尿液中致病菌对膀胱癌遗传标记的影响及联合检测的可靠性分子生物学研究

主办方：埃及生物多样性和应用科学杂志2（2015） 176E182完整文章致病菌对CK-19、CK-20和UPII作为膀胱癌遗传标记可靠性影响的分子生物学研究Ahmed El Shobakya，*，Mohamed Abbasa，Romaila Raoufb，马哈茂德·M.Zakariab，Bedeir Ali-El-Deinba埃及曼苏拉大学理学院植物学系b埃及曼苏拉大学泌尿学和肾病学中心A R T I C L E I N F O文章历史记录：接收日期：2015年3月23日接收日期：2015年2015年5月20日接受2015年6月5日在线发布关键词：病原菌膀胱癌细胞角蛋白19细胞角蛋白20尿斑蛋白IIA B S T R A C T目的：探讨尿中致病菌对膀胱癌3种遗传标志物（Cytokeratin 19、Cytokeratin 20和Uroplakin II mRNA）的影响，并分别评价各尿标志物的可靠性。方法：收集20例膀胱癌患者、15例尿路感染患者和10例健康志愿者的尿液标本。细菌的分离鉴定及药敏试验。采用RT-PCR检测尿CK-19、CK-20和UPII mRNA。结果：大肠埃希菌是最常见的病原菌，其次是肺炎克雷伯菌。CK-19、CK-20和UPII的敏感性和特异性分别为47.37%和68.42%、57.89%和100%、63.1%和100%。CK-20和UPII联合检测的敏感性和特异性均高于单独检测，甚至高于3种联合检测。结论：E.大肠杆菌是从膀胱癌患者分离出的最主要细菌。CK-20和UPII在良、恶性肿瘤中的表达水平不同。联合使用UPII和CK-20可能是一种有前途的非侵入性工具，用于检测尿液中的膀胱癌，用于同时具有UTI和癌症症状的患者版权所有2015年，曼苏拉大学。由Elsevier B. V.制作和托管。这是一个CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1.介绍膀胱癌（BC）是最常见的泌尿道癌症，全球每年约有380，000例新发病例和150，000例死亡[1]。它的流行率是男性比女性，诊断时的中位年龄为65岁[2]。与BC发展相关的风险因素包括烟草烟雾中的致癌物质，职业来源的暴露，尿路感染，饮用自来水和某些药物，膀胱癌有时会引起显微镜或肉眼血尿*通讯作者。电子邮件地址：dshobaky84@yahoo.com（A. ElShobaky）。由曼苏拉大学负责进行同行审查。http://dx.doi.org/10.1016/j.ejbas.2015.05.0062314- 808 X/版权所有2015年，曼苏拉大学。由爱思唯尔公司制作和主持 这是一篇CC BY- NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在www.sciencedirect.com在线获取ScienceDirect杂志主页：http://ees.elsevier.com/ejbas/default.asp例如，《生物多样性公约》和《生物多样性公约》科学杂志2（2015） 176e182177或其他刺激性排尿症状，如排尿次数增加和排尿时疼痛或烧灼感这些症状也更可能是由良性疾病引起的，如尿路感染和膀胱结石。尿路感染（UTI）是影响人类的最常见感染之一。在正常情况下，尿路是无菌的，只有当细菌的毒力克服了正常的宿主防御机制时，才发生感染。UTI最常见的是细菌，但真菌，病毒和寄生虫感染也可能发生[3]。世界各地的几位作者已经报道了大肠杆菌和克雷伯氏菌属的革兰氏阴性菌是引起UTI的最常见微生物[4e6]。据估计，20%到 25%的人类尿斑蛋白是尿路上皮斑块的组成蛋白亚单位。这些uroplakin之一是uroplakin II（UP-II）。它在尿路上皮癌中很容易通过免疫组织化学检测到，但在非尿路上皮肿瘤中不能检测到[16，17]。UPII表达与低病理级别不严格相关，尽管它是正常尿路上皮的终末分化产物[18]。因此，在膀胱癌的鉴别诊断中，UP-II可以是一个很好的标志物，特别是当与其他尿路限制性标志物结合时[19]。本研究重点探讨了尿中细胞角蛋白20、细胞角蛋白19和尿斑蛋白Ⅱ三种尿标记物的可靠性癌症是由慢性感染和炎症引起的E.大肠杆菌感染可能在膀胱癌的发展中起作用，因为癌症可能通过转录因子的NF-κB家族的激活介导，其调节促炎细胞因子基因、粘附分子的转录和几种促存活基因的表达，导致细胞凋亡的终止和炎症的增加[7]。这也可能是由于少量的亚硝胺，其可能在感染过程中产生，并可能引发尿路上皮的肿瘤或筛查膀胱癌，在有既往症状的患者中寻找尿液中的不同物质或癌细胞，目前通过尿液分析，尿细胞学和膀胱镜检查进行[8]。进行尿分析以检查尿液中的血液或血尿。然而，高达25%的膀胱癌患者可能没有血尿，即使他们患有已知的膀胱肿瘤[8，9]。尿细胞学是一种显微镜检查尿液样本，以寻找任何癌症或癌前细胞。细胞学的敏感性和特异性较低，特别是对于低级别肿瘤，其结果无法立即获得，并且依赖于解释者[10]。膀胱镜检查是一种能够使膀胱衬里可视化并对可疑病变进行活检以进行组织病理学诊断和分期的技术，但它是侵入性的，相对昂贵且对患者来说不舒服[11]。膀胱镜检查结合尿脱落细胞学检查仍是膀胱癌临床诊断的金标准膀胱癌的早期检测和使用尿液标记物的随访该标志物必须是敏感和特异性的，以检测尿液中的游离癌细胞并定量描述癌症进展[10e14]。细胞角蛋白是上皮特异性的中间纤维，根据上皮类型和分化程度以各种组合表达，其可用于肿瘤诊断。其中之一是细胞角蛋白-19。 测量细胞角蛋白19片段的CYFRA 21- 1甚至已被用作膀胱移行细胞癌的预后和诊断标志物[15]。另一种细胞角蛋白是“CK-20”，其在膀胱癌患者的尿道上皮中表达。它可以被认为是尿路上皮增生的标志物[8]。然而，尽管恶性细胞通常保留祖细胞的中间丝，但正常细胞不表达CK-20基因。这些发现强调了CK-20是检测膀胱癌的特异性标志物的可能性[15]。另一方面，在一项研究中，2.材料和方法2.1.尿液收集从Mansoura大学泌尿学和肾脏病学中心收治的20例膀胱癌和15例UTI患者以及10名正常志愿者中收集了两份约50和 100 ml的清晨尿液样本在获得样品期间，采取无菌预防措施后，将这些样品收集在无菌的密封容器收集一个样品用于细菌培养，获得另一个样品用于使用实时PCR定量基因表达2.2.细菌鉴定和抗菌药物敏感性将 收 集 的 样 品 在 C.L.E.D 琼 脂 和 血 琼 脂 培 养 基（OXCELLS，ENGLAND）上培养涂片革兰氏染色，观察细菌的形态和排列。根据生产说明，使用自动VITEK 2对样本中最主要的分离株进行细菌鉴定和表征（bioMerieux，Marcy I'Etoile，France）[20]。革兰阴性杆菌鉴定卡（ID-GNB卡）采用64孔塑料卡制作，卡上有41项荧光生化试验，包括18项氨基肽酶和氧化酶的酶试验。将卡插入VITEK 2读数器-培养箱模块中（培养温度，35.5在室温下，每隔15分钟自动进行一次动力学荧光测量。在孵育期约3 h后，通过ID-GNB数据库进行预处理。根据Shaaban，Ghozlan[21]，使用VITEK 2抗生素药敏板卡对已鉴定的细菌分离株进行了抗菌药物敏感性试验2.3.实时PCR在低温条件下（2 e8℃）以400×将沉淀物在-196°C下保存在200ml RNA Later溶液（Qiagen Sciences，Maryland，USA）中，用于进一步的RNA提取[22]。根据采用的Trizol（Invitrogen，USA）方案，从所有样品的尿细胞中提取总RNA。然后使用ZYMO Research尿RNA分离试剂盒（Zymo Research，USA）进行RNA纯化。将纯化的RNA储存在-196°C。RNA浓度178埃及《国际刑事法院和刑事诉讼法》杂志2（2015） 176e182使用Nano Drop（Thermo scientific，USA）定量，并通过1.5%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色确定其完整性。仅观察到两条RNA特征条带且不可降解的样品用于实时PCR（RT-PCR）。使 用 RT First strand 试 剂 盒 （ Qiagen Sciences ，Maryland，USA）通过随机引发将lmg总RNA转化为单链互补脱氧核糖核酸（cDNA）。使用定量聚合酶链反应（qPCR）分别对CK 19、CK-20和UPII进行基因表达。PCR分析。α-actin作为管家基因。每个扩增进行40个循环;循环谱由94℃变性20 s，58℃退火30 s，60 ℃延伸30 s组成。所用引物的序列是从NCBI设计的，如表1所示。通过使用25mL总反应体积进行扩增，所述总反应体积包含25 pmole的每种引物、3mL cDNA模板、12.5mL2× SYBR Green Rox Master Mix （ Qiagen Sciences ，Maryland，USA），并通过无核酸酶的水调节体积.将板插 入 实 时 热 循 环 仪 （ ABI PRISM 7000 ， AppliedBiosystem，California，USA）中。对于每个样品，一式三份进行该程序。Pfaffl引入的数学模型用于靶基因的相对定量[23]。2.4.统计分析研究三组尿液样本的基因表达差异，以及样本细菌条形码与基因表达百分比的关系。所有分析均使用社会科 学 统 计 软 件 包 （ SPSS ） （ SPSS ， Chicago ， IL ，USA）进行。采用ROC曲线和KaplaneMeier曲线分析确定CK-19、CK-20和UPII mRNA表达的临界值使用非参数Mann Whitney秩、Pearson、Spearman、Anova、Kruskal和U总和检验对各组之间的变量进行统计学比较。显著性水平确定为小于0.05。甲氧苄啶/磺胺甲恶唑81%（22/27），环丙沙星77%（21/27），头孢噻肟/头孢他啶62%（17/27），硝基呋喃 妥 因 40% （ 11/27 ） ， 哌 拉 西 林 / 他 唑 巴 坦 19%（5/27）。所有K. 肺炎克雷伯菌对亚胺培南、阿米卡星和哌拉西林/他唑巴坦的敏感率为100%（5/5），对头孢噻肟、头孢他啶、复方新诺明/磺胺甲恶唑的耐药率为60%（3/5），ciprofloxacin和环丙沙星。对阿莫西林/克拉维酸的耐药率为40%（2/5）。在正常对照组和正常对照组中，CK-19、CK-20和UPII mRNA的表达水平均显著高于正常对照组和正常对照组。膀胱肿瘤的排泄尿样分别为9/19（47%）、11/19（58%）和12/19（63%），如表2所示。UPII、CK20表达水平组间比较差异有统计学意义（p0.05），而 CK19表达水平组间比较差异无统计学意义（p><因此，病原菌的存在可能会影响CK19标记物诊断膀胱癌的可靠性，但对UPII和CK20结果无影响。图1示出了不同的表达水平的β-肌动蛋白，CK-19，CK-20和UPIImRNA在细胞中的表达。学习小组。3.1.CK-19、CK-20和UPII RT-PCR的敏感性和特异性如表3所示，CK-19、CK-20和UPII的总体敏感性和特异性 分 别 为 47.37% 和 68.42% 、 58% 和 100% 、 63.1% 和100%。联合应用CK-20和UPII的敏感性和特异性后者的比率高于单独使用每种标记物的比率，也高于三种标记物组合的比率。CK-19、CK-20和UPII的阴性预测值分别为60%、100%和100%。CK-19、CK-20和UPII的阳性预测值分别为56.5%、70.3%和73.08%联合应用CK-20和UPII的阴性预测值和阳性预测值最高。3.2.细菌感染与基因表达细菌感染对CK19、CK20和UPII mRNA的影响3.结果在20例膀胱癌患者中，有10例和3例感染了大肠杆菌。大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。 15例UTI患者中13例为E.肺炎克雷伯菌2例。药敏结果表明，所有E.大肠埃希菌对亚胺培南和阿米卡星敏感（耐药率为0%）。对其他抗生素的耐药率依次为：阿莫西林/克拉维酸88%（24/27），膀胱癌患者体内的血药浓度见表4。未感染BC患者的基因表达水平高于感染BC患者。关于细菌感染，UPII mRNA水平的p值>0.05，而CK-19和CK-20 mRNA水平的p值为0.05。因此，细菌感染方面，膀胱癌患者UPII表达水平差异无统计学意义，而膀胱癌患者CK19、CK20表达水平差异有统计学意义。表1e RT-PCR中的基因特异性引物列表基因正向引物反向引物温度（℃）（bp）CK-19TGCGGGACAAGATTCTTGGTTCTCAAACTTGGTTCGGAAGTCA58102CK-20CTGATGCAGATTCGGAGTAACATCTCTCTTCCAGGGTGCTTAAC58162UPIIGCATACCAGGTGACAAACCTCGTTCCTTCGAGGGAGTGTGG58120β-肌动蛋白AGGCACCAGGGCGTGATGCCCACATAGGAATCCTTCTGAC5851例如，《生物多样性公约》和《生物多样性公约》科学杂志2（2015） 176E182179图图1e研究组中β-actin、CK-19、CK-20和UPII mRNA的不同表达水平表5e细菌感染与肿瘤分级和分期之间的相关性T1T2T3，4GIGIIGIII感染145009未感染522154p值0.800.031根据p值，细菌感染在肿瘤分期之间无统计学显著性差异（p> 0.05），而在肿瘤分级之间有显著性差异（p0.05）。<3.4.肿瘤分级与基因表达水平的相关性考虑到不同的肿瘤分期，三个基因的中位表达在较高的肿瘤分期和较低的肿瘤分级中升高。CK-19和UPII在不同肿瘤分期中的表达差异无统计学意义（p> 0.05），但在不同肿瘤分期中的表达差异有统计学意义（p<0.05CK-20的表达水平显示（p 0.05），<3.3.细菌感染与肿瘤进展为了测试细菌感染与肿瘤进展之间的相关性，如表5所示，将肿瘤等级和分期与感染进行比较。我们发现细菌感染与高肿瘤分级相关在表6中。三种标志物的表达水平在肿瘤分级方面没有统计学显著差异（表7）。不同肿瘤分期膀胱癌患者的CK20表达水平存在显著差异（表6和表7）。表3e CK-19、CK-20和UPII表达水平单独和联合使用的灵敏度和特异性灵敏度特异性阴性预测值阳性预测值CK2057.89%百分百百分百百分之七十点三CK19百分之四十七点三七68.42%百分之六十百分之五十六点五UP II63.1%百分百百分百73.08%CK20 EQUIPUPIIEQUIPACK 19百分之七十八点九五68.42%71.43%76.47%CK19 公司简介73.68%68.42%百分之七十72.22%UP II 公司简介63.16%68.42%66.67%百分之六十五CK20 þUPII百分之七十八点九五百分百百分百82.61%表4e膀胱癌患者中细菌感染与基因表达水平之间的相关性组感染CK19未感染感染CK20未感染感染UPII未感染N109109109SE0.040.61.210.82.416.1中值0.050.670.446.217.5p值0.0270.0080.110表2e各组CK-19、CK-20和UPII mRNA阳性率。组BCCK19UTINBCCK20UTINBCUPIIUTINN191271912719127SE0.3580.1520.0795.320.000.08.7590.0630.0中值0.070.060.010.6800.000.003.100.010.00p值0.580.0150.008180埃及国家科学院和应用科学研究所期刊2（2015） 176e182表6e基因表达的肿瘤分级水平之间的相关性&成绩GIICK19GIIIGIICK20GIIIUPIIGIIGIIIN613613613SE1.00.064.026.220.516.1中值0.370.073.120.6834.203.1p值0.3680.8310.4814.讨论革兰氏阴性大肠埃希氏菌是一种常见的致病菌。埃希菌和肺炎是引起UTI的最常见致病菌，这一发现与我们的结果完全一致。目前的研究结果还指出，E.大肠杆菌是膀胱癌患者最常见的泌尿系致病菌。这一发现与El-Mosalamy，Salman [7]的建议一致，即膀胱感染由E. 大肠杆菌在膀胱癌发生过程中可能起主要的相加和协同作用。已知炎症通过产生炎性氧化剂促进恶性肿瘤的发生和进展[24]。在我们的研究中，我们发现肿瘤分级和细菌感染之间存在显著相关性，因为细菌感染与高级别肿瘤相关性更高。结果表明，大肠埃希菌对抗菌药物的敏感性较高。大肠杆菌分离株显示，E.大肠埃希菌对亚胺培南和阿米卡星高度敏感（100%）。然而，阿莫西林/克拉维酶的耐药率较高，其次是甲氧苄啶/磺胺甲恶唑，然后是其他药物。Debnath，Das [25]报道说，E.大肠埃希菌对呋喃妥因、阿米卡星、阿莫西林/克拉维酸、环丙沙星和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率分别为4%、13%、17%、50%和50%。因此，这些结果与本研究的结果这种分歧的可能原因可能是由于地理位置、人群反应或我们当地抗生素滥用的差异。所有菌株均为克雷伯氏菌。 肺炎克雷伯菌对亚胺培南、阿米卡星、氨苄西林/他唑巴坦高度敏感，对头孢噻肟、头孢他啶、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、环丙沙星、环丙沙星耐药率为60%，对阿莫西林/克拉维酸耐药率为40%。这一结果与瓦基尔瓦拉和特里维迪[26]他报告说，头孢他啶的耐药率环丙沙星、甲氧苄啶/ 磺胺甲恶唑的耐药率分别为60%、48%和80%。膀胱癌的早期诊断是强制性的，因为治疗的任何延迟都被证明会影响进展。目前，膀胱镜检查和尿细胞学检查仍然是初步评估下尿路病变以排除膀胱癌的主要方法。然而，膀胱镜检查是侵入性的，并且由于存在膀胱粘膜的异常外观，在具有留置导管或活动性炎症的患者中可能无效需要额外的实验室标记物来帮助评价这些病变[8]。遗传标记的开发代表了膀胱癌诊断的一个有前途的方向[27]。高灵敏度的实时RT-PCR已经显示出其区分恶性和良性组织以及确定肿瘤组织的阶段和等级的能力[28]。CK-19在正常尿路上皮中表达，当尿路上皮细胞脱落时，可以在尿液中测量。目前的研究表明，CK-19在所有组成员中表达。通过ROC曲线确定敏感性和特异性最高的CK-19 mRNA检测的敏感性为47.37%，特异性为68.42%。获得的灵敏度与Hassanien、Nossier[29]的研究一致，该研究显示CK-19的灵敏度为31%，但特异性更高（100%）。其他研究显示，CK-19 mRNA和蛋白的灵敏度范围为43%至79%，特异性范围为68%至88%[30，31]。约40%的高假阳性率表明，病原菌可能会影响CK-19作为膀胱癌检测标志物的可靠性。结果显示，膀胱癌患者尿CK-19 mRNA水平与细菌感染与否有显著性差异，而尿CK-19表达水平与肿瘤分级、分期无相关性。后一发现与El-Salahy[15]的结果不一致，他发现CK-19表达水平与肿瘤分级和分期之间存在显著相关性。RCK 20是在上皮细胞中表达的中间丝。我们的研究中，CK20仅在BC组中表达，无假阳性结果。这与免疫学和Northern印迹研究发现的CK20表达主要限于胃肠道组织、尿路上皮细胞癌和Merkel细胞完全一致[32]。在本研究中，BC、UTI和对照组之间CK-20mRNA水平存在统计学显著差异这一发现表7e肿瘤分期和基因表达水平之间的相关性组T1CK19T2T3和T4T1T2CK20T3T4T1UPIIT2T3和T4N667666677SE0.770.0211.093.030.2716.64.5746.650.5中值0.250.061.484.40.681.83.115350.5p值0.430.040.266例如，《生物多样性公约》和《生物多样性公约》科学杂志2（2015） 176E182181与郭，罗[32]的结果一致。其他研究显示CK-20 mRNA的 灵 敏 度 范 围 为 65% 至 90% ， 特 异 性 范 围 为 67% 至90%[27]。另一方面，一些作者报道CK-20具有非常低的特异性[33]。我们的研究结果表明，有一个统计学显着降低CK-20 mRNA水平在BC患者的细菌感染方面，有显着的相关性CK-20表达与肿瘤分期。同样，El-Salahy[15]报道了CK-20 mRNA表达与肿瘤分期之间的显著相关性。然而，在本研究中，与肿瘤分级无关，这一发现不符合El- Salahy[15]的结果，但符合Pu，Wang[8]的结果。尿斑蛋白（Uroplakins，UPs）是哺乳动物泌尿系统主 要 的 分 化 产 物 ， 是 一 种 重 要 的 细 胞 膜 蛋 白 。Olsburgh，Harnden[17] UPII基因的表达对尿路上皮瘤具有高度特异性，他们认为正常尿路上皮瘤中的尿斑蛋白基因的严格分化限制表达在恶性转化后丧失。在BC和UTI患者中检测到UPII，因为它们都导致上皮细胞脱落到尿液中，而在正常组中未检测到UPII。UPII的敏感性为63.1%，特异性为100%。对移行细胞癌的敏感性这与UPII是人TCC的高度特异性标志物的建议相符[17]。这些结果与（Kurahashi，Hara[34]）的结果一致，他们报道通过检测组织和血液中的UPIImRNA水平，UPII mRNA在膀胱癌转移的早期检测中是可靠的。我们发现UPII mRNA表达水平与肿瘤分级和分期无显著相关性在目前的研究中，UPII和CK-20的联合使用给出了最高的敏感性（78%）和特异性（100%），比三种标记物一起组合或每种标记物单独使用。这意味着UPII和CK- 20的联合使用可能是检测膀胱癌的可靠工具4.1.结论E.大肠杆菌是膀胱癌患者中最主要的细菌分离株。尿CK-19对膀胱癌的诊断特异性较低。而CK-20和UPII在良、恶性肿瘤中的表达水平不同，具有较高的特异性。联合使用UPII和CK-20可能是一种有前途的非侵入性工具，用于检测尿液中的膀胱癌，用于同时具有UTI和癌症症状的患者。因此，建议在较大个体数的情况下进一步研究这两个标记组合的可靠性雷弗伦 CES[3] Sheerin NS.尿路感染。Medicine2011;39（7）：384e 9.[4] GarofaloCK，Hooton TM，Martin SM，Stamm WE，Palermo JJ，Gordon JI，et al. 女性泌尿道感染患者尿液中的大肠埃希菌能够形成胞内细菌群落。InfectImmun2007;75（1）：52e 60.[5] [10]杨文，杨文.三种常见泌尿系致病菌相关性尿路感染调查。Maedica 2010;5（2）：111e 5.[6] Ayhan N，Basbug N，Ozturk S.尿路感染的病原体和对抗生素的敏感性。Mikrobiyol Bul1988;22（3）：215e 21.[7] El-MosalamyH，Salman TM，Ashmawey AM，Osama N.慢性E.大肠杆菌感染在膀胱癌发生过程中的实验研究Infect Agents Cancer2012;7（1）：19.[8] 蒲晓霞，王志平，陈永荣，王晓华，吴永林，王和平。联合检测尿液中Survivin、CK20和MU7 mRNA对膀胱癌的诊断价值JCancer Res Clin Oncol 2008;134（6）：659e 65.[9] Boman H，Hedelin H，Jacobsson S，Holmang S.初诊膀胱癌：首发症状、显微血尿程度与肿瘤标志物状态的关系。J Urol 2002;168（5）：1955e 9.[10] 科奈蒂BR.膀胱癌的分子标志物：一个关键的评价。Urol Oncol2006;24（4）：326e 37.[11] 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