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TrackPad:开源的单细胞跟踪和谱系注释软件
SoftwareX 11(2020)100440原始软件出版物TrackPad:用于半自动单细胞跟踪和谱系注释的软件J.A. 康韦尔a,b,J。Lic,S.Mahadevand,J.S.Draperi,G.L.Joune,H.Zoellnerd,N.S.阿斯利e,f,R.P. 哈维B,G,H,R. E。诺尔登湾b,c,a美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症研究中心癌症生物学和遗传学实验室,20892b澳大利亚研究理事会干细胞科学特别研究倡议c新南威尔士大学生物医学工程研究生院,悉尼,新南威尔士州2052,澳大利亚d悉尼大学医学与健康学院口腔病理学和口腔医学细胞和分子病理学研究单位Westmead Hospital,Westmead,NSW 2145,Australiae悉尼大学医学与健康学院牙科学院口腔生物科学系,Westmead医院,Westmead NSW 2145,澳大利亚f悉尼大学医学院医学与健康学院,Westmead医院,Westmead NSW 2145,澳大利亚g发育和干细胞生物学部,Victor Chang心脏研究所,悉尼,新南威尔士州2010年,澳大利亚h街新南威尔士大学医学院文森特i麦克马斯特干细胞和癌症研究所,Michael G DeGroote医学院。加拿大安大略省汉密尔顿ar t i cl e i nf o文章历史记录:收到2019年收到修订版2020年1月17日接受2020年保留字:计算机辅助图像分析模板匹配a b st ra ctTrackPad是一个开源的,生物学家友好的图形用户界面,用于跟踪和注释来自延时电影的单细胞谱系命运。该软件应用交叉相关、模板匹配(CCTM)来使用透射或荧光图像跟踪每个细胞。机器跟踪由研究者监督,研究者可以手动注释细胞命运,如分裂、死亡或细胞表型的变化。通过使用经验证的跟踪数据作为地面实况来模拟跟踪,选择最小化用户干预和跟踪时间的搜索参数。使用该软件的研究人员可以产生高质量的注释细胞轨迹和分裂谱系,以了解内在和外在因素如何影响细胞状态和命运。©2020作者由爱思唯尔公司出版这是CC BY许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)中找到。代码元数据当前代码版本v2.0此代 码 版 本 使 用 的代码/存储库的永久链接https://github.com/ElsevierSoftwareX/SOFTX_2019_235法律代码许可证GNU通用公共许可证版本3.使用GIT的代码版本控制系统使用MATLAB的软件代码语言、工具和服务编译要求、操作环境依赖性 *MATLAB 2015a或更高版本(包括统计和机器学习)图像处理工具箱如果可用,链接到开发人员文档/手册问题支持电子邮件r. unsw.edu.au1. 介绍单细胞命运的选择是规范的关键步骤 胚胎谱系[1],癌症的发展[2],以及*通讯作者:新南威尔士大学生物医学工程研究生院,悉尼,新南威尔士州2052,澳大利亚。电子邮件地址: r.nordon@ unsw.edu.au(R.E. Nordon)。https://doi.org/10.1016/j.softx.2020.100440免疫反应[3]。为了理解单细胞命运的分子控制,需要跟踪细胞行为和亲属关系随时间变化的方法[4]。单细胞跟踪是一种强大的方法,用于从延时图像数据中记录单个细胞及其祖先的功能和分子动力学[5]。然而,缺乏软件和高度专业化的编程技能限制了细胞跟踪和谱系分析,2352-7110/©2020作者。 由Elsevier B.V.出版。这是一篇开放获取的文章,使用CC BY许可证(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)。可在ScienceDirect上获得目录列表SoftwareX期刊主页:www.elsevier.com/locate/softx2J.A. Cornwell,J.Li,S.Mahadevan等人粤ICP备1104440号-1Fig. 1. TrackPad软件框架。图二. TrackPad面向对象架构示意图几个专业中心。TrackPad是一个图形用户界面,它采用了交叉相关的模板匹配内核来半自动化细胞跟踪。该用户友好的软件包括用于全面注释细胞命运的工具,包括分裂、死亡和表型转变。使用该软件的研究者可以生成高质量的注释细胞轨迹和分裂谱系数据,以了解内在和外在因素如何影响细胞状态和命运[5]。2. 问题和背景细 胞 追 踪 文 献 发 展 良 好 , 有 超 过 3 , 000 , 000 篇 出 版 物( Google Scholar ) 。 目 前 有 几 种 可 用 的 跟 踪 工 具 , 包 括HoloMonitor [6,7]、tTt [5]、CellProfiler [8]、TrackMate [9]、Baxter算法[10,11]和LEVER [12],它们被分类为手动或自动细胞跟踪平台[13]。自动跟踪工具依赖于精确的分割和强大的方法来连接跟踪和检测细胞寿命事件,如细胞分裂或死亡[13]。即使是完美分割的图像,不同细胞类型的跟踪链接算法的性能也会有很大差异[14,15]。因此,自动跟踪要求用户识别并手动纠正与分割、轨迹链接和命运注释相关的错误。因此,尽管自动跟踪为用户提供了增加的吞吐量,但容易出错的应用程序可能不会在跟踪时间上提供实质性的改进。此外,大多数自动化算法需要图像分析方面的经验,以定制取决于细胞特征和图像对比度的多步工作流程[5,9]。我们确定了半自动跟踪软件的需求,并在自动化和手动校正之间进行平衡。此外,我们需要一个跟踪接口,可以由研究人员应用,而无需了解图像分析方法或编程。这促使我们发展J.A. Cornwell,J.Li,S.Mahadevan等人粤ICP备1104440号-13≤≤图三. 前进法。@tracker.FindCellState属性的定义以及TM算法和管理程序之间的交互(鼠标点击、下拉菜单和快捷键)。TrackPad;一款用于交互式、半自主细胞跟踪和注释的开源软件。TrackPad已在MATLABTM中实现,采用模块化设计,可确保轻松集成新功能或修改现有功能[16]。TrackPad也可以作为独立的可执行程序[16]。3. 软件框架TrackPad图形用户界面(GUI)是用于跟踪和注释单元格的交互式用户界面。最初,通过将来自最多三个单独通道的图像时间序列(*.tif格式)导入到通道混合工具中来创建ImageStack对象,该工具设置通道颜色,调整图像对比度,校正不均匀照明并平衡通道强度(图1)。①的人。将ImageStack对象加载到TrackPad GUI中后,单击鼠标和上下文相关的下拉菜单将用于导航图像堆栈和控制跟踪。下游工作流程包括谱系数据和细胞命运选择的统计分析[17,18]以及裁剪的单细胞图像的分割。互相关、模板匹配(CCTM)算法实现了监督跟踪,而不使用细胞分割(补充文本1)。当互相关分数低于用户定义的阈值时,该算法将控制权交给用户(图1)。 2)的情况。用户可以通过重新定位单元或继续自动跟踪来响应相反,用户可以通过鼠标点击来阻止自动跟踪,以校正互相关阈值测试未检测到的3.1. 软件构架该软件采用MATLABTM面向对象代码编写,增强了可读性、模块化和可重用性。该软件包括用于标记细胞起源、命运和表型的注释工具。使用工具导航和编辑轨迹数据库将细胞注释显示为系谱图。可以使用@avatar类对象(补充文本7)针对不同的细胞类型和图像序列调整CCTM算法,所述@avatar类对象模拟用于基准性能的用户跟踪动作(图5、图S4)。超过4500行代码被组织成图中所示的类层次结构。二、GUI由@TrackPad类封装(灰色框)。图像数据被加载到@ImageStack类(绿色框)中,该类包含图像数据并驻留在RAM中以便于使用鼠标 滚 轮 或 滑 动 条 在 电 影 中 快 速 导 航 。 跟 踪 数 据 和 跟 踪 方 法 由@TrackCollection、@tracker和@CellImage类(橙色框)封装。@tracker类使用CCTM算法(前向方法)执行自动跟踪,并包含表示为@CellImage对象的时间序列的细胞跟踪信息。@CellImage对象包含单元格位置、注释和跟踪结果,包括单个跟踪步骤的用户/处理器时间。所有单元格轨迹都包含在@TrackCollection对象中。@avatar类自动跟踪单元格,将单元格位置与地面实况(由用户和TrackPad生成的带注释的@TrackCollection对象)进行比较。@Avatar类对象用于估计跟踪器参数范围(搜索半径、相关阈值和椭圆半径)的跟踪精度和跟踪时间。@TrackNavigator类允许用户导航到单元格注释的分裂谱系(图。4).3.2. 软件功能3.2.1. 创建图像堆栈对象(培训视频1 [19,20])Trackpad将 *.tiff 图像从多达3个通道导入到@ImageStack对象中,在那里它们被打上时间戳并混合以形成彩色图像。叠加的明场和荧光通道帮助用户使用荧光基因报告基因或染色剂识别和注释 细 胞 结 构 和 功 能 。 CCTM 算 法 使 用 第 一 个 通 道 跟 踪 细 胞(@ImageStack.Stack,补充文本2和图S3),而映射的彩色图像存储在@ImageStack.CData和@ ImageStack. CMap中。3.2.2. 跟踪细胞(培训视频2 [21])GUI由@TrackPad类对象编码。用户使用鼠标点击、下拉上下文相关菜单和键盘快捷键命令与软件进行交互,这些命令可以替代@TrackPad方法(图11)。2、表1和图S1)。跟踪器结果和用户操作使用MATLAB事件和侦听器在@tracker和@TrackPad对象@ tracker类的forward方法实现了CCTM算法,该算法可以被用户中断,或者如果模板匹配失败,则可以通过机器生成的通知来中断(图2)。3)。forward方法还生成@Cellimage对象的时间序列,这些对象存储每个图像中每个细胞的跟踪信息。图3 说 明 了 监 控 程 序 和 CCTM 算 法 之 间 的 交 互 。@tracker.FindCellState属性的状态确定forward方法中的编程流。该状态取决于用户与GUI的交互(鼠标点击、下拉菜单选择,表1)和互相关系数0ρ1、一个相似性的度量,模板和下一个电影帧中的匹配(1是完全匹配)。用户通过用可编辑椭圆(i)环绕细胞核来开始跟踪。单击鼠标将@tracker.FindCellState设置为Go,这将启用使用getCellImage方法计算模板图像,然后执行CCTM算法(findCell方法);findCell返回ρ,以获得搜索区域内的最佳图像匹配,4J.A. Cornwell,J.Li,S.Mahadevan等人粤ICP备1104440号-1真)X∈X 1,X 2,X3,. . . ,X n. 跟踪性能是全-见图4。带注释的单细胞谱系。祖先是创始细胞。分叉代表细胞分裂。细胞表型在此使用细胞形状功能:R(圆形)、P(极化)定义。红色生命线突出显示选定的单元格轨迹。在观察到分裂或死亡之前停止实验之前,细胞命运未完成(NC)。表1右键单击上下文相关的快捷菜单与键盘热键。在选择一个单元格并点击开始跟踪后,完成跟踪过程所需的所有命令都 可以通过键盘或鼠标输入来实现。生成一个PauseEvent并将@tracker.FindCellState属性从Go更改为NULL。 在CCTM算法暂停的情况下,用户在恢复自动跟踪之前手动校正跟踪(热键c,表1)。如果单元格被跟踪到键盘动作描述输入镜像堆栈@tracker对象广播EndOfTrackEvent(s)停止音轨/选择音轨当跟踪器停止时,将停止跟踪器。当暂停时,将使所有跟踪的单元格可供选择这会将@tracker.FindCellState属性从Go更改为别说了(c)继续追踪如果追踪已暂停,stopped(c)将跟踪器状态设置为3.2.3. 编辑和注释曲目(培训视频3和4 [22,23])(r)重定位椭圆当跟踪暂停时(r)将允许用户重新定位跟踪椭圆可以选择单元格轨迹进行编辑或注释,(a)右键单击上下文相关菜单(表1),(d)删除曲目当选择了曲目(d)时,删除整个轨迹。而跟踪(d)将删除从从电影屏幕选择单元轨迹,(b)GUI轨迹面板列表框选择器,或(c)谱系导航器(主菜单)。通过用户定义它们的音轨来注释音轨以形成谱系(a)注释轨迹当前帧。当选择了一个轨迹时,(a)将允许用户注释轨迹起源(祖先或子代)和命运(分裂、死亡、丢失、不完整,表2),以及在(e)编辑曲目当选择了一个曲目(e)时,允许用户编辑曲目半径R搜索相关阈值ρ阈值用于确定如果匹配足够接近以继续CCTM算法:如果找到匹配(ii,p> p阈值),则将@CellImage对象附加到轨道@tracker.FindCellState保持在Go状态,并且将CCTM应用于下一电影帧。如果未找到匹配(iii,ρ ρ阈 值),则@tracker.FindCellState从Go更改为Lost,其中@tracker广播LostEvent。此消息由@TrackPad收听,它将控制权传递给可以使用鼠标编辑轨道的用户当用户完成手动更正并单击任何阶段,在细胞的寿命(表2,图。 4). 谱系导航器显示一个轨迹表,总结了轨迹ID、起源、结局和表型。点击该表的一行,显示所选细胞的谱系图(图10)。 4).3.2.4. 选择CCTM参数以优化性能(培训视频5、6和7 [24CCTM算法需要选择三个参数:模板大小(R核)、搜索半径(R搜索)和互相关阈值(ρ阈值)。可以使用@avatar类对象来模拟针对一系列跟踪参数的CCTM算法的性能。化身将其位置x∈{x1,x2,{x3,. . . ..继续导航菜单选项(热键c,表1),@tracker.FindCellState属性从Lost更改为Go,并恢复forward方法(ii)。当在自动跟踪期间观察到位置误差时,用户点击电影图像以暂停执行CCTM。这通过估计阳性预测性能,接收器操作特征(ROC)曲线和直接计时用户与软件的交互(图6)。用于对CCTM算法进行基准测试的分类器如表3所示,并在补充文本8中详细描述。J.A. Cornwell,J.Li,S.Mahadevan等人粤ICP备1104440号-15图五. 自动跟踪的性能和分析参数变化对跟踪精度和成本的影响。(A)自动跟踪性能COLO316细胞(左)饼形图显示了自动跟踪的Go、Lost和Turn事件总数的比例,以及(右)在Go、Lost和Turn中花费的总时间,并对事件进行自动跟踪。(B)显示自动跟踪、丢失和暂停单元格状态所用时间分布的箱形图。(C)R搜索对正预测值衡量的跟踪精度的影响绿色星号表示最大PPV和相应的R搜索值。(D)ρ阈值影响的ROC曲线在TPR和FPR上。圆圈表示给定ρ阈值的特定值的TPR和FPR。(E)显示ρ阈值变化对Go(绿色)、丢失(红色)和丢失(黄色)细胞状态相对于每个状态中花费的中值时间绘制。(F)成本函数指示使跟踪的相对成本最小化的ρ阈值TP、FN、FP和TN结局的成本分别为0、0.25、0.75和0。(G)累积直方图显示相对分布T P 、FN、FP和TN结果随相关阈值ρ阈值的变化而变化。绿虚线表示通过(E)中的成本函数最小化确定的ρ阈值的最佳值。(For在该图图例中,对颜色的参考的解释,读者可以参考网络这篇文章的版本)。6J.A. Cornwell,J.Li,S.Mahadevan等人粤ICP备1104440号-1=特征表2图六、 TrackPad和Baxter算法之间的轨迹长度分布比较。A. 箱形图B。相对频率。接下来,我们使用Cell Track评估了TrackPad的精度注释用于定义细胞起源、命运和表型。注释子集描述一个谱系的创始细胞定义挑战2D数据集[29]。Matula等人[30]描述了使用非循环定向图匹配度量(AOGM)来量化校正跟踪误差所需的工作量。该度量对顶点分割使用5的权重,对顶点分割使用10的权重命运不完整细胞没有分裂、死亡或丢失(NC)观察期分裂(DI)死亡(DE)死亡(细胞凋亡或坏死)丢失(LO)细胞移出视野或弹道不明添加,1用于顶点删除,1用于边删除,1.5用于边添加,以及1用于改变边语义。CCTM是一种监督交互式算法,用户定义的地面实况(即,AOGM跟踪精度①的人。 纠正轨迹所需的工作量直接表型用户定义用户定义的单元格类型表3观察到的细胞性质(例如,荧光)每个属性都分为子类型,例如:荧光∈ {GFP+, GFP−}通过计算用户在半自动跟踪过程中纠正错误所需的时间(图1),6)。TrackPad性能的详细分析显示了CCTM算法的阳性预测值,用于与表4所示的细胞追踪挑战参与者获得的最高评分进行比较。互相关用于CCTM算法基准测试的分类器 见图 二、ρ ρthreshX−xFindCellState结果 True False Lost TN
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