V的氯化铁）混合，总流速为0.6 mL/min（图2）。在659 nm处测量绿色产物的所得吸光度，校准图示于表1中。在LOR为100μ g/mL的条件下进行了优化。4. 结果和讨论4.1. 方法反应机理在氯化铁氧化剂存在下，LOR与MBTH直接反应生成绿色产物，吸光度kmax为659 nm。MBTH已用于分光光度法测定其他几种化合物[17]。形成亲电中间体时，表1为估算LOR而开发的程序的分析特征参数分批程序RFIA程序回归方程y = 0.0166x +0.1268y = 0.0015x +0.1008线性范围（1g mL-1）2–4025–400相关系数（R2）0.99650.9996检出限（s/n = 3）0.6142.287（1g mL-1）定量限（1g mL-1）2.047 7.624图二.用于通过与MBTH和FeCl3反应进行LOR的RFIA-分光光度测定的歧管，其中：IV，进样阀; RC，反应盘管; P，蠕动泵; FC，流动池; D，检测器; W，废物。生产率% 0.321 0.913平均回收率，% 101.165 99.560取样量（每小时取样量）6 26HNONCL●M. Jamal，H. Hadi/Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences 5（2018）151-156153HON哦NCLN×CH3MBTHNH2三氯化铁_H+/-2e-（E）CH3+的NHHOE +ClCH3+的NN哦CLNCL绿色产品图三. 提出的反应机理的示意图。见图4。从25mg/mL LOR与MBTH/氯化铁的反应中获得的绿色产物的吸收光谱相对于试剂空白进行测量对照蒸馏水测量试剂空白（对于本图标题中颜色的引用的解释，读者可以参考本文的网络版本通过加入不同体积的MBTH 0.02 M（0.25 - 3 mL）、FeCl3 2%V/V（0.1 - 2.5 mL）溶液至固定浓度的LOR，并在659 nm处测量吸光度，建立了 测 定 结 果 表 明 ， 当 浓 度 为 2.0mL0.02M 的 MBTH 和 浓 度 为1.5mL2%V/V的FeCl3时，染料的颜色强度最大，颜色稳定性最好，LOR为25 lgmL-1。在LOR（25 mg/mL）后颜色强度达到最大值在水介质中，该试剂与MBTH和FeCl3反应迅速还使用不同的添加顺序研究了添加顺序的影响，并且根据结果，发现如图1所示的试剂（药物+MBTH + OX）的添加顺序是优选的。 6的最大吸光度和测量稳定性。使用三种不同的温度（5 ° C、25 ° C和65 °C）来测量温度。研究了温度对反应的影响。在实践中，当将校准烧瓶置于（65 °C）水浴中时，当颜色显色时获得的吸光度高于室温（25 °C ）或（5 °C）。进一步的研究表明，显色产物在较高温度下不稳定，分解快，因此选择室温进行接下来的所有实验。产物的结构采用基于摩尔连续变化方法（Job在图中获得的结果。 7显示1：1形成了对试剂的LORMBTH在氧化过程中失去两个电子和一个质子，在反应条件下可以取代LOR，在室温下形成绿色产物。该反应的拟议途径[18]如图所示。3.第三章。对影响显色产物灵敏度和稳定性的主要因素进行了优化，其中一个参数随时间变化，其余参数不变。LOR反应产物相对于试剂空白的典型光谱如图所示。 四、4.2. 反应条件4.2.1. 分批分光光度法对所提出的方法进行了优化，以实现完全的反应形成、最高的灵敏度和最大的吸光度。0.70.60.50.40.30.20.10MBTHFeCl3电话：+86-0511 - 8888888传真：+86-0511 - 8888888体积（mL）确定了最佳实验条件图五、试剂（MBTH 0.02 M）和氧化剂（FeCl3 2% V/V）体积的影响SNSNSN吸光度N154M. Jamal，H. Hadi/Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences 5（2018）151-1560.70.60.50.40.30.20.100.40.30.20.10.0D+R+OX D+OX+ R添加顺序见图6。 添加顺序的影响0 0.2 0.4 0.6 0.81摩尔（D/D+R）见图7。工作方法。反应，并被选择用于进一步使用。当将150mL 0.04 M MBTH注入100μ g/mL LOR流中时，获得最大吸光度强度，然后将LOR流与氧化剂溶液（8%V/V的氯化铁）在反应盘管中混合，图2中给出。每个样品进样3次，在其他参数不变的情况下，通过改变不同的理化参数来优化。4.2.3. RFIA系统条件4.2.3.1. 化学变量的影响。对化学反应参数进行了优化和研究，以提高所采用反应的灵敏度。通过注射不同浓度的试剂（MBTH），研究了MBTH的最佳浓度，0.005至0.05 M）。图中的结果。 8表明0.04 M的浓度具有较高的吸光度和良好的精密度，并被选择用于进一步使用。还研究了不同浓度的氧化剂（氯化铁），在浓度范围内（从1到10%V/V）FeCl3进行了研究;最佳浓度为8% V/V，得到了最佳结果和最小空白值，如图9所示，并被认为是最佳值。4.2.3.2. 物理变量的影响。 研究了反应器的物理参数，并在50-200 cm的范围内研究了不同的螺旋长度用于混合试剂和完成反应。所获得的结果表明，线圈长度为80cm给出最高吸光度，如图10所示，然后用于所有实验。在此长度之后，由于分散导致的稀释增加，有色产品的吸光度随着线圈长度的增加而降低。不同流量的影响（图）。（11）反应是采用最小二乘法推导出回归方程。计算校准曲线的截距、斜率和相关系数值，并列于表1中，同时与RFIA拟定方法进行比较。为了检查该方法的有效性以及不受片剂添加剂的干扰，在存在（10倍）辅料的情况下完成了LOR的回收率试验获得了良好的回收率百分比，表明未观察到干扰，并且该方法对于分析其剂型中的LOR具有良好的选择性（表2）。在0.6-4.2 mL/min的范围内进行研究0.120.110.100.090.084.2.2. RFIA-分光光度法测定先前LOR测定方法（批次）用作开发反向流动注射（RFIA）程序的基础MBTH常用于多种化合物的分光光度测定，但该试剂价格昂贵，因此采用逆流歧管来估算LOR。首先，选择流动系统的最佳流形是非常必要的，因此，采用各种流形反应来执行不同的路径，所得到的结果表明，图中的流形是最佳的。 2给出了最佳吸光度，表2通过批处理法测定存在常见干扰时的LOR*辅料（250μ g/mL）找到LOR了，1g/mL回收率± SD，%**聚乙烯吡咯烷酮25.19100.76 ± 0.36乳糖25.32101.28 ± 0.22滑石25.22100.88 ± 0.13硬脂酸镁25.46101.84 ± 0.08总计（包含所有先前辅料）26.09104.36 ± 0.17*存在25μ g/mL LOR。**五次测定的平均值。0.070.060.250.20.150.10.0500.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06MBTH浓度（M）见图8。 试剂浓度的影响0 2 4 6 8 10 12氧化剂浓度，%（V/V）见图9。 氧化剂浓度的影响吸光度吸光度吸光度吸光度M. Jamal，H. Hadi/Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences 5（2018）151-1561550.210.190.170.15表3确定LOR的最佳条件变量研究范围最佳值FeCl3浓度（%v/v）1MBTH浓度（M）0.005反应盘管（cm）50总流量（mL/min）0.6注入试剂体积（mL）750.130.110.240.220.20.180.160.140.120.10 50 100 150 200250反应盘管长度（cm）见图10。 反应盘管长度的影响。吸光度计算时间为2.13 min;因此采样频率为每小时28个样本。4.3. 当前方法如表1所示，在上述优化条件下测定了各方法的分析特性，如线性、检测限、采样率、相关系数和相对标准偏差（RSD）。使用从储备溶液制备的LOR（25-400 μ g/mL）的系列溶液获得校准图的线性范围正常对照组进行比较采用RFIA法进行批量分析，虽然批量分析法比流动注射法灵敏，但RFIA法更方便，因为批量分析速度快（每小时进样26次），校准曲线的线性范围更宽。0 1 2 3 4 5流速（mL/min）图十一岁总流量的影响0.320.30.280.260.240.220.20.180 50 100 150 200 250样品定量环（μL）见图12。 样品体积的影响。结果表明，总流速为0.6 mL/min时吸光度最高，精密度良好。在该值之后，吸光度随着流速的增加而降低，因为高速度永远不会使反应物有足够的时间混合（即样品区将形成并快速离开流动池），因此，选择0.6 mL/min（总流速）为最佳值。使用5个样品环（75-200 μ L）研究进样样品的体积注入的150μL样品具有最佳的吸光度，并被选择用于进一步的实验（图12）。在研究了所有变量后，在优化条件下（表3），通过测量从进样时刻到最大值出现的时间，可以从理论上4.4. 准确度和精密度通过制备和分析含有三种不同浓度LOR的溶液，对拟定方法的准确度和精密度进行了五次重复评价本研究的分析结果总结见表4。相对标准偏差百分比（%RSD）作为精密度和相对误差百分比作为准确度的低值表明，所提出的方法具有良好的准确度和精密度。4.5. 分析应用批处理和RFIA方法也成功地应用于药物剂型（片剂）中的LOR测定，通过直接使用分析方法分析两种不同浓度的药物制剂。结果在表5中给出。为了检查建议方法的效率和成功，将所得结果与应用USP标准方法[19]所得结果进行比较。通过计算Student t值和F值来衡量当前方法的性能t检验和F检验的计算值未超过理论值，如表6所示。表4拟定方法的准确度和精密度。LOR的方法浓度，1g/mLRE%Rec.%RSD%*添加量（检出值）批1515.181.20101.200.323030.341.13101.130.31RFIA10025099.47249.13-0.53-0.3599.4799.651.890.91*四次测定的平均值。吸光度吸光度吸光度156M. Jamal，H. Hadi/Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences 5（2018）151-156表5应用拟定方法和官方方法测定不同剂型的LOR。剂型建议方法官方方法[19]批次RFIA浓（mg/mL）Rec. （%）*RSD（%）*浓（mg/mL）Rec. （%）*RSD（%）c浓（mg/mL）Rec. （%）*RSD（%）*采取发现采取发现采取发现Lorativan®（2 mg）1010.28102.800.117575.49100.650.561010.23102.300.751515.13100.870.16100101.11101.110.562020.56102.800.65劳拉西泮®（1 mg）1010.12101.200.497575.73100.971.281010.08100.800.811515.30102.000.25100101.35101.3530.552020.53102.651.45* 五次测定的平均值。表6现行方法与标准方法的统计学比较剂型%回收率± SD*批RFIA官方方法劳拉西泮（纯品）Lorativan®（2 mg）劳拉西泮®（1 mg）t（2.776）**101.17 ± 0.05101.84 ± 1.37101.60 ± 0.570.12399.56 ± 0.13100.88 ± 0.33101.16 ± 0.271.027100.05 ± 0.23102.55 ± 0.35101.73 ± 1.31法（19.000）**14.0942.224* 进行五次测定。浓度，浓度; RSD，相对标准偏差。**理论值。5. 结论文献报道了几种分光光度法和两种流动注射分析法用于测定制剂和生物体液中的LOR，这些方法要么需要萃取，要么使用复杂昂贵的技术，迄今为止文献中还没有反向流动注射-分光光度法用于测定纯品或制剂中的LOR。所建议的方法，这是简单和快速的，提供的优点的灵敏度比报道的方法，和广泛的测定，而不需要提取或加热。通过测定药物制剂中微克浓度水平的LOR，确立了新方法用于常规质量控制的广泛适用性该反应可采用间歇法和RFIA法进行，本文对两种方法进行了比较。引用[1] Lexicomp Online® ， 儿 科 新 生 儿 Lexi-Drugs®. 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