Mg掺杂羟基磷灰石中Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys多肽对MSC归巢的影响

33工程3（2017）55研究组织工程-文章Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys多肽在Mg掺杂羟基磷灰石Alessandro Pistonea，*，Daniela Iannazzoa，Claudia Esproa，Signorino Galvagnoa，Anna Tampierib，Monica Montesib，Silvia Panserib，Monica Sandriba工程系，墨西拿大学，墨西拿98166，意大利b意大利国家研究委员会陶瓷科学技术研究所，意大利法恩扎ARt i clEINf oA b s tRAC t文章历史记录：接收日期：2016年10月142017年1月13日修订2017年1月16日接受2017年2月20日在线发布干细胞归巢，即间充质干细胞（MSC）的招募到损伤组织，是非常有效的体内骨再生。为了探索在镁掺杂的羟基磷灰石（HA）上掺入模拟肽序列是否可以调节MSC的归巢，从而诱导细胞迁移到特定位点，我们用两种趋化/触聚因子共价功能化MgHA盘：纤连蛋白片段III-C人（FF III-C）或pep-人（FF III-C）。1 1保留字：镁掺杂羟基磷灰石骨髓间充质干细胞趋化/趋触因子骨组织工程标签序列Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys，一种能够与整联蛋白跨膜受体结合的纤连蛋白类似物通过3-（4，5-二甲基-噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑（MTT）试验分析的MSC存活力的初步生物学评价表明干细胞响应于移植的趋触性刺激而迁移到MgHA盘© 2017 The Bottoms.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版这是CC BY-NC-ND下的开放获取文章许可证（http：//creati v ecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍近几十年来，基于生物材料的组织工程开发取得了重要进展，其形式是能够恢复，维持或改善器官功能的替代品[1]。预期寿命的增加需要科学的努力来关注自然骨愈合过程和相关并发症。由于其无限供应，工程化骨组织代表了传统骨移植物的潜在替代品;此外，它们没有疾病传播的风险[2，3]。骨组织工程的努力主要集中在通过细胞治疗和生物材料的组合诱导功能性骨再生，生物材料包括陶瓷以及具有不同机械性能、降解速率和化学功能的不可降解和可生物降解的聚合物[4合成羟基磷灰石（HA）陶瓷因其高生物相容性和骨传导性而广泛用于人体植入物涂层[10HA是一种关键的矿物质成分，骨和牙齿组织，并在晶格中具有多种离子取代，包括CO2这些取代不仅改变了HA结构的空间群、形态、稳定性和力学性质，而且对骨细胞的生物学反应也很重要例如，碳酸盐（CO 2-）促进磷灰石晶体的生长，而镁（Mg）通过在骨生成的早期刺激成骨细胞增殖来增强骨代谢，如观察到的Mg消耗导致骨脆性和骨丢失所证明的[13] 。 具 有 低 水 平 Mg 的 磷 灰 石 和 磷 酸 钙 植 入 材 料 （ 即 ，MgHA），以及具有Mg和B型碳酸盐的共取代的仿生材料取代磷酸盐），增强HA结构的生物活性[14]。对这些纳米尺寸生物材料的支架结构的纳米级控制允许更好地理解细胞类型特异性对形貌特征的敏感性，从而即使在临床上不可能时也能够包含蛋白质和生长因子，并导致复杂的多组织再生[15]。* 通讯作者。电子邮件地址：pistone@unime.ithttp://dx.doi.org/10.1016/J.ENG.2017.01.0072095-8099/© 2017 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。 这是CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http：//creati v ecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect工程杂志主页：www.elsevier.com/locate/eng56A. Pistone等人/工程3（2017）55干细胞归巢方法涉及将间充质干细胞（MSC）募集到损伤组织，由于其对骨再生具有鲁棒性，因此在不同的基于支架的组织工程策略中引起了人们的兴趣in vivo.归巢因子，如趋化因子、选择素和整合素，共价结合或吸收到陶瓷或聚合物支架中，实际上可以允许MSC作为骨祖细胞参与骨纤连蛋白（FN）（I、II或III型）是细胞外基质（ECM）中的主要糖蛋白，并且是细胞表面分子的整合素家族的成员，其参与各种细胞事件，如细胞粘附、生长、迁移和成骨细胞的分化。III型FN具有含有Arg-Gly-Asp（RGD）基序的中央细胞结合结构域（CCBD）。这种特殊的结构域赋予细胞粘附[19]。含有RGD基序的特定肽序列通常用于增强整合素介导的细胞粘附。在本出版物中，我们报告了我们对用两种趋化/触变性因子包被MgHA盘：人纤连蛋白片段III1-C（FF III1-C），或肽序列Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys，一种能够结合整联蛋白跨膜受体的FN类似物。这些因子通过双功能间隔基（3-氨丙基）三乙氧基硅烷（APTES）的共价锚定防止它们从植入部位代谢和迁移，并允许严格控制生物分子的空间取向。为了探索将这些模拟肽序列掺入MgHA是否调节MSC的归巢，从而诱导细胞迁移到特定位点，我们进行了初步的体外研究。2. 材料和方法商业溶剂和试剂不经进一步纯化而使用。FF III1-C和Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys肽序列获自Sigma-Aldrich。MgHA按照先前报道的程序合成[14]。将MgHA粉末成形为圆盘（直径：8 mm;高度：3 mm;重量：300 mg/片），使用2.5 ×10 ~5 kPa，室温下真空干燥保存。X射线衍射（XRD）分析用Bruker D8 Advance衍射仪使用镍过滤的CuKa辐射进行。将衍射峰与粉末衍射标准品联合委员会（JCPDS）数据进行了比较。扫描电子显微镜（SEM）在15kV下操作的FEI Quanta 450 FEG仪器上进行。用JEOL JEM-2010透射电子显微镜（LaB6电子枪）在200 kV下进行透射电子显微镜（TEM）分析。使用Gatan 794多扫描电荷耦合器件（CCD）照相机来获得数字图像。使用TA Q500仪器在氮气下以10 °C/分钟的速率从100 °C至1000 °C进行热重分析（TGA）。在傅里叶变换红外（FTIR）光谱仪（Perkin-Elmer 2000）中对KBr基粒料进行红外分析。用ThermoNicolet Evolution 500分光光度计分析紫外（UV）光谱。在双和非官能化圆盘中的所有MgHA官能化合成用作对照。所有细胞处理程序均在无菌层流罩中进行将培养的细胞在37 °C和5%CO2下孵育。2.1. MgHA-APTES圆盘MgHA-APTES圆片的合成是通过将MgHA圆片浸入1 mol·L-1的APTES干溶液中进行的。己烷（50 mL），同时在室温下搅拌3 h用己烷洗涤样品，并在40 °C下在真空下进一步真空干燥24小时。通过分析暴露在盘表面上的游离氨基（NH2）的浓度（Kaiser测试）来评估接枝到盘上的APTES的量。2.2. MgHA-APTES-CFF盘以 类 似 于 上 述 功 能 化 程 序 的 方 式 ， 用 FF III1-C （ 10µmol·LMgHA APTES CFF 10 （ 10 μmol·L-1 FN ） 和 MgHAAPTES CFF 100（100 μ mol·L结合到MgHA-APTES表面上的纤连蛋白的量通过核磁共振（NMR）光谱来评估2.3. MgHA-APTES-CFP盘使MgHA-APTES盘与在PBS（50 μL或500 μL）中的Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys肽序列（10 μmol·L-1或100 μmol·L-1）的溶液相互作用0.138 µmol）在37 ℃下搅拌3 h。功能化后的MgHA APTES CFP10（趋化因子：肽）（肽序列浓度为 10 μmol·L结合到MgHA-APTES表面上的肽的量通过使用NMR光谱法测量洗涤溶液中有机官能团2.4. 初步体外试验将来自小鼠的MSC（C57 BL/6 mMSC，Gibco）在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（100 U·mL-1/100 μg·mL-1 ） 的 Dulbecco 改 良 Eagle 培 养 基 （ DMEM ） （ Gibco ，GlutaMAX补充剂）中培养将细胞在37 °C和5%CO2下培养。使用Tripsinization将细胞从培养瓶中分离。将分离的细胞进一步离心并重悬。台盼蓝染料排斥试验用于分析细胞数量和活力。将每个基于MgHA的盘用PBS洗涤三次，每次10分钟。空气干燥的样品在层流罩中通过UV灭菌20 min。将单个样品置于24孔板的单独孔将MSC（5 ×103）接种到与盘直接接触的8 μm孔径的24孔插入物（聚对苯二甲酸乙二醇酯膜，Corning）在1 × PBS中制备5 mg·mL-1的3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化培养3天后，将插入物移至新的平板中，在500μg·mL-1 MTT中于37 °C孵收集培养基，用1 mL二甲基亚砜孵育细胞15 min。在MTT试剂中，代谢活性细胞和四唑盐反应产生甲瓒染料。使用Multiskan FC微孔板光度计（Thermo Scientific）在570 nm的λmax处测量的吸光度与代谢活性细胞的数量相关[20]。A. Pistone等人/工程3（2017）55573. 结果和讨论3.1. MgHA-APTES圆盘用于MSC归巢到Mg掺杂的HA盘上的趋化/单趋化因子的固定化策略涉及APTES在无水己烷中的接枝。通过表面OH基团和从水解的APTES获得的硅烷醇之间的偶联反应发生的用APTES的表面功能化允许插入氨基，所述氨基是本研究中使用的肽的固定化所需的（图1）。①的人。硅烷化过程后插入的氨基的量在与茚三酮反应后通过分光光度定量（Kaiser试验）进行评价经正己烷洗涤和干燥后，测得NH2直接在MgHA和MgHA-APTES盘上进行XRD分析。 如图 2，MgHA样品的结晶度通过两个样品在26°处出现的特征衍射峰确认，30°(211)、（112）、（300）、（202）、（310）、（222）、（213）和（004）反射羟基磷灰石晶体的平面（PDF 09-0432）。使用SEM和TEM表征基于MgHA的样品的表面形态;在表面硅烷化过程的化学处理之后，在Mg掺杂的HA上没有发生显著的形态变化（图1A和1B）。第3和第4段）。3.2. MgHA-APTES盘与MSC归巢因子细胞归巢因子FF III1-C或Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys肽序列在Mg掺杂的HA盘上的固定通过以下之间的经典偶联反应实现： 暴露于磁盘表面的氨基和羧基图1.一、MgHA-APTES盘的合成方案。RT：室温。图二、MgHA和MgHA-APTES盘的XRD光谱。图3.第三章。（a）MgHA和（b）MgHA-APTES样品的SEM图像。图四、（a）MgHA和（b）MgHA-APTES样品的TEM图像。58A. Pistone等人/工程3（2017）55当使用EDC/ NHS作为偶联试剂时，来自肽序列的功能性被激活（图5）。为了测试细胞归巢因子的浓度对细胞归巢因子的影响，FF III1-C和肽序列均以10 μmol·L-1或100 μmol·L-1的两种不同浓度加载，从而提供两种肽缀合的样品，MgHA-APTES-CFP 10和MgHA-APTES-CFP 100，以及两种FN缀合的为了确定官能化反应有效性，使用TGA来确认官能化材料上存在另外的有机部分。图6显示了不同的形状与MgHA、MgHA-APTES、MgHA-APTES-CFP 100和MgHA-APTES-CFF 100相关的TGA。每个样品的官能化程度，显示为在惰性气氛下在500 °C下的重量损失百分比，揭示了MgHA盘表面上有机质量的增加。与前体MgHA样品相比，MgHA-APT- ES观察到5%的重量损失，而肽-和FN-缀合的样品观察到更高的重量损失（MgHA-APTES-CFP 100为8%，MgHA-APTES-CFF 100为10%）。为了进一步表征具有肽序列的MgHA盘的共价生物官能化，进行FTIR分析 图 7报道了未官能化的MgHA、MgHA-APTES 和MgHA-APTES-CFF 100样品的FTIR光谱。 所有光谱均在磷酸盐基质的556 cm-1、596 cm-1和1017 cm-1处显示吸收峰。在MgHA-APTES样品中，可以观察到在2930 cm-1（来自CH 2伸缩）和在1560 cm-1和1460 cm-1（由于脂肪伯胺的N-H弯曲）处存在另外的新谱带对于MgHA-APTES-CFF 100样品中，在1640 cm-1处观察到额外的峰此外，在3440cm-1处的峰3.3. 初步体外生物学评价通过MTT试验分析接种后3天 mMSC活力的初步生物学评价（图8）。接种到插入物中并与MgHA-CFP和MgHA-CFF盘直接接触的代谢活性细胞的定量显示干细胞数量减少，与非功能化MgHA盘和仅细胞组一致;因此，结果表明细胞响应于移植的细胞归巢基序而通过插入物迁移到盘这项研究提供了一个平台，是基于众所周知的骨传导镁羟基磷灰石，结合栓系细胞归巢刺激。众所周知，在某些病理学中，特别是那些与衰老有关的病理学（例如，在肿瘤部位），内源性MSC的数量急剧减少。因此，有必要将MSC吸引到强烈需要它们的特定解剖部位。目前的药物治疗，无论是单独使用还是与生物材料（例如，骨水泥、颗粒和3D支架），无法恢复患者的活动能力和生活质量，社会成本高昂。所提出的方法显示了将参与MSC归巢的特定基序嫁接到MgHA上的可能性所得到的功能化生物材料代表了复杂治疗的构建模块，通过该复杂治疗，同时可以增强内源性生物材料的生物活性。图五、合成MgHA-APTES-CFP和MgHA-APTES-CFF的方案。试剂和条件：Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys或FF III1-C，EDC·HCl，NHS，PBS，3 h，37 °C。图六、Mg H A 、MgHA-APTES、MgHA-APTES-CFP 100和MgHA-CFP 100的TGA曲线APTES-CFF 100样品。图7.第一次会议。MgHA、MgHA-APTES和MgHA-APTES-CFF 100的FTIR光谱。A. Pistone等人/工程3（2017）5559见图8。mMSC的MTT测试，在接种到与盘直接接触放置的插入物中后3天。仅细胞组用作对照。MSC迁移并为MSC在特定骨细胞（即，成骨细胞）。4. 结论为了探索在Mg掺杂的HA上掺入模拟肽序列是否可以调节MSC归巢，我们已经报道了用两种趋化/趋触因子移植MgHA盘：FF III1-C或Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys肽序列，其是能够结合整联蛋白的FN类似物。将10 μmol·L-1或100 μmol·L-1的细胞归巢因子通过MTT试验分析的mMSC活力的初步生物学评价表明，干细胞响应于移植细胞归巢刺激而通过插入物迁移到MgHA盘。虽然深入了解MSC归巢所涉及的生物分子的复杂途径是必要的，但这项初步研究为实现可转化为临床的骨组织再生有效治疗结果开辟了新的机会。遵守道德操守准则Alessandro Pistone 、 Daniela Iannazzo 、 Claudia Espro 、Signori- no Galvagno、Anna Tampieri、Monica Montesi、SilviaPanseri和Monica Sandri声明他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。引用[1] Laurencin CT，Khan Y.再生工程Sci Transl Med 2012; 4（160）：160ed9.[2] Amini AR，Laurencin CT，Nukavarapu SP.骨组织工程：最近的进展和挑战。Crit Rev Biomed Eng 2012;40（5）：363[3] Dawson JI，Kanczler J，Tare R，Kassem M，Oreffo RO.简要回顾：弥合差距：骨再生利用骨骼干细胞为基础的战略，我们现在在哪里？干细胞2014;32（1）：35[4] 王平，赵玲，刘军，魏伟，周晓，徐宏华。纳米结构磷酸钙生物材料与干细胞的骨组织工程。骨研究2014;2：14017。[5] 龚涛，谢军，廖军，张涛，林S，林Y.纳米材料与骨再生。骨研究2015;3：15029。[6] [10] Jiangsu C， Jiangsu A， Jiangsu B.骨 组 织 再生 的 药 物 输 送策 略 。 In：Panseri S，Taraballi F，Cunha C，editors Biomimetic approaches for tissuehealing. 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