奥尔良大学生物学博士论文：线粒体配基蛋白的线粒体寻址片段的结构和功能

结构和功能线粒体配基蛋白的线粒体寻址片段奥尔良大学（University of Orleans）博士学校健康、生物科学和生命化学奥尔良分子生物物理学中心"生物分子的NMR：结构、动力学和相互作用"论文提交人：紫罗兰色支持日期：2012年11月23日获得学位：奥尔良大学博士学位学科/专业：生物学论文指导人：Céline LANDON奥尔良CNRS研究员报告员：Françoise GUERLESQUIN马赛CNRS研究总监Olivier LEQUIN巴黎第六陪审团：阿兰·勒格朗奥尔良大学教授评审团主席Françoise GUERLESQUIN马赛CNRS研究总监Olivier LEQUIN巴黎第六Marie-Christine AVERLANT-PETIT，CNRS南希研究员Céline LANDON奥尔良CNRS研究员23谢谢你首先要感谢Céline Landon，她同意委托我做这篇论文，并指导我的研究。所有这些年并不总是一条平静的河流，但它们充满了经验和美丽的相遇，无论是科学的还是个人的。对于这一切，再次感谢。感谢 陪审团的 其他成 员，先生。勒昆，Averrant-Petit夫人，先生。罗格朗 和Guerlesquin夫人同意评判我的作品。特别感谢Françoise Guerlesquin，因为如果我没有通过你的团队发现并欣赏核磁共振，我就不会来奥尔良感谢这个项目的不同资助者：CNRS和地区中心为我提供了博士奖学金，抗癌联盟为Mitogaligine项目提供了奖学金，TGIR网络为波尔多的NMR实验提供了奖学金。感谢所有参与mitogaligine项目的人。感谢Agnès Delmas和她的团队向我介绍了化学合成和液相色谱纯化的乐趣，特别感谢Dominique Lelièvre回答了我所有的问题。感谢Alain Legrand的整个团队，他们欢迎我生产mitogaligin，特别是感谢Martine Dubois培养了大量细菌，感谢Thierry Normand监督我的监测工作。感谢Sandrine Villette在圆二色性和荧光实验中对我的支持。感谢大卫·戈塞特在一天中的任何时候对所有这些细胞进行显微注射。感谢Guillaume Gabant一直接受我的样品。感谢Erick Dufourc和他的团队感谢CBN生物分子NMR团队的所有成员，感谢他们在科学层面上的帮助，也感谢他们创造了一个非常愉快的工作环境。感谢Hervé Meudal，他很好地分享了他的办公室，并让我穿上了登山靴。特别感谢弗朗索瓦丝·凯塔-帕奎特，感谢她在席琳不在的时候接手。感谢Karine Loth的校对和网球比赛。感谢所有其他团队成员，过去和现在，特别是Laurence Jouvensal、Fanny Meindre和Rémy Le Meur，感谢他们围绕美食咖啡休息时间的讨论。感谢这些年来我遇到的每一个人。感谢Samia Aci-Sèche为我们所有的谈话和电影之旅，扮演出租车让我交了一个非常好的朋友。感谢Norbert Garnier、Bertrand Castaing和Franck Coste，感谢他们每天敲响食堂的钟声，让午餐成为一段美好的时光。感谢我遇到的博士生、博士后和实习生，最后，感谢我所有的家人5目录缩略语列表9论文的目标13A部分。导言15A.1细胞凋亡现象。.................................................................................................... 15A.1.1程序性细胞死亡，生命所必需的。.............................................................15A.1.2细胞增殖和细胞死亡之间的微妙平衡16A.1.3不同的途径导致细胞凋亡。.........................................................................16A.2线粒体的内在途径................................................................................................ 19A.2.1线粒体，一种特殊的细胞器19A.2.2线粒体凋亡，一个两步过程。..................................................................... 25A.2.3Bcl-2家族对细胞凋亡的调节.........................................................................30A.3有丝分裂素，一种原始的促凋亡蛋白35A.3.1人类基因.........................................................................................................35A.3.2线粒体配基素：一种线粒体凋亡蛋白.............................................................A.3.3线粒体蛋白质的寻址。................................................................................. 41B部分材料和方法。.................................................................................................49B.1通过液相肽合成生产蛋白质。............................................................................ 49B.1.1肽的循环合成原理.........................................................................................49B.1.2肽的合成方案.................................................................................................51B.1.3有丝分裂素的产生.........................................................................................52B.2通过重组细菌........................................................................................................ 54B.2.1在细菌中表达。.............................................................................................54B.2.2蛋白质的提取和纯化.....................................................................................55B.3片段的细胞毒性活性研究B.3.1在培养基中孵育56B.3.2显微注射实验56B.4存在膜介质的生物物理学研究。........................................................................ 57B.4.1所用膜介质的制备.........................................................................................576B.4.2圆二色性59B.4.3荧光光谱学.....................................................................................................60B.4.4液体NMR 61B.4.5固体NMR 64B.4.6导波等离子体激元共振光谱（PCR）70C部分寻址片段73的结构和功能研究.........................................................................C.1通过化学合成........................................................................................................ 73C.1.1有丝分裂素片段[31-53]的合成.....................................................................73C.1.2线粒体寻址片段突变体的合成。.................................................................74C.1.3细胞配蛋白片段的产生.................................................................................75C.1.4罗丹明的加入.................................................................................................76C.2靶向片段细胞毒性活性的探索。........................................................................ 78C.2.1有丝分裂素片段[31-53]的细胞毒性.............................................................78C.2.2细胞位置依赖性活动79C.2.3一种有效的促凋亡肽？.................................................................................82C.3肽/膜相互作用的生物物理学研究。...................................................................83C.3.1膜环境的不同模型.............................................................................................C.3.2环境对肽88C.3.3肽在膜介质中的掩埋97C.3.4肽对磷脂膜的影响106C.4线粒体寻址片段124的研究结论..............................................................................C.4.1已确认的细胞毒性.......................................................................................124C.4.2没有规范的结构，但有一个特定的折叠...................................................124C.4.3肽在膜中的嵌入。.......................................................................................127C.4.4肽对脂质动力学的影响。...........................................................................128C.4.5一种人细胞毒性肽，膜不稳定剂。...........................................................129D部分。Mitogaligin 131的研究........................................................................................D.1131标记蛋白的产生..................................................................................................D.2有丝分裂素在细菌.............................................................................................. 132D.2.1质粒pSh-HIS-LS。......................................................................................... 1327D.2.2生产和纯化方案133D.2.3最小培养基方案的应用...............................................................................134D.3通过化学合成...................................................................................................... 135D.3.1通过化学连接生产。...................................................................................135D.3.2片段的产生[1-53]-SR。................................................................................136D.3.3片段的产生[54-97]。...................................................................................137D.3.4两个有丝分裂素片段的天然连接。...........................................................137D.4氧化还原138D.5有丝分裂素的作用机制。.................................................................................. 138E部分总体结论和展望。.......................................................................................139附录1 -合成肽的表征141附录2 -................................................................................................................................145附件3 -口头和书面来文。................................................................................................146参考书目1679缩写列表ACN：丙酮ADP：腺苷二磷酸AIF：细胞凋亡诱导因子APD：抗菌肽数据库ATP：三磷酸腺苷Bcl-XL/Bcl-2相关死亡Bak：Bcl-2拮抗剂杀手BX：BCL-2拮抗剂X套装Bcl-XL：Bcl-2 XLongBFK：Bcl-2家族亲属BCC-2同源区投标：BH3相互作用域死亡拮抗剂BMF：Bcl-2修饰因子BOK：Bcl2相关卵巢杀手半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶CD：圆形二色性CL：心磷脂COSY：相关光谱CSD：化学位移偏差CTMP：羧末端调节蛋白DCM：二氯甲烷DHPC：1，2-二己酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱Diablo：低pI直接IAP结合蛋白DIEA：二异丙基乙胺DISC：死亡诱导信号复合物DLS：动态光散射N，N-二甲基甲酰胺DMPC：1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油醛-3-磷酸胆碱DO：光密度DCP：十二烷基-磷酸胆碱Drp1：动力学相关蛋白1DTT：二硫苏糖醇EDTA：四乙酸乙二醇二胺EGTA：乙二醇四乙酸Erv1：呼吸和植物生长所必需的Fis1：线粒体分裂蛋白110缩写列表galig：半乳凝素-3内部基因GdmHCL：盐酸胍GTP：三磷酸鸟苷GUV：巨单层囊泡HATU：2-（1H-7-氮杂苯三唑-1-基）-1，1，3，3-四甲基铵六氟磷酸盐HBTU：2-（1H-苯并三唑-1-基）-1，1，3，3-四甲基铵六氟磷酸盐亨丽埃塔·莱克斯HOBt：N-羟基苯并三唑高效液相色谱HRK：harakiri热休克蛋白（HSP）HSQC：杂核单量子相干性HtrA2：高温必需蛋白A2IAP：凋亡蛋白IMS：膜间空间IPG：异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷LB：卢里亚·贝尔塔尼LUV：大单层血管Mcl-1：骨髓细胞白血病序列1Mfn：丝裂霉素Mia40：线粒体IMS组装蛋白40Mim 1：线粒体输入蛋白1MISS：线粒体IMS-分类信号mitoPLD：线粒体磷脂酶DMLV：多层囊泡MPAA：4-羧甲基-噻苯酚线粒体渗透性过渡孔NCL：天然化学连接NMPs：N-甲基热解烷酮NOESY：核过豪泽效应光谱学P/L：肽/脂质PBF：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰PBS：磷酸盐缓冲盐水PC：磷脂酰胆碱PE：磷脂酰乙醇胺PEGA：聚[丙烯酰-双（氨基丙基）聚乙二醇]POPC-d31：1-棕榈酰（d31）-2-油酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱PUMA：p53上调的凋亡调节因子PW：导波等离子体共振NMR：核磁共振11缩写列表SAM：分拣和装配机械SDS：十二烷基硫酸Smac：第二个线粒体衍生的半胱氨酸酶激活剂SPPS：SPD：表面等离子体共振 SUV：小单层囊泡TAMRA：5-（和-6）-羧四甲基罗丹明TBuild：截短的BH3相互作用结构域死亡激动剂tBu：叔丁基TCEP：三（2-羧乙基）-膦酸TFA：三氟乙酸TFE：三氟乙醇TIM：内膜易位TIS：三异丙基乙烷TNF：肿瘤坏死因子TOCSY：总相关光谱TOM：外膜易位Tris：三-（羟甲基）-氨基甲烷Trt：三苯甲基（三苯甲基）紫外线：紫外线VDAC：电压依赖性阴离子通道13论文的目标我的论文工作集中在研究一种参与细胞凋亡的新蛋白质--有丝分裂素，更具体地说，是它的线粒体寻址片段。线粒体配基素是一种97残基蛋白，通过内在线粒体途径触发细胞凋亡。该项目的目标是在原子水平上了解其对线粒体膜的作用机制。有丝分裂素的完全原始序列及其特殊的氨基酸组成（12Ag和12Trp）使得任何2D或3D结构预测都不成功，使其成为结构生物学研究的理想候选者。线粒体配基蛋白对线粒体膜的靶向片段具有位于蛋白质内部的特征，它对应于片段[31-53]。该肽本身具有与整个蛋白质相似的细胞毒性功能。这就是为什么我把我的论文工作集中在研究这个线粒体寻址片段上。本文的目标如下：-获得关于线粒体寻址片段作用机制的第一个数据-开发研究整个蛋白质所需的不同生物物理技术-启动全在"引言"一章中，我将介绍细胞凋亡现象在"材料和方法"一节中，我将描述我在论文中熟悉的不同技术，通过在固体载体上的化学合成或在细菌中的表达来生产肽和蛋白质，然后研究膜介质中的寻址片段：荧光、圆二色性、液体NMR、固体NMR和导波等离子体共振。这些结构研究得到了全细胞功能研究的补充，我也将描述这些研究。在"靶向片段的结构和功能研究"一节中，我将介绍一些结果，这些结果使我们能够提出关于靶向片段的一些问题，特别是关于它的作用方式和心磷脂所起的作用。培养基对肽的结构有什么影响？地址片段如何与不同组成的模型膜介质相互作用？它是如何被埋在膜中的？但是，肽对膜的动力学和脂质组织有什么同时，14论文的目标对线粒体寻址片段所做的工作为对整个线粒体配基蛋白进行相同类型的研究铺平了道路。然而，这种蛋白质的生产存在许多困难。因此，在研究片段的同时，我还参与了整个有丝分裂素生产方案的开发，我将在"有丝分裂素研究"一章中介绍该方案在总体结论之后，关于合成肽表征的附录以及与本工作相关的口头和书面通信列表将补充本手稿。15A部分。简介A.1细胞凋亡现象A.1.1 程序性细胞死亡，生命所必需的。"凡事都有时间：出生的时间和死亡的时间。»这句谚语完全可以应用于我们的细胞。不断更新，细胞有一个生命周期 编程， 谁变化 以下是 他们 功能（Renehan等人，2001）：肠上皮细胞约5天，肺细胞约6个月（Blanpain等，2007年）。因此，细胞死亡，也称为凋亡，是细胞生命周期不可或缺的一部分。这种必要的疾病允许消除老化或受损的细胞，这些细胞可能对我们的身体有害（Norbury等人，2001年）。程序性细胞死亡也是生物体发育的重要工具例如，在胚胎发育过程中，细胞凋亡被用来塑造我们的身体。最初，胚胎的手和脚是有掌状的：细胞凋亡允许去除趾间软骨细胞，从而导致手指的形成（Jacobson等人，1997年）。在大脑形成过程中，神经网络产生许多突触连接：凋亡允许消除没有形成有用连接的神经元（Nijhawan等人，2000年）。这同样适用于未产生特异性抗原的免疫系统细胞（Osborne，1996）。图1 -细胞凋亡在生物体发育中的含义的实例（Jacobson等，1997年）。结构的形成（A和B）和消失（C和D）。消除多余（E）或异常（F和G）细胞。细胞内稳态通过两个过程之间的平衡来维持。对应于细胞增殖的第一个过程对于替换被第二个过程（凋亡）消除的细胞是必不可少的（Renehan等，2001年）。因此，我们不能谈论细胞死亡而不讨论它的对应物，即细胞增殖。16简介A.1.2 细胞增殖和细胞死亡之间的微妙平衡。增殖和程序性死亡是我们的身体通过基因控制根据其需要不断调节的两种现象。由大约100个基因控制的乳腺发育就是一个很好的例子（Hennighausen et al.，2005年）。在孕妇中，乳腺细胞的增殖被触发，为即将因此，在细胞的增殖和程序性死亡之间存在永久和动态的平衡。然而，这种平衡有时会被打破，导致许多病理学的发展，通常具有致命的结局（Elmore，2007）。有利于细胞死亡的不平衡对应于凋亡的过度激活。例如，这可能引发阿尔茨海默氏症或帕金森氏症中的神经元变性，或I型糖尿病中胰腺细胞的破坏。最后一个例子是以T4淋巴细胞为靶点的艾滋病病毒：细胞增殖的过度激活也对身体有害。过度活跃的免疫系统会不受控制地产生有缺陷的细胞，这些细胞会转而反对身体：这种现象是自身免疫性疾病的起源，如关节炎或多发性硬化症。细胞凋亡的缺陷因此，更好地了解细胞凋亡是如何发生的有助于理解所有这些病理，但也有助于开发对抗它们的新工具（Fadeel et al.，2005年）。A.1.3 不同的途径导致细胞A.1.3.1 细胞凋亡的不同阶段细胞死亡可由细胞内部或外部的不同刺激触发（图2）。这个启动阶段之后是一个决定阶段，在这个阶段，细胞整合不同的死亡信号。来自Bcl-2家族（B细胞淋巴瘤2）的蛋白质负责调节该阶段，以决定细胞是否可以存活或是否必须被消除（Duvall等人，1986年）。凋亡的最后阶段17简介图2 -细胞凋亡的不同阶段A.1.3.2 L’induction deL’induction de l’apoptose peut emprunter trois voies différentes, mais pas totalementindépendantes (这些不同的途径都在同一点结束：半胱氨酸蛋白酶的活化（Taylor等人，2008年）。图3 -细胞凋亡的不同触发途径（Sheridan等，2008年）。18简介第一条外源性通路也称为"死亡受体通路"（图3）。配体将激活存在于细胞外膜上的TNF（肿瘤坏死因子）受体（Bhardwaj等，2003年）。这些死亡受体具有细胞质结构域（死亡结构域），其允许募集其它蛋白质（Lavrik等，2005年）。特别地，它们可以形成两种类型的复合物，DISC和TRADDOSOME，然后负责L’activation de la caspase-8 peut entraîner l’activation de la caspase-3, conduisantdirectement à la phase d’exécution de l’apoptose ; afin d’amplifier le phénomène, elle peutégalement induire la voie intrinsèque mitochondriale, à travers l’activation de la protéine Bid(Elmore,第二种外源性途径由细胞毒性T淋巴细胞触发（图3）。这些免疫系统细胞可以分泌穿孔素。该蛋白质作为跨膜通道的同二聚化允许也由淋巴细胞分泌的颗粒酶B的细胞质注射（Trapani等，2002年）。一旦进入细胞，Granzyme B能够直接激活半胱氨酸蛋白酶-3，但它也可以通过线粒体途径触发凋亡：因此它能够直接和间接触发细胞死亡（Goping等人，2003年）。第三种也是最后一种途径对应于线粒体内在途径，由党团蛋白Bcl-2触发和调节（ Cory 等 ， 2002 年 ; Chipuk 等 人 ， 2010 年 ） 。 L’induction de l’apoptose via lesmitochondriesentraînedenombreusesmodificationsauniveaudesmembranesmitochondriales,provoquantnotammentlaperméabilisationdesmembranesavecl’ouverture de pores (mPTP) et la perte du potentiel所有这些变化都导致促凋亡分子的释放，通常被隔离In空间膜间线粒体（Saelens等人，2004年）。这些分子在细胞质中的积累可通过两种途径导致细胞死亡（Cregan等，2004），取决于或不取决于半胱氨酸蛋白酶图4 -通过内在线粒体途径触发细胞2004年）。19简介第一种途径对应于启动激酶级联反应：它从激活激酶-9开始，然后激活激酶-3。这种级联反应可以直接触发，如细胞色素c与Apaf-1相互作用，从而募集半胱氨酸蛋白酶原-9：这三种分子形成一种称为"细胞色素c"的复合物。"凋亡体"，能够激活半胱氨酸蛋白酶-9。它也可以由Smac/Diablo和Omi/HtrA 2蛋白间接触发，这些蛋白失活细胞凋亡抑制剂D’autres molécules relarguées par la mitochondrie peuvent agir au niveau du noyau, etformer ainsi la seconde voie d’apoptose mitochondriale, indépendante des caspases :arrivées au noyau, l’AIF et l’endonucléase G entraînent des fragmentations de l’ADN et unecondensation de la如果外源性途径需要细胞外的刺激，则内源性线粒体途径可由细胞本身触发，但也可由外源性途径触发，以A.2线粒体的内在途径我们已经看到线粒体在细胞凋亡现象中起着重要作用（Green等人，2004年;Orrenius，2004年）。C’est pourquoi nous allons revenir sur certaines particularités de cetorganite, avant de décrire plus précisément la régulation et le déclenchement de l’apoptosepar la voie intrinsèqueA.2.1 线粒体，一种非常特殊的细胞器。A.2.1.1 从细菌遗传下来的结构。线粒体是真核细胞的特异性细胞器。内共生理论（Margulis，1970）假设线粒体最初是一种细菌，被真核细胞内吞：在共生中生活，它最终使自己成为宿主功能所必需的，成为一个成熟的细胞器。这一理论得到了线粒体的几个特征的支持，第一个特征是这个细胞器有自己的DNA，不同于核DNA。系统发育研究表明，这种线粒体DNA与α-变形菌的线粒体DNA密切相关（Andersson等人，1998年）。与细菌的另一个联系是通过观察线粒体的结构来建立的。事实上，电子显微镜显示存在两种膜（Palade，1953; Sjostrand，1953）：内膜可能对应于原始细菌的膜，外膜对应于内吞作用膜。最后，真核细胞膜上外源磷脂的存在支持了20简介线粒体的第一次描述可以追溯到20世纪50年代（图5）。这种细胞器有两层膜：一层是外膜，离子和小分子可以透过，另一层是内膜，它形成了一个真正的屏障，只允许与转运蛋白偶联的分子通过。内膜形成一个复杂的结构，折叠成内陷，称为线粒体嵴。有两个不同的液体隔室：图5 -线粒体的结构http://micro.magnet.fsu.edu电子显微镜技术的进步已经允许观察和测量膜之间的近似区域（Perkins等人，1997年）。因此，内膜和外膜有时在接触位点融合，线粒体峰可通过峰连接位点闭合（图6）。山脊连接部位联系人站点图6 -线粒体的超结构（Perkins等人，1997年）。