埃及基础与应用科学杂志2（2015）289主办方：真菌性角膜炎的亚甲蓝染色Dalia Moemena，*，Tamer Bedira，Eman A. Awadb，Adel Ellayehba埃及曼苏拉曼苏拉大学医学院医学微生物学和免疫学系b埃及曼苏拉曼苏拉大学医学院眼科学系A R T I CL EI N F OA B S T R A C T文章历史记录：2015年4月5日收到2015年7月16日收到修订版2015年8月10日接受2015年8月19日在线发布关键词：真菌性角膜炎快速诊断亚甲蓝早期准确诊断角膜真菌感染是有效治疗的关键。在发展中国家，显微镜评价是最有价值和快速的诊断工具。因此，我们的目的是研究亚甲蓝（MB）染色与氢氧化钾（KOH）和荧光钙白（CW）染色相比的效果2014年1月至2014年12月，标本经MB、10%KOH和CW染色直接 染色结果与真菌培养和菌株鉴定相一致。所有阳性真菌病例均开始局部应用阿替霉素B; 39例（81.25%）证实为真菌病例。荧光钙白染色阳性率为79.2%，MB染色阳性率为75%，10%KOH染色阳性率为68.75%。CW的敏感性和特异性最高（分别为99.44%和90.91%），其次是MB（分别为92.31% 和80.0%），最后是KOH（分别为84.62% 和71.43%）。71.8%的病例瘢痕愈合，仅4例患者（10.3%）需要角膜移植术（PK）。用MB染色法直接镜检角膜刮片中的真菌结构© 2015曼苏拉大学。由Elsevier B. V.制作和托管。这是一个CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1.介绍真菌性角膜炎是导致严重眼部疾病和失明的主要原因。它在世界范围内分布，但在热带和亚热带地区更常见[1]。据报告，埃及真菌性角膜炎的发病率正在增加，这与该地区的气候变化（最低温度和最高大气湿度升高）有关[2]。在真菌性角膜炎中，早期诊断和抗真菌治疗对于预防进一步的并发症如前房积脓形成、眼内炎或视力丧失是必要的[3]。真菌性角膜炎的诊断仍然依赖于染色涂片和真菌培养[4，5]。 真菌培养是诊断真菌性角膜炎的“金标准”[6] ;然而，该过程需要时间（2-21天），这会延迟临床治疗[7，8]。因此，尽管培养有助于明确诊断和鉴定，但角膜刮片中真菌结构的直接显微镜检测允许快速推定诊断* 通讯作者。联系电话：+0201224647147。电子邮件地址：dr_daliamoemen@yahoo.com（D. Moemen）。http://dx.doi.org/10.1016/j.ejbas.2015.08.0012314- 808 X/© 2015曼苏拉大学。Elsevier B. V.制作和托管这是CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在www.sciencedirect.com在线获取ScienceDirect杂志主页：http://ees.elsevier.com/ejbas/default.asp290埃及基础与应用科学杂志2（2015）289[1]的文件。在发展中国家，显微镜评价是检测角膜刮片中真菌元素的最有价值和最快速的因此，需要鉴定一种用于真菌性角膜炎诊断的染色方法，其快速、易于执行并且在临床环境中具有高灵敏度亚甲基蓝（MB）作为染料和生物染色剂广泛应用于临床。MB检测淋球菌、早期癌细胞、早期乳腺癌淋巴结中的转移癌细胞，也用于诊断癌前病变和早期胃癌[9，10]。在一项研究中，对MB诊断真菌性角膜炎的有效性进行了研究，发现其是一种快速有效的真菌性角膜炎早期诊断方法[11]。因此，我们在本研究中的目的是确认MB染色快速检测真菌性角膜炎的有效性，并将其阳性率、敏感性和特异性与10% KOH涂片和荧光钙白（CW）进行比较。污点2.材料和方法2.1.患者本研究纳入了2014年1月至2014年12月期间在Mansoura眼科中心（Dakahlia，埃及）门诊就诊的临床疑似真菌性角膜炎患者对于所有患者，采集详细的病史，包括症状的持续时间、诱发因素的存在（例如，创伤的存在和性质、接触镜的使用、先前的眼部手术史、糖尿病史和局部或全身类固醇的使用）、给予的立即治疗的类型。进行全面的临床检查，评估腐肉的隆起（隆起或平坦）、腐肉的质地（湿或干）、溃疡边缘（锯齿状或轮廓分明）、脓肿大小、色素沉着、德斯密氏皱襞、卫星病变、树突状病变、免疫环、前房中的脓毒症使用Haag Streit狭缝和照片狭缝附件拍摄临床照片真菌性角膜炎的临床疑似病例根据以下情况进行诊断：（i）眼睛有植物源性创伤史;（ii）存在临床体征，如边缘不规则和羽毛状溃疡、卫星病变或干眼症，以及因轻度畏光、流泪或轻度刺激引起的轻度不适[12]。如果患者被证实患有细菌性角膜炎或接受过抗真菌药物治疗，则被排除在研究之外。本研究经曼苏拉大学医学研究伦理委员会批准进行。从所有参与者处获得书面知情同意2.2.样品收集在用局部苯诺辛酯滴眼液局部麻醉眼睛该手术是在无菌条件下使用特殊的三角形末端灭菌手术刀进行的。每例患者获得两次刮片，第一次刮片在3个载玻片上轻拍，用于直接观察。用MB、10%KOH和CW染色进行显微镜检查。第二次刮片接种在沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基上，采用C形狭缝技术。2.3.KOH涂片法检测真菌将一滴10%氢氧化钾加入到第一个载玻片中，应用盖玻片，并通过直接显微镜检查湿封片。2.4.MB染色法检测真菌向第二个载玻片中加入一滴MB（20 μl），盖上盖玻片，并通过直接显微镜检查载玻片。2.5.CW染色法检测真菌一滴CW（包含lg/l Calcofluor White M2 R和然 后 将 0.5g/l 伊 文 思 蓝 （ Evans blue; Sigma-Aldrich ， StLouis，MO，USA）在盖玻片的一个边缘处添加至第三个载玻片，并且将滤纸放置在相对边缘处以将染色剂拉至载玻片和盖玻片之间的涂片然后将载玻片静置1-2分钟，然后通过荧光显微镜检查，使用蓝光激发（对于发射波长为2.6.真菌培养将接种的SDA培养基在27 °C下孵育长达3周。每隔一段时间观察培养物的真菌生长。根据菌落特征、生长速度、菌丝和孢子形态对菌株进行鉴定。2.7.抗真菌局部治疗所有病例在通过角膜刮片显微镜检查获得真菌丝阳性报告后，立即开始使用浓度为5 mg/ml的阿替霉素B进行抗真菌局部治疗。将该产品从在蒸馏水中稀释的静脉内制剂（Fungizone，Bristol-Myers Squibb，New York，NY）中预稀释。每小时局部滴一次，持续一周，然后每两小时一次，持续三周，然后根据角膜炎的活动程度逐渐减少，直到溃疡消退对药物治疗无效的患者进行了额外的手术，这些手术包括治疗性穿透性角膜移植术（PK）、用阿替霉素B冲洗前房或必要时进行内脏摘除2.8.统计分析使用SPSS统计软件包，版本10.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）。涂片检查结果291埃及基础与应用科学杂志2（2015）289采用χ2检验，比较不同涂片检查技术的敏感性和特异性，并与真菌培养结果进行3.结果在为期一年的研究期间，48名在曼苏拉眼科中心门诊就诊的患者临床上疑似真菌性角膜炎。共获得角膜刮片标本48例。39例真菌性角膜炎患者的真菌培养阳性率为81.25% 在39例患者中，24例（61.5%）为男性，15例（38.5%）为女性。真菌性角膜炎发病年龄以23 ~ 73岁（平均53.2 ± 15.23岁）的中年组最多见。易感因素分析显示，农村居民是第一位的易感因素（58.97%），其次是植物损伤（38.46%）和既往眼科手术（15.38%）（表1）。研究期间未观察到角膜接触镜配戴病例，也未观察到季节性变化角膜刮片样本的培养显示，从角膜溃疡中回收的最常见的真菌病原体是镰刀菌属。(18/39）、链格孢属（Alternariaspp.）（7/39）、烟曲霉（5/39）、白色念珠菌（4/39）、非白色念珠菌（3/39）和黄曲霉（2/39）（表2）。 关于特征性临床表现与病原真菌因素的相关性，大多数病例明显存在边缘不规则和羽毛状的溃疡、卫星病变和干燥外观。26例患者中检测到中央角膜病变（占镰 刀 菌 属 （ Fusariumspp. ） (10/18 ） ， 其 次 为 曲 霉 属 。（3/7）、链格孢属（Alternaria spp.）（2/7）和念珠菌属（Candida spp.）（2/7）。前房积脓检出率为29.2%，占培养阳性的35.9%。（5/7），其次为链格孢属（Alternariaspp.）（2/7）和镰刀菌属（Fu sarium spp.）（3/18）。在9名患者中检 测 到 色 素 沉 着 （ 占 患 者 总 数 的 18.8% 和 阳 性 培 养 物 的23.1% ） ， 其 中 链 格 孢 属 最 高 。 （ 5/7 ） 其 次 为 曲 霉 属（Aspergillus spp.）（3/7）。在4例患者中检测到内皮斑块（占总患者的8.3%和阳性培养物的10.3%）：3例为曲霉菌属。白 色 念 珠 菌 1 例 （ 1/4 ） 。 3例 曲 霉 菌 检 出 树 突 状 病 变 。（3/7）。培养技术可作为真菌性角膜炎诊断的金标准。比较了三种不同的快速检测方法用于诊断真菌性角膜炎， 用CW、MB和10%KOH直接镜检39例角膜刮片，阳性率分别为79.2%、75%和68.75%。比较直接镜检与SDA培养的敏感性和特异性（表3 ），CW 显示出较高的敏感性（99.44% ）和特异性（90.91%），其次是MB（敏感性92.31%，特异性80.0%），最后是KOH 20%（敏感性84.62%，特异性71.43%）。在比较直接镜检与SDA培养的准确性或效率时， CW的准确性较高（ 96.0% ） ， 其 次 是 MB （ 88.89% ） ， 最 后 是 KOH 20%（80.0%）。使用MB染色检查的真菌菌丝显示菌丝被染成蓝色，因此在浅色背景下更好地突出显示（图1B）。①的人。另一方面，KOH基涂片中的菌丝是透明的，没有很好地突出显示（图2）。用CW染色，真菌菌丝被清楚地描绘出来，因为细胞壁横壁（隔膜）被染成独特的绿色;胶原纤维、坏死组织碎片或其它结构没有染色（图3）。治疗结果显示，28例（71.8%）瘢痕愈合。4例患者（10.3%）需要治疗PK，2例患者（5.1%）需要内脏切除，5例患者失访。图1×100）。表1无%糖尿病5/3912.82年龄>60岁8/3920.51植物创伤15/3939.47既往眼部手术6/3915.38农村23/3958.97干眼3/397.69无机性创伤2/395.13材料城市16/3937.2表2SDA直接镜检阳性CW KOH 20% MB链格孢7人（18.4%）7人（21.21%）7人（19.4%）7人（17.95%）黄曲霉2（5.26%）1（3.03%） 2（5.56%）2人（5.13%）曲霉5（13.16%）3（9.09%）4（11.1%）5人（13.89%）烟曲霉白色念珠菌4例（36.8%）4例（12.12%）4人（11.1%）4人（10.26%）梭菌属17人（44.7%）16人（48.48%） 17人（47.2%）18人（46.15%）292埃及基础与应用科学杂志2（2015）289图2 -角膜溃疡标本中的真菌，通过氢氧化钾（KOH）涂片检测（放大倍数，×100）。图3（放大倍数，×400）。4.讨论真菌性角膜炎已成为视力丧失的主要原因之一，特别是在许多发展中国家，其中大量人口是农民。真菌性角膜炎的诊断和治疗一直是眼科医生面临的挑战。难点在于建立临床诊断，在实验室中分离病原真菌生物体，并使用局部抗真菌药物有效治疗角膜炎[13，14]。39例真菌性角膜炎患者的真菌培养阳性率为81.25%。本研究中的人群包括临床诊断为真菌性角膜炎的患者属于高危人群，角膜标本真菌培养阳性率较高。在目前的研究中，发病年龄以中年为主，在印度南部、中国北部等发展中国家表3-真菌性角膜炎诊断中直接镜检与真菌培养的比较。灵敏度SDA上的文化阳性似然比特异性阴性似然比阳性预测值精度阴性预测值积极381363336负11031261595% CI86.47-99.57%97.44%90.9195% CI58.67-98.4995% CI1.65-69.51%10.72%0.0395% CI0.00-0.20%97.4495% CI86.47-99.57%90.9195% CI58.67-98.49CW阳性阴性阳性阴性阴性阳性阴性96.0百分比MB79.11-98.3092.3180.0051.91-95.431.67-12.754.620.100.03-0.2992.3179.11-98.3080.0051.91-95.4388.89%KOH 20%69.46-94.184.6271.4347.83-88.651.49-5.92.960.220.1-0.4784.6269.46-94.171.4347.83-88.6580.0百分比293埃及基础与应用科学杂志2（2015）289巴西东南部[15这也可能是因为40 ~ 59岁的被试是体力劳动的主力军，尤其是农业劳动，更多地参与户外活动。在本研究中，农村居民是第一个主要的易感因素（58.97%）。这是由于埃及农村地区的人们更多地参与农业活动，这也增加了他们对真菌性角膜炎的脆弱性。植物外伤史（38.46%）是真菌性角膜炎最常见和最主要的并发症之一。植物创伤是许多先前研究的主要原因[18然而，其他人发现，只有28.6%的真菌性角膜炎患者注意到植物碎片和吸管的创伤[21，22]。糖尿病是5例（12.82%）的相关因素。这些发现也得到了其他报告的支持，这些报告发现，由于免疫系统受到抑制，慢性全身性疾病是真菌性角膜炎的重要易感因素[18我们的研究中没有配戴角膜接触镜的病例据报道，在其他研究中，角膜接触镜配戴是主要相关疾病之一[22，24]。发生率较低的原因可能是纳入患者的社会经济水平较低。在这项研究中，从角膜溃疡中回收的最常见的真菌病原体是镰刀菌属。(46.2%），与来自南佛罗里达州和加纳[18]、巴西东南部[17]、中国北方[16]、印度[20]和马来西亚[25]的报告研究相似，这些地区气候温暖潮湿。然而，其他研究表明，黄曲霉是最常见的真菌分离[1，26]。在我们的研究中，17.9%的分离株是念珠菌属。先前报告称，角膜溃疡中的酵母菌分离率低至15%，尤其是在炎热地区[20]。然而，在英国的一项研究中，超过一半的分离株被报告为念珠菌属。这一发现证实了酵母菌作为城市化和寒冷地区真菌性角膜炎原因的重要性[19]。 我们的研究结果与真菌性角膜炎的临床诊断特征一致，例如：出现干燥、隆起的溃疡，边缘呈羽毛状，伴发卫星病变，以及复发性脓毒症[27]。此外，本研究还表明，色素沉着与链格孢属密切相关。(71.4%）和42.86%的曲霉属菌株有树突状病变。这些陈述与Garg等人的报告相似[28]和Gajjar等人[29]。在本研究中，使用MB染色检查的真菌菌丝显示丝状真菌被染成蓝色，细胞核被染成紫蓝色，这使得菌丝容易与角膜纤维和杂质区分开;因此菌丝在浅色背景下更好地突出显示。此外，MB还可以识别细菌或混合感染。相比之下，KOH基涂片中的菌丝是透明的，没有很好地突出显示，因为细胞壁和隔膜未染色，可以通过其折射特性看到CW染色的阳性率、敏感性、特异性、准确性指数及阳性和阴性预测值最高，其次是MB染色，最后是KOH涂片。因此，在无紫外显微镜和本研究中未评价PCR，因为尽管PCR能够在高比例的培养阴性病例中检测到真菌DNA，但由于经济原因，它很难在我们的医院中用作常规诊断试验因此，我们强烈建议使用直接MB染色角膜涂片作为一种快速，经济和敏感的方法来筛选真菌性角膜炎。本研究的治疗结局良好，其中71.8%的病例自就诊之日起3周内瘢痕愈合<，仅4例患者（10.3%）需要PK，2例患者需要内脏切除。另一方面，在大多数报告中，角膜炎的治疗结果仍不令人满意[30，31]。Saha等人报告了60%患者的PK[31]。此外，尽管在Rautaraya et al.的研究中接受了纳他霉素的全面治疗，但仍有大量患者需要治疗性角膜移植术（PK）。[32]. 不出所料，我们研究中的早期诊断和治疗导致了这一令人鼓舞的结果。5.结论用MB染色法直接镜检角膜刮片中真菌结构是早期诊断真菌性角膜炎的一种快速、有效的方法。R E F E R E N C E S[1] Tilak R， Singh A， Maurya OP， Chandra A， Tilak V，Gulati AK. 印度的肌性角膜炎：一项5年回顾性研究。JInfect Dev Ctries2010;4：171-4.[2] Saad-Hussein A，El-Mofty HM，Hassanien MA.气候变化和埃及真菌性角膜炎的预测趋势。 EastMediterr HealthJ2011;17：468-73.[3] 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