© 2013由Elsevier B.V.发布。信息工程研究院负责评选和同行评议可在www.sciencedirect.comwww.sciencedirect.com在线获取ScienceDirectIERI Procedia 5（2013）95 - 1012013年农业与自然资源工程王百合枯萎病抗性反应中差异表达基因的SSH饶健，刘迪秋*，张楠楠，何华，葛峰，陈朝银昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500摘要百合枯萎病是由植物病原真菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的百合主要病害 百合与F. 尖孢菌仍然知之甚少。 为了寻找在抗赤霉病菌反应中差异表达的基因，尖孢L. Regale是一种珍贵的百合高抗赤霉病遗传资源。 oxysporum的cDNA文库。 感染F.利用抑制性消减杂交（SSH）技术构建了尖孢霉（oxysporum）的表达载体。对1101个克隆进行序列分析后，共获得585个独特的表达序列标签（ESTs），同源性分析显示342个独特的序列没有显著的同源性。在模式植物功能分类的基础上，对243个与已知蛋白质具有显著同源性的EST进行了功能分类其中最大的一组基因包括PR 3（几丁质酶）、PR 10、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、细胞色素P450、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶等与病害/防御相关的基因，另外还包括与植物对病原菌的防御反应相关的信号转导相关基因和重要转录因子。简单地说，在对F.尖孢L. regale的研究揭示了与L. 对F. 尖孢属© 2013作者。出版社：Elsevier B.V. 在CC BY-NC-ND许可下开放访问。信息工程研究院负责评选和同行评议关键词：王百合;尖孢镰刀菌;防卫反应;差异表达基因;抑制消减杂交1. 介绍植物在生长发育过程中经常面临生物和非生物胁迫的威胁。大量的植物病害导致作物产量和质量的巨大损失（Yevtushenko等人，2005年）。真菌性病害是植物病害的重要组成部分，其中小麦赤霉病是由几种镰刀菌引起的小麦病害。和大麦（Hordeum vulgareL.）。棉花枯萎病的病原菌是F. oxysporum F. sp. vasinfectum导致许多棉花纤维大量损失* 通讯作者。联系电话：+86（0）87165920621;传真：+86（0）87165920570。电子邮箱：diqiuliu@126.com。2212-6678 © 2013作者出版社：Elsevier B.V. 在CC BY-NC-ND许可下开放访问。信息工程研究所负责的选择和同行评审doi：10.1016/j.ieri.2013.11.07696Jian Rao等人/ IERI Procedia 5（2013）95世界各地的种植区（王和罗伯茨，2006年）。百合（LiliumL.）百合是生产切花的主要观赏作物之一，在鲜切花和鳞茎生产过程中，百合植株常受到真菌病害的危害。其中，真菌F.百合尖孢菌是百合最具毁灭性的病原菌之一，可引起百合基部腐烂。F.尖孢霉在植物中引起一些通常已知的症状，包括枯萎、根腐病和黄化（Diener和Ausubel，2005; Lee等人，2010年）。为了培育对赤霉病具有较好抗性的品种。尖孢霉，遗传资源表现出高水平的抗性在现代植物育种中发挥重要作用。对于百合而言，没有一个栽培品种或野生百合品种对F.但也有部分品种和野生百合对尖孢镰刀菌有较高的抗性。尖孢菌，如 亚洲百合Lilium Asiatic Hybrids和亚洲百合L. regale（Lim等人，2002年）。在百合品种中，东方百合对F.尖孢属L.君子兰是我国特有的野生百合品种，分布于四川岷江流域。L.由于帝王百合对病原真菌、病毒和干旱胁迫具有极高的抗性，因此在世界各地的百合育种中得到了广泛的应用，并培育出了一些具有优良性状的百合品种。然而，目前 对L. 对F. 尖孢 菌属尚 不清楚。 为了解 L. 对F. 尖孢 L. 在 F. 利用抑制 性消减杂 交（SSH）技 术对尖孢 霉（oxysporum）进行了初步研究。抗赤霉病相关基因的分离与分析。尖孢L.为百合的抗病育种提供了一定的理论依据。2. 材料和方法2.1. 植物材料和病原体感染一个非常有侵略性的F。在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上活化我们实验室中保存的尖孢菌菌株5-28 ℃下7天。然后用无菌蒸馏水从平板上冲洗孢子。感染前用无菌蒸馏水将悬浮液稀释至106孢子/mL。L.盛宴 感染F.尖孢菌（oxysporum）的根浸接种。同时，用无菌蒸馏水处理，称为模拟接种，作为对照。分别在接种后2、4、8、12、24、36、48、72 h采集小鳞茎根部。将所有植物组织用液氮处理，然后在室温下储存。 摄氏80度直到核酸分离。2.2. 总RNA和mRNA分离根据Liu 等人的方案（Liu等人，2006），使用硫氰酸胍法从收集的根中分离总RNA。此外，用DNA酶I（Promega，USA）处理RNA 1小时以去除DNA污染。然后使用NucleoTrap® mRNA Mini试剂盒（NICEREY-NAGEL，德国），使用制造商的用户手册中描述的方法分离和纯化mRNA2.3. SSH cDNA文库的构建与分析根据用户手册，使用PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit（Clontech，USA）构建SSH cDNA文库。感染L.将在不同时间点（2、4、8、12、24、36、48和72 hpi）收集的regale根以相等比例混合在一起作为测试物，并且将来自相同时间间隔的水处理根的mRNA作为驱动物。将消减的PCR产物连接到pGEM-T Easy载体（Promega，USA）中，然后转化到大肠杆菌DH 5 感受态细胞在蓝白斑筛选的基础上，挑取并在96孔微量培养板中培养过夜。用特异性引物1和2R对插入片段的长度进行PCR分析。所有PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，并且去除具有200bp或多于一个插入片段的克隆，并且选择其它克隆进行测序。2.4. 序列和生物信息学分析使用通用M13测序引物（Sangon，中国）对菌落进行测序。用Xu等（2011）描述的方法进行序列分析。根据Bevanet al（1998）描述的目录系统，将注释的EST分配到功能类别。Jian Rao等人/ IERI Procedia 5（2013）95973. 结果和讨论3.1. 分离乳杆菌差异表达基因在F.SSH法接种尖孢菌为了丰富苜蓿抗性防御反应中的差异表达基因。regale的cDNA消减文库。regale接种F.尖孢菌属。从F.尖孢菌感染根作为测试者，来自模拟接种根的cDNA作为驱动者。将试验者和驾驶者进行两轮差减，然后用引物1和2R扩增差异表达的基因片段池。通过TA克隆和蓝白斑筛选，随机挑取3168个克隆。菌落PCR共筛选到1726个克隆，插入片段长度为200 ~ 1000 bp，平均长度为400 bp。对1101个克隆进行了测序，发现585个独特序列，通过CAP3序列分析，得到194个重叠群和391个单链。3.2. 响应F.尖孢菌感染然后利用GenBank中的BLASTx工具对这585个序列进行同源性分析。因此，更多超过一半的独特序列被指定为无显著同源性。同源性分析的部分结果如表1所示。对243个与已知蛋白质有显著同源性的EST进行功能分类结果，根据拟南芥中建立的分类，它们被分为14种假定的细胞功能（图1）。表1.对L. regale感染F. 尖孢克隆编号克隆匹配序列数据库中的匹配序列匹配序列的来源E值疾病/防御F03D11 7 AAD17336.1细胞内病程相关蛋白PR-107麝香百合5.00E-43 F28 A03 14 AAF 21623.1细胞内病程相关蛋白PR-104麝香百合5.00E-54 F16 A02 7 AEV 89264.1病程相关蛋白尖叶芭蕉3.00E-41 F2 1F 04 2 ACF06558.1germin A油棕8.00E-41 F10 D12 1 ACG41245.1 germin-like protein subfamily 1 member 00 E-18 F06 H12 1 XP_003563447.1脂质转移样蛋白类血管紧张素转换酶样二穗短柄草6.00E-12 F19 C 02 13 CAA 3 9535.1几丁质酶水稻6.00E-54 F18 A048AAA32640.1部分几丁质酶A l l i u m sativum4.00E-64 F03 G 03 1XP_002521689.1 I类几丁质酶，推定蓖麻0.005F11 A08 1 BAG38685.1几丁质酶A菠萝3.00E-09@7 F13 D 09 2 XP_002516746.1 14-3-3蛋 白 ， 推 定 的 蓖 麻1.00E-51F15 F01 3XP_002511298.1细胞色素P450，推定蓖麻4.00E-32 F07 F12 8 ABO 20848.1细胞色素P450样TBP蛋白百合2.00E-54 F03 B1细胞色素b5油棕2.00E-09 F16 H 06 1 BAK22528.1tau谷胱甘肽S-转移酶洋葱5.00E-73F25H071NP_001236903.1谷胱甘肽S-转移酶GST 23Glycine max6.00E-17 F15A061XP_002273830.1谷胱甘肽S-转移酶U17亚型1Vitis Vinifera2.00E-81 F06C121ACF06490.1谷胱甘肽-S-转移酶Cla 47Elaeis guineensis谷胱甘肽S-转移酶F13葡萄 0.037F14 H 08 1 ADB11335.1 phi类谷胱甘肽转移酶GSTF 7胡杨 1.00E-16 F13 E08 1 AAK29077.1甘露聚糖结合凝集素番红花9.00E-13F10 D10 2 BAH37015.1 NtRab 11 D烟草6.00E-62 F20 G 08 2 ADD 09573.1白三叶草b白三叶草5.00E-08 F18 E02 2 2 ABO 42703.1推定ADP核糖基化因子海罂粟 7.00E-5998Jian Rao等人/ IERI Procedia 5（2013）95克隆编号登录号的数据库中的匹配序列匹配序列的来源E值信号转导F02 G10 4 AAD10247.1钙调素菜豆1.00E-27丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶AtPK 2/AtPK 19-像二穗短柄草2.00E-74F16 G 08 2 XP_002528537.1丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶蓖麻8.00E-70F27G03 4 AEX55233.1冷调节赤霉素调节蛋白1大蒜2.00E-27克隆匹配序列F15H057CAI77769.1kunitz胰蛋白酶抑制剂山杨2.00E-30F06E081NP_176059.1GDSL酯酶/脂肪酶LIP-4拟南芥2.00E-06第一季第4集1ABR19827.1半胱氨酸蛋白酶Elaeis guineensis2.00E-77F01G012XP_003625315.1抗病反应蛋白蒺藜苜蓿2.00E-07F07B081AEX55236.1胚胎发育晚期丰富蛋白lea 14-aAllium sativum4.00E-22F12B062EFY91418.1钙荧光白超敏蛋白绿僵菌2.00E-12F13H071BAM28967.1苯丙氨酸解氨酶百合7.00E-33F15D091BAM 28965.1苯丙氨酸解氨酶，部分百合1.00E-140F16E081ACZ60130.1脱落胁迫成熟巴蕉属粉芭蕉6.00E-04F26E011XP_003635036.1热休克同源蛋白80样Vitis Vinifera1.00E-49F18B121AAR14052.2氢酶Solanum tuberosum2.00E-08F13H042ADF43731.1中单还原酶麝香百合6.00E-81F23A072XP_002276789.2类过氧化物酶Vitis Vinifera2.00E-22F20F056XP_002266365.2类阳离子过氧化物酶Vitis Vinifera5.00E-41F28G113CAD67479.1过氧化物酶芦笋2.00E-128F16B102XP_002518482.1过氧化物酶63前体，推定蓖麻9.00E-12F14F024XP_003558949.1类过氧化物酶二穗短柄草6.00E-24F26F121XP_002529755.1谷胱甘肽过氧化物酶蓖麻6.00E-22F28C121ADX86748.1过氧化物酶PX5细花樟2.00E-09F23E031XP_002269918.1过氧化物酶4Vitis Vinifera2.00E-76F10G013NP_001237535.1硫氧还蛋白H1Glycine max8.00E-23F13D015ABX79345.1硫氧还蛋白HVitis Vinifera7.00E-47F22G081ACA13182.1Ⅱ型过氧化物氧还蛋白粘旱生4.00E-54F20D053AAW58111.1多酚氧化酶Prunus salicina7.00E-23F10H061AFI08583.1多酚氧化酶Ⅳ a北美海棠8.00E-06F04F111AFX61785.1锰超氧化物歧化酶野芭蕉1.00E-09F17C061NP_001147645.1氧化还原Zea mays1.00E-70F03D052ABB47623.1LTCOR 12生长素诱导蛋白PCNT 115Oryza sativa2.00E-70F20D023XP_002533935.1丙酮酸激酶，推定的蓖麻9.00E-19F27E072ACF06501.1Skp1Elaeis guineensis6.00E-30F09A031BAC57816.1推定突触融合蛋白SYP111Oryza sativa1.00E-26F14A011ACF78996.1催化/水解酶Zea mays2.00E-11F25E021ADK56125.1紫色酸性磷酸酶Phaseolus vulgaris7.00E-13F18F103XP_002272040.1转录可能WRKY转录因子33样Vitis Vinifera3.00E-05F27E123ABB17073.1bZIP转录因子Capsicum annuum3.00E-19F12F062AEB35702.1Myc2Helianthus Annuus9.00E-10F01B032XP_002277951.1转录延伸因子1同源异构体1Vitis Vinifera4.00E-37Jian Rao等人/ IERI Procedia 5（2013）9599像F27 C11 1 ACB59195.1 2-异丙基苹果酸合酶甘蓝 2.00E-09疾病/防御转运蛋白蛋白质的去乙酰化和储存转录能源细胞生长/分裂代谢蛋白质合成次级代谢信号转导细胞内运输细胞结构假设蛋白质图1.从L. 用F. 尖孢在14个功能类别中，“疾病/防御”类别所占比例最大（33%）。与抗病/防御相关的基因构成了cDNA收集的最大部分，这表明，L.在本研究的SSH cDNA文库中富集了regale。疾病/防御类别中的大多数基因是病程相关基因和氧化应激相关基因，如PR 3（几丁质酶）、PR 5（奇异果甜蛋白样蛋白）、PR 10、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、细胞色素P450、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶和热休克蛋白（HSP）。上述基因在先前的研究中被鉴定为在接种病原体后差异表达的抗性相关基因（VAN DEN Berg et al.，2007年; Xu等人，2011年）。众所周知的PR基因、CHI和TLP已被证明是各种植物-病原体相互作用中防御网络的一部分（Gao et al.，2012年）。CHI和TLP参与一些病原性真菌的结构组分的降解（Tobias等人，2007年）。此外，GST被鉴定为赋予对真菌病原体和氧化应激的抗性的毒素分解代谢过程相关基因（Barthelson等人，2010年）。此外，氧化胁迫相关基因在甘草根中大量组装。 在对F. 尖孢克隆编号登录号的数据库中的匹配序列匹配序列的来源E值克隆匹配序列F04E053ACZ95473.1二硫键异构酶n.布氏粘子2.00E-07F02F101AAQ56324.1推定的多聚腺苷酸结合蛋白Oryza sativa2.00E-28F07 G11 1 NP_179895.6含有RING/U-box结构域和ARM重复序列的拟南芥5.00E-07蛋白F12D071ABB47998.1锌指，C3HC4型家族蛋白Oryza sativa5.00E-10F17C021ABQ42139.1长寿因子样蛋白无瓣海桑4.00E-15F18A051AFP57452.1RNA结合富甘氨酸蛋白黑烟2.00E-04F18A101XP_003535166.1锌指CCCH结构域蛋白30-大豆0.001100Jian Rao等人/ IERI Procedia 5（2013）95感染包括编码谷胱甘肽过氧化物酶、多酚氧化酶、硫氧还蛋白、CAT、锰超氧化物歧化酶和一系列过氧化物酶的基因。氧化爆发是病原体攻击后的早期防御反应。活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生是植物对病原菌攻击的过敏反应（hypersensitive response，HR），是植物抗病机制的重要组成部分。但自由基的过量释放会对寄主植物的细胞成分造成损伤。上述编码ROS清除剂的氧化应激相关基因在针对植物病原体的防御反应中起重要作用（Grimaudet al.，2001年）。在氧化爆发过程中，与氧化胁迫相关的基因大量表达，从而大大减轻了植物细胞的氧化损伤。显然，氧化应激相关基因可能是L. regale和F.尖孢属此外，与蛋白质相关的功能类别（15%）包括蛋白质合成（8%）和蛋白质目的地或储存（7%）。大约13%的独特基因被分配到代谢相关的功能类别，参与糖、氨基酸、脂类和离子转运的基因占9%。此外，有5%和4%的独特EST分别属于转录调控和信号转导途径。这些基因参与细胞内抗病信号传导途径，调控锌指蛋白、钙调蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、bZIP转录因子、WRKY转录因子等抗病相关基因的转录，其中丝氨酸/苏氨酸激酶基因Pto赋予马铃薯对假单胞菌的抗性PV.番茄（Sessa和Martin，2000）和另一个丝氨酸/苏氨酸激酶基因Stpk-V赋予白粉病抗性在小麦中（Cao等人，2011年）。从小麦分离的碱性亮氨酸拉链转录因子（TabZIP 1）在对非生物和生物胁迫的抗性中起作用（Zhang et al.，2008年）。信号转导通路中的基因以及转录因子是病原体感染后信号转导的关键。因此，在L. 对F.尖孢菌感染分离使用SSH技术在本研究中的应用。 这是第一次大规模的调查L。 盛宴和F.在分子水平上对尖孢菌进行了研究。对这些基因的详细表达和功能分析将有助于我们深入了解苜蓿抗性防御反应的分子机制。 对F. 尖孢属确认本研究得到了国家自然科学基金（31160401）的资助。引用[1] Yevtushenko DP，Romero R，Forward BS等。病原体诱导的天蚕素A-蜂毒素抗菌肽基因表达在转基因烟草中赋予抗真菌抗性。J Exp Bot，2005; 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