单核多组学鉴定ZEB1和MAFB为阿尔茨海默病特异性顺式调节元件的候选调节剂

文章单核多组学鉴定ZEB 1和MAFB为阿尔茨海默病特异性顺式调节元件的候选调节剂图形摘要亮点单核多组学鉴定阿尔茨海默d识别出40，831个阿尔茨海默氏症特异性的候选调节元件D 证实的增强子样活性的候选调节剂，APP表达d提名ZEB1和MAFB作为候选阿尔茨海默氏作者阿什林湾作者：Anderson，作者：JacobM.放大镜，J. 放大图片作者：Richard M.作者：Lindsay F.Rizzardi通信ncochran@hudsonalpha.org（J.N.C.），rmyers@hudsonalpha.org（R.M.M.），lrizzardi@hudsonalpha.org（L.F.R.）简言之将调控元件与特定细胞类型中的靶基因连接可以揭示疾病中被破坏的调控机制。在这里，安德森和罗杰斯等。确定阿尔茨海默氏症增强子样活性被证明为12个元素，包括APP的几个监管机构。Anderson等人，2023，细胞基因组学3，1002632023年3月8日，作者。https://doi.org/10.1016/j.xgen.2023.100263scMultiomics：AD与对照DLPFCsnATAC-seq广告：3 4控制：4 4背外侧前额叶皮层snRNA-seq10XGenomicsMultiomics（ATAC+ Gene鉴定候选顺式调节元件（cCREs）TF表达snATAC-seqADAD建业控制峰值-基因相关性（AD控制基因表达控制TF基序基因AD控制用荧光素酶测定法验证cCREs500 bpcCREHEK293细胞pGL4荧光素酶报告基因活动会会开放获取文章单核多组学鉴定ZEB 1和MAFB作为阿尔茨海默病特异性顺式调节元件的候选调节剂阿什林湾安德森，1.5布赖恩B。Rogers，1，2，5Jacob M.Loupe，1Ivan Rodriguez-Nunez，1SydneyC.Roberts，1Lauren M.作者：William E.Bunney，3Blynn G.Bunney，3Stanley J.沃森，4岁J. 尼古拉斯·科克伦，1，6，*理查德M。Myers，1，6，*和Lindsay F.里扎迪1，6，7，*1HudsonAlpha生物技术研究所，亨茨维尔，AL，美国2University of Alabama at Birmingham，伯明翰，AL，美国3美国加州大学欧文分校医学院精神病学和人类行为系4美国密歇根大学心理健康研究所5作者贡献相等6资深作者7引线触点* 通信：ncochran@hudsonalpha.org（J.N.C.），rmyers@hudsonalpha.org（R.M.M.），lrizzardi@hudsonalpha.org（L.F.R.）https://doi.org/10.1016/j.xgen.2023.100263总结来自阿尔茨海默病（AD）供体和未受影响的对照组的脑组织之间的细胞类型特异性转录差异已得到充分证明，但很少有研究严格询问这些改变的调控机制。我们对从7名AD和8名未受影响的供体的皮质组织中分离的105，332个细胞核进行了单核多组学（snRNA-seq + snATAC-seq），以鉴定参与AD相关转录变化的候选顺式调节元件（CREs）。我们检测到319，861个基因表达与富含活性CREs的细胞类型特异性转座酶可及区域其中，40，831是AD组织特有的。验证实验证实了许多区域的活性，包括APP表达的几个候选调节因子。我们确定ZEB1和MAFB作为候选转录因子，分别在神经元和小胶质细胞的AD特异性基因调控中发挥重要作用。微神经胶质细胞连接在全球范围内富集了AD风险的遗传性和先前确定的活性调控区域。介绍阿尔茨海默病（AD）的遗传贡献者的鉴定为潜在的疾病机制提供了重要的APP、PSEN1或PSEN2中罕见的蛋白质改变变体可导致早发性常染色体显性AD，1全基因组关联研究（GWAS）已发现迟发性AD的常见变体，这些变体可在不同程度上增加疾病风险。2-连锁不平衡使得因果变异的鉴定变得困难，特别是对于保守性和保守性估计可能不具有信息性的假定调控区域将常见和罕见的调控变异与受影响的基因联系起来也具有挑战性。7-9此外，与疾病相关的变异体通常仅在特定细胞类型中起作用，这进一步使其作用的解释复杂化。10，11因此，确定哪些基因导致疾病需要对特定细胞类型进行评估。单细胞技术的最新进展允许对来自相同样品的基因表达12-19，20虽然研究已经检查了AD脑供体和未受影响的对照组组织之间的细胞类型特异性转录和表观遗传差异，但很少有人严格询问负责这些改变的调控机制。整合单核RNA-seq（snRNA-seq）和单核转座酶可及染色质测序（snATAC-seq）数据，通过将染色质可及性与附近基因表达相关联，可以鉴定潜在的顺式调控元件（CRE）。在这里，我们同时测量基因表达和染色质可及性在同一个核，以确定细胞类型特异性调节区域和它们的靶基因在背外侧前额叶皮层（DLPFC）组织从AD和未受影响的捐助者。此外，我们评估了AD供体细胞核特有的调节机制。CellGenomics 3，100263，March 8，2023？作者。1这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。会开放获取文章2Cell Genomics3，100263，2023死后组织核i隔离scMultiomics（RNA +ATAC）AQP4C12NRGN GAD2 P2RY12 MOBP VCANwnnUMAP 112241230123833293586430543134443448144824627HCT17HEXHCTZZTNT1261NT127160100L0图1.单细胞多组学研究阿尔茨海默病患者和正常人DLPFC的细胞多样性(A) 实验设计。(B) 均匀流形近似和投影（UMAP）可视化细胞类型和聚类分配着色的单个细胞核的加权最近邻（WNN）聚类(C) 每个亚群中的细胞总数和亚群中每个个体（红色，AD供体;蓝色，未受影响的供体）的细胞比例(D) scREAD细胞类型标志物的行标准化基因表达。(E) 细胞类型标记基因的跨细胞类型的染色质可及性（如下所示）。(F) 个体间假体积细胞类型特异性表达谱的相关性指示细胞类型的颜色在整个图中是一致的结果人类背外侧前额叶皮层的细胞多样性我们使用10 x Genomics Multiome技术对从来自7名诊断患有AD的个体（平均年龄78岁，Braak 4-6期）和8名性别匹配的未受影响的对照供体（平均年龄63岁）的人死后DLPFC组织分离的细胞核进行snATAC-seq和snRNA-seq该测定允许在相同的细胞核内直接映射基因表达和染色质可及性，而不需要在交叉模态整合期间通过计算推断细胞类型鉴定。在去除低质量细胞核和双联体（STAR方法）后，我们总共保留了105，332个细胞核，每个供体平均7，022个我们检测到每个细胞中有2，659个基因和11，647个ATAC片段。我们分别使用Seurat22和Signac23对snRNA-seq和snATAC-seq数据进行归一化和降维。我们使用加权最近邻（WNN）分析来确定一个联合图1B显示了表达和可及性的代表性，并鉴定了由八种主要细胞类型及其相关亚群组成的36个不同的簇（图1B、S1A和S1B）。与先前的snRNA-seq数据集一致，12、13、15、19我们鉴定了脑中所有预期的细胞类型，其在AD和对照供体中具有相似的相对丰度（图1B、1C和S1C）。周细胞和内皮细胞簇含有500个细胞核，并从进一步分析中排除。簇注释得到基因表达和良好建立的细胞类型标记基因的启动子可及性的支持（图1D和1E）。在每种细胞类型内和兴奋性/抑制性神经元之间，供体之间的整体基因表达存在强相关性（图1F）。在供体中显示可变相关值的唯一细胞类型是小胶质细胞，这是一种已知在AD中失调的此外，除少突胶质细胞前体细胞（OPC）、周细胞和内皮细胞外，我们在每种主要细胞类型中鉴定了不同的亚群（图S2）。这些亚型注释与先前研究中的亚型注释一致，14、22、24，并且在AD和对照供体中的分布相似，除了DLPFC广告：34对照组：4 4BExc_2Exc_3Exc_0Exc_6Exc_1Oli_2Oli_1端Oli_0Exc_9Ast_2Oli_3Exc_4Ast_1Exc_7Ast_4Exc_8Ast_0Exc_5Inh_2Ast_3Mic_0Inh_1Mic_4Mic_3Mic_2Inh_3Mic_1Inh_5Inh_0Inh_7Inh_4Inh_6每OPCF细胞类型状态r210.50地位ControAD细胞类型供体AQP4Z评分210−1NRGNGad2P2RY12MOBPVCAN老年痴呆症wnnUMAP2细胞计数（x1000根据OPC Oli来自捐助者的麦克风吸入外端AstAst_0Ast_1Ast_2Ast_3Ast_4Exc_0Exc_1Exc_2Exc_3Exc_4Exc_5Exc_6Exc_7Exc_8Exc_9Inh_0Inh_1Inh_2Inh_3Inh_4Inh_5Inh_6Inh_7Mic_0Mic_1Mic_2Mic_3Mic_4Oli_0Oli_1Oli_2Oli_3OPC端每标准化可访问性基因一DECell Genomics3，100263，2023年3月8日36044523 5121251391093716154432359831323635651413824179969DEGs道指上涨92 4 35 58OliMic标准化表达4文章会开放获取一个2001000BAst起来ExcINHMicOliOPCE神经递质转运顺行跨突触信号传导下调DEG100200ARL17B下来ASTExcINHMicOliOPC单元类型AD中AD中的n质膜结合细胞突起形态发生阴性。reg. 肽基-苏氨酸磷酸化阴性。reg. 晶状体纤维细胞分化POS. reg. Tau蛋白激酶活性100500MAPTCLUlog2（FC）>1个0.50Reg. 环核苷酸磷酸二酯酶活性Pos.reg. Ryanodine敏感的Ca+2释放通道活性Reg. 跨突触信号传导DEG上调-0.5负B细胞凋亡过程的PLCG2BIN1INPP5DMAF<−1C对照AD4D本研究666Neg.调节淋巴细胞凋亡过程调节B细胞凋亡过程调节TGF β产生建立/维持顶/基底细胞极性阴性。PDGFR信号通路调节PDGFR− β信号通路调节突触囊泡再循环对脂磷壁酸的硫酸皮肤素蛋白聚糖代谢过程对脂磷壁酸的100500MS4A7PTK2B载脂蛋白EMS4A6A3664322808462Neg.肌动蛋白丝解聚反应区Notch受体靶突触前装配对BDNF刺激的细胞反应TMEM163ZKSCAN1WWOX212 2100 002562Morabito等人，20211825716Mathys等人，2019神经元投射分支图2.阿尔茨海默病DLPFC中细胞类型特异性转录组失调(A) 每种细胞类型AD中所有上调和下调基因的MAST log2(B) 在两个方向上细胞类型之间共享的DEG的数量（上三角形，在AD中上调;下三角形，在AD中下调）。(C) 在指定的细胞类型中最高DEG的标准化表达（log2 [FC] > 1）。(D) DEG与Morabito等人在细胞类型和方向上的一致性重叠19和Mathys et al.12(E) 热图显示了每种细胞类型内上调和下调DEG的最高富集GO项的比值比（* 校正后p <0.01）。小胶质细胞亚群和两种抑制性神经元亚型（Inh_1和Inh_2;图S2）。阿尔茨海默病DLPFC中细胞类型特异性转录组变化在每种细胞类型中，我们确定了AD和对照组织之间的差异表达基因（DEG）。将性别和年龄视为协变量后，共确定了911例DEG（图2A;表S3）。尽管先前已显示AD和对照组之间基因表达存在显著的性别特异性差异，但由于我们的样本量较小，我们未检测到此类变化。尽管大多数DEG是细胞类型特异性的，但在多种细胞类型中鉴定了141个DEG（图2B）。在这些DEG中，62个在Mathys et al.12和Morabito等人，19，包括PTPRG（AD Mic中上升）和GRIA2（AD Ast中下降）（图2C和2D）。PTPRG编码与炎症和AD疾病风险相关的蛋白酪氨酸磷酸酶（rs7609954）。26GRIA2编码谷氨酸受体2（GluR2）亚基，其降低钙通道渗透性并可保护免受兴奋性毒性。[27]最近对三项snRNA研究12、13、18进行的荟萃分析28发现，这三项研究共有41个DEG，其中只有7个方向不一致。我们还鉴定了其中的17个，包括参与谷氨酸信号传导的GRM3（在AD Ast中下调）和SLC38A2（在AD Oli中上调）以及编码E3泛素连接酶的RNF149（在AD Mic中上调）。大多数DEG在AD中上调，并且富集了与小胶质细胞中的PDGFR β信号传导、星形胶质细胞中的凋亡以及少突胶质细胞中的Notch和BDNF信号传导相关的细胞类型特异性基因本体（GO）术语（图2E;表S4）。与此相反，在AD中，大多数DEGs下调的是神经元，并显示富集在与tau活性（HSP 90 AB 1、HSP 90 AA 1）和钙通道活性（CALM 2、CALM 3）的调节相关的GO 术语中（图2E;表S4）。示例性DEG包括其过表达导致兴奋性突触密度降低的MDGA 2、作为与认知相关的骨钙素受体的GPR158和其表达与AD相关的神经病理学和认知状态相关的SAMD 4A（https：//agora. adknowledgeportal.org）上提供。SAMD4A与其他几个DEG（NRXN1，LUZP2，RBMS3，ARHGAP 15，ARHGAP24，LRP1B和ATP1B3），也在最近英国生物库的AD家族史全基因组关联神经网络分析中被新确定为AD相关。31候选CRE的识别先前的单细胞研究已经表征了AD脑组织和细胞类型中改变的基因表达，12 此外，我们试图利用单细胞多组学数据，通过将基因表达与数据集中所有细胞核的染色质可及性相关联来识别细胞类 型 和 疾 病 特 异 性 CREs 及 其 靶 基 因 。 Cell Ranger ARC（v2.0）分析管道将这些相关性生成为特征连锁或连接被定义为ATAC峰的可及性与基因表达之间的显著相关性32（图3A）。我们将这种相关性分析限制为仅考虑每个转录起始位点（TSS）500 kb内的峰，这是一个慷慨的搜索空间，因为以前的研究已经发现大多数增强子在其靶基因的50-100 kb内34我们首先取在每种细胞类型中鉴定的ATAC峰的联合，并且仅保留存在于至少一种细胞类型中的R2%细胞中的那些峰********************** *** *** *** **** *ASTOPCAstExcInhMicOliOPC富集富集4Cell Genomics3，100263，2023会开放获取文章相关性林克峰连接的基因状态单元格类型E链接数相关性A B503,00040可访问性Z评分210−1表达Z评分2102,0001,00001 20>40每个基因的3020100123>3个了c60可访问性表达式DOPC−1状态/组AD公共控制ABS.值相关性10.50F43210G其他每个峰的星形细胞兴奋性抑 制 性小胶质细胞奥利戈OPCsAD Ctrl AD Ctrl AD Ctrl AD Ctrl AD Ctrl ADCtrl兴奋性神经元对照AD40OliInhExcMicAst0.000.250.50 0.751.00PLSpELSDNA酶/H3 K4me 3dELS仅CTCF200OliMicOPCAstInhExc链接峰的比例E020 40 60链接峰数（x1，000）0.60.40.20.0−0.2−0.445，800，000 46，000，000 46，200，000chr17位置（kb）图3.候选CRE的识别(A) 基因-峰关联的示意图（顶部）。每个基因的最相关的峰值基因链接的行归一化可及性和表达的热图（底部）。根据细胞类型和疾病状态对列进行伪填充。(B) AD（红色）和对照（蓝色）样品的每个基因的连锁峰的数目（左）和每个峰的连锁基因的数目（右）的分布。(C) AD和控制的每个单元格类型的链接总数链路的小区类型由调用峰值的小区类型分配(D) 按细胞类型对链接峰进行ENCODE注释。(E) 与相应细胞类型的H3K27ac重叠的共享（跨细胞类型）和细胞类型特异性连接峰(F) 在每种细胞类型中来自AD和对照样品的KANSL 1的标准化表达。对于所有细胞类型，AD中的表达与对照中的表达显著不同。(G) KANSL1的所有链接的链接图。上图：按状态分离的兴奋性神经元中的伪体积可及性的覆盖图（红色，AD;蓝色，对照）。底部：显著的AD和对照峰-基因链接。弧高表示相关性的强度和方向弧形颜色表示是否在AD和对照（常见，灰色）或仅对照供体（蓝色）中鉴定出该链接与单个SNP重叠的连接峰以灰色突出显示。总共有189,925个峰。几乎一半的峰与来自相应细胞类型的H3K27ac重叠（46%），并且43%与ENCODE（DNA元件百科全书）35个远端增强子样序列重叠。使用该峰组，然后使用来自AD或对照细胞核的基因表达数据独立地计算连接，从而允许将连接分类为AD特异性、对照特异性或常见（STAR方法）。我们认为链接的峰是候选的CRE。从基因表达来看-根据在AD中观察到的症状变化，我们假设在AD和对照样品之间将存在CREs的差异使用，其将在该分析中被鉴定为AD或对照特异性联系。每个连接的细胞类型特异性由其中鉴定ATAC峰的细胞类型确定。共发现319，905个峰-基因连锁，涉及15，471个连锁基因和126，213个连锁峰，最小绝对相关值为0.2（图3A;表S5）。中位数距离控制AD无重叠重叠H3K27ac共享特定共享特定共享特定共享特定共享特定AD控制控制共同rs2532404SPPL2CKANSL1LRRC37ACRHR1某事MAPTARL17BASTExcINH米克·奥利n = 1，959n = 1 403n = 7 342数量的基因组相关。KANSL 1标准化表达标准化可访问性Glu基因H3K27ac峰数Cell Genomics3，100263，2023年3月8日5文章会开放获取连锁峰与连锁基因的TSS之间的距离为201，506 bp，绝对相关值与到TSS的距离之间存在反比关系（图S3A）。对于大多数基因，我们在AD（中位数= 12）和对照样本（中位数= 13）中发现了相似数量的链接然而，我们发现1，294个基 因仅 具 有 AD 链 接， 1 ，596 个 基因 仅 具 有对 照 链接 （ 图S3B）。当比较AD或对照中针对给定基因鉴定的连接数时，我们未观察到显著偏倚（图S3B）。大多数基因与所有细胞类型的多个峰相关，每个基因的中位数为14个然而，16%的基因与40个或更多个峰连锁（图3B），并且这些基因比具有较少链接的那些基因显著更长且更高地表达（图S3C）。这一发现可能是由于在较长基因的基因体内的峰被调用的链接，因为排除这些峰消除了链接数量的差异（p = 0.12，t检验）。在整个数据集中，17.8%的连接峰存在于靶基因的启动子或基因体中。虽然基因体中的正相关链接通常可能仅仅是靶基因表达的结果，但我们在分析中保留了这些峰，因为增强子通常位于其靶基因的内含子内。ATAC 峰 通 常 与 一 个 以 上 的 基因 相 互 作 用 分析的近 70%（126，213）的ATAC峰与平均两个基因与每个峰连锁的基因和1-21个连锁基因的范 围 连 锁 （ 图 3B ） 。 几 乎 三 分 之 一（30.24%）的链接是单一细胞类型所特有的，而21%是所有细胞类型所共有的（图3C）。我们确定了40，831个AD特定链接和74，028个控件特定链接，其中大多数链接都在这两个链接中（205，046）。 我们进行了排列分析，并确定AD和对照特异性链接的比例（占总链接的0.36）大于偶然预期（p =0.027，Z检验;图S3 D）。在AD和对照样品中鉴定的细胞类型特异性连接的靶基因在预期途径中富集（图S3E）。为了评估连接的峰是否35我们发现，近端（比值比[OR] = 1.24，p= 2.43 10- 15）和远端（OR = 1.06，p = 3.063 10- 9）增强子样序列的连接峰显著富集，重叠比例在不同细胞类型中相似（图3D）。由于这些注释不是在我们的特定细胞类型和组织中产生的，我们还将这些相关峰与先前在分离自前额皮质组织的细胞类型内鉴定的H3K27ac区域进行了我们发现，平均而言，57.5%的连接峰与来自相应细胞类型的H3K27ac峰重叠，并且对于细胞类型特异性连接峰，这增加到79%（图3E）。大多数（76.11%）连接的峰与基因表达正相关，正如开放染色质和转录激活之间的关联所预期的那样，37三十七、四十然后我们问我们观察到的差异基因表达可以通过候选CRE来介导。在AD和对照细胞核之间鉴定的几乎所有（94%）DEG在相同细胞类型中具有其中基因差异表达的连锁峰，并且这些连锁峰中的85%在相同细胞类型中与H3K27ac重叠。此外，我们注意到，在AD或对照数据集中唯一地鉴定了差异表达的基因。对于在AD中上调的基因，72%的正相关链接是AD特异性的，而对于下调的基因，62%是对照特异性的。例如，与对照相比，AD小胶质细胞中BIN1表达显著降低，并且这种降低的表达阻碍促炎性小胶质细胞应答。[42]我们在小胶质细胞中发现了6个对照特异性连接，而没有发现与BIN1相关的AD特异性连接其中一个对照特异性连接在Nott等人的研究中被证实为小胶质细胞特异性BIN111，并且具有AD相关的SNP（rs733839）。总之，这些发现表明这种CRE可能不再用于AD小胶质细胞，导致BIN1表达降低另一个实例是位于MAPT基因座中的KANSL 1，其在所有细胞类型中在AD中下调（图3F）。37个KANSL 1连接峰中的28个是对照样品特有的，其余的是AD和对照共有的（图3G）.在启动子中发现的这些关联峰之一与与进行性核上性麻痹44相关的表达数量性状基因座（eQTL）43（rs2532404）重叠，并且最近通过CRISPRi显示出调节诱导多能干细胞（iPSC）衍生的神经元中的KANSL 121这些结果与其他AD和对照特异性区域有助于在AD中观察到的差异表达的假设一致。AD特异性峰基因TF三联体的鉴定接下来，我们试图鉴定可能驱动可接近峰和靶基因之间正相关的转录因子（TF）。为了进一步研究连接的调节作用，我们鉴定了峰-基因-TF这种方法在概念上类似于最近描述的称为TRIPOD的方法，该方法采用非参数模型来识别峰基因TF关联，并且我们采用了术语45为了鉴定三联体，我们使用AD或对照数据集分别进行了这些额外的相关性分析AD或对照特异性三联体是分别在AD或对照数据集中唯一鉴定的三联体。细胞类型特异性是根据鉴别出连接峰的细胞类型定义的。我们将这些分析限制于相关值>0.3的连锁，其在连锁基因的TSS（115，107）的100 kb内，在这些三联体中，发现少于20%的峰存在于启动子中，其中大多数存在于内含子区域中（图4B）。ENCODE远端（OR =1.26，p = 2.23 10- 16）和近端（OR = 1.12，p = 5.93 10- 7）增强子样序列的三峰富集。每个TF的中位数为37个三重奏。TFMEF2C是最常见的三重奏参与者，出现在所有三重奏中的近5%尽管MEF2C在大多数人中表达，6Cell Genomics3，100263，2023会开放获取文章小胶质抑制兴奋性NeuN+0.40.20.0EB17ac上的OTIFGabra5A BTrio Peak注释4.8%F小胶质细胞AD控制相关性神经元AD控制相关性0.4UTR0.40.20.200- 0.2百分之零点一其他−0.2TFBATF/BATF 3EGR1ETV5TFBATF3EGR4ETV3FOSBFOXP1GBX2FOS/FOSBKLF10FOXC1HOXB4MYOGNPAS4IKZF3IRF7JUNPOU3F1RFX6SCRT2KLF 4/6/10MAFBTWIST2ARGFXMEF2cNFICEBF3IKZF 3MEF2C Trio中的C 靶基因表达（n = 1，643）NFIL3SNAI3NR1D1RORAOPCsz分数STAT1ZEB12STAT5AZNF2631TWIST2Olig0ZNF263ZNF331MicInhExc阿斯特集团D543210阿斯特Exc.INH.弥奥利格OPCs−1−2组兴奋性抑制性小胶质细胞神经元其他GZNF768NR4a2HZEB1基序ZEB1432E对化学突触传递的调节对突触传递的正调节调节阳离子通道活性顺行跨突触信号传导化学突触传递钾离子转运免疫应答中的模式识别受体信号传导细胞因子产生的正调控中性粒中性粒细胞脱粒中性粒细胞介导免疫ZmNeur10Exc.INH.弥Gabra532细胞内信号转导的正调控0 36 9富集H3K226,870,000 26,880,00026890000chr15位置（kb）10Exc.INH.弥图4. AD特异性TF调节网络(A) 定义峰基因TF三联体的策略含有TF基序的连锁峰必须与该TF相关，并且该TF的表达必须与该峰的连锁基因相关，以被认为是三重峰的一部分。(B) 三聚体内连锁峰位置的基因组注释(C) 按细胞类型列出的MEF2C trios内基因的柱标准化表达热图。(D) 按细胞类型列出的MEF2C(E) 来自兴奋性和抑制性神经元（绿色，“神经元”）和小胶质细胞（紫色，“小胶质细胞”）的MEF2C三聚体内基因的最高富集GO术语(F) 在小胶质细胞（左）和兴奋性/抑制性神经元（右）中鉴定的AD和对照特异性三重相关值的热图，TF涉及至少3个三重。(G) GABRA5的连锁图。上图：所示单元格类型中伪散装可达性的覆盖图。中间：来自NeuN +细胞核的ZEB 1 ChIP-seq信号的覆盖图，所述NeuN+细胞核分离自来自两个未受影响供体（1238和1242）的DLPFC组织。底部：显著的峰-基因链接;绿色表示与ZEB 1基序重叠。弧高表示相关性的强度和方向来自神经元的ZEB 1基序（绿色）和H3 K27 ac峰（黑色; Nott et al.11）。关联的目标峰以灰色突出显示。(H) 来自JASPAR 2022的ZEB1基序（顶部）。兴奋性/抑制性神经元和小胶质细胞中ZEB 1和GABRA 5的正常表达细胞类型中，MEF2C三联体中靶基因的表达在细胞类型之间是不同的（图4C和4D）。在小胶质细胞中，靶基因在与模式识别受体（PRR）信号相关的GO术语中富集，而在神经元中，它们被激活。富含神经元中的突触传递（图4E;表S7）。PRR由几个受体家族组成，包括对小胶质细胞活化至关重要的Toll样受体。在911名DEG中，我们发现有601人参加了三人组，百分之十九远端基百分之十八点八7.8%外显子百分之四十九点五神经元小胶质MEF2c规范化表达式相关性基因AD特异性（n =ZEB1 ChIP标准化可及性对照特异性（n= 171）峰 -TF 基因-TF峰-TF 基 因 -TFTF对照特异性（n= 358）AD特异性（n =峰值−TF基 因 -TF峰 值 -TF基因-TFTF标准化表达标准化表达会开放获取文章Cell Genomics3，100263，2023年3月8日7A EFC D图5. 候选CRE(A) 使用16个GWAS性状的sLDSC结果，如我们的按细胞类型和组分层的链接峰所示热图指示来自运行sLDSC的系数Z分数，其中每组链接与97个基线特征组合。Z得分显著大于0的性状-性状组合（单侧Z检验，α = 0.05，使用Benjamini-Hochberg方法在每个性状内校正p值）用报告富集得分的数值表示。(B) 条形图显示了先前指定的调控区域的链接富集（±95%置信区间[CI]）：活性MPRA元件（蓝色），靶基因与连锁基因相同的eQTLMPRA，大规模平行报告基因测定; NPC，神经前体细胞; ESC，胚胎干细胞。(C) 箱形图显示统计学显著性（*p 0.05，ANOVA和Fisher荧光素酶元件由指定区域的连锁基因表示。(D) 箱形图显示rs12445022与其与JPH 3相关的相应参考元件的比较（*p 0.05，ANOVA和Fisher（图例接下页）B会开放获取文章8Cell Genomics3，100263，2023相同的细胞类型，其中观察到差异表达。96个DEG在AD特异性三联体（包括MAPT、APOE和BIN 1）中，而89个在对照特异性三联体（PADI 2/PAD 2、PDE 10 A和SNAP 25）中。脑脊液中SNAP- 25的存在与淀粉样蛋白病理学相关，47并且已经观察到AD脑组织中的表达降低，48与我们在AD星形胶质细胞和神经元中发现的表达降低一致。在这组三人组中，有一个小的子集是AD或对照组特有的（n = 2，718）。虽然其中许多是特定于一个单一的细胞类型，55%是共享的两个或更多（图S4）。所有细胞类型特异性三 重峰与 来自其 各自细 胞类型 的H3K27ac 峰重 叠（ 表S6）。在小神经胶质细胞三联体中，NR4A2（Nurr1）在对照特异性三联体中最常被鉴定（图4F）。NR4A2可以作为激活剂和抑制剂发挥作用，并且已经显示通过募集CoREST复合物来抑制小胶质细胞中的炎症反应NR 4A 2三联体中的49个靶基因在中性粒细胞脱粒中富集（OR = 9.01，q = 5.3×10-6），并且包括白细胞介素基因IL 1A和IL 1B，以及TGFB 1。类似地，MAFB参与24%的AD特异性三重组（图4F），其中它与小胶质细胞标志物基因CX3CR 1和参与小胶质细胞活化的基因（TLR 3、CD 84、HAVCR 2）相关。50在健康的小胶质细胞中，MAFB抑制炎性反应51，这与我们的发现一致，即AD特异性三联体中的靶基因富集用于髓系白细胞介导的免疫的负调节（OR = 332，q = 0.0004）。在神经元特异性三联体中，我们分别在对照和AD特异性三联体中最常见地鉴定出KLF10和ZEB 1（图4F）。在神经元中，我们在所有AD特异性三联体中的一半中鉴定了ZEB 1，其靶基因参与调节离子通道信号传导（ITPR 1，CAMK 2A，CACNB 3，KCNH 3，KCNQ 5，KCNT1）。我们发现一个编码神经元Ca2+传感器的ZEB 1靶基因VSNL1在AD神经元中表达下调，这与以前的研究一致，并且这种表达降低与淀粉样斑块和神经元缠结相关52ZEB 1从未在对照组特异性三聚体中发现。鉴于ZEB 1参与神经元AD特异性三联体的频率，我们在从两个对照供体（1238和1242）分离的NeuN+细胞核中进行了ZEB 1染色质我们发现33%（55/167）的神经元ZEB 1三联体被ZEB 1结合，并且其中25个是AD特异性三联体。由GA-BRA 5编码的GABAA受体α 5亚基是我们发现可能在AD中受ZEB 1调节的一种基因（图4G）.α5GABAA受体与学习和记忆相关，这与海马神经元中GABRA 553在我们的数据中，ZEB 1在神经元和小胶质细胞中表达;然而，GABRA 5主要在兴奋性神经元中表达（图4G，右）。在兴奋性神经元中，我们发现了一个与GABRA5表达用H3K27ac标记并含有ZEB1基序。来自我们的两个未受影响的供体的ChIP-seq数据证实了ZEB 1在该位点的结合，提供了额外的证据表明该区域对GABRA 5的顺式调节活性。候选CREs的遗传变异我们进行分层连锁不平衡评分（sLDSC）回归54以确定我们的连锁峰是否显著富集与复杂脑相关性状相关的SNP（图5A;表S8）。如果链接仅在AD或对照样品的分析中被识别，则链接类别分别被定义为“AD "或”对照"。在两种分析中均鉴定了“共同"链接，并且”所有"是所有链接峰的联合。虽然具有多个链接的峰可以在不同类别中重复，但具有AD特定链接的峰中只有不到三分之一也具有对照特定链接，这突出了这些链接峰的特异性。在每种细胞类型的每个链接类别内，将链接峰的联合用于该分析。根据鉴别出相关峰的细胞类型，分配细胞类型。与先前的研究一致，在5项不同的研究2-6中，在小胶质细胞中鉴定的55、56个AD遗传性的小胶质细胞相关峰的特异性也得到了这些联系与其他脑相关性状的风险变体缺乏显著富集的支持，5762-这些发现与先前的研究一致，在先前的研究中，在兴奋性和抑制性神经元中识别的候选CREs与神经精神性状显著相关。11正如预期的那样，我们没有发现免疫疾病或其他表型特征的显著富集，如体重指数（BMI）65或身高。66候选CRE我们将我们确定的319，905个链接与预先存在的大规模功能基因组数据集进行了比较，并确定了67，541个代表候选CREs的链接，这些链接具有调控活性的正交证据。这一证据由三种数据类型提供：（1）大规模平行报告基因测定（MPRA），21，67尽管在癌细胞系中进行了几次MPRA，但我们发现这些数据集中每个数据集的链接显著丰富（图5B）。MPRA数据提供的证据表明，(E) 上图：每种细胞类型中APP的标准化表达。中：指示的小区类型中的可及性的覆盖图。底部：荧光素酶测定中与APP的显著对照（蓝色）和共同（灰色）峰基因链接。弧高表示相关性的强度和方向。含有增加荧光素酶报告基因表达的CRE的连接以灰色突出显示。(F) 箱形图显示代表APP-峰连接的所有测试的荧光素酶元件以灰色突出显示的元素位于APP基因体内（*p 0.05，ANOVA和Fisher会开放获取文章Cell Genomics3，100263，2023年3月8日9刺激转录，但该测定不能鉴定靶基因。相比之下，来自NeuN+细胞核的HiC数据提供了连接峰的靶基因的正交验证，但没有促进转录活性的证据。我们对这些分析的结果进行了交叉分析，发现在一个或多个MPRA中显示调控活性的60，473个链接中，有1，542个链接也鉴定出与HiC数据相同的靶基因。此外，617个连锁峰与eQTL重叠，并与相同的基因连锁，提供了活性的证据，并确认了靶基因。为了进行额外验证，我们选择了51个神经元连接用于荧光素酶报告基因试验（表S9）。我们在神经上皮来源的人胚肾293（HEK293和293FT）细胞系中进行了这些测定，因为其染色质可及性与脑组织中发现的相似。这些细胞系在技术上也是易处理的，因为它们是高度可转染的，并且允许有效筛选感兴趣的区域。我们没有选择任何AD特异性连接进行验证，因为我们使用的细胞系来自推测未感染的个体。这51个链接中的13个包含与脑相关性状（例如AD、癫痫、神经变性）相关的SNP，并且我们测试了这些SNP的两个等位基因（表S10）。12个元件增加了荧光素酶报告基因的活性，包括与SNCA（β-突触核蛋白）和APP（淀粉样前体蛋白）连接的区域（图5C-5 F）.这些活性元件中的三个涉及峰基因TF三聚体（CCSER 1-MEF 2C、JPH 3-RARB和ADAMTS 1-RARB）。SOX 10）。NeuN+细胞核的ChIP-seq分析证实MEF 2C结合在与CCSER 1（一种与自闭症相关的基因72）相关的峰处（数据未显示）。15种变体中只有一种测试了消除活性，rs 12445022，其为与JPH 3相关的峰中的G/A亚基（通过具有Fisher最小显著性差异[LSD]的ANOVA，p = 0.0003JPH 3编码junctophilin-3，对调节神经元兴奋性很重要。在除小胶质细胞外的所有细胞类型中，该JPH 3相关峰与AD和对照样品中的JPH 3表达高度相关（r = 0.64，q2.23 10- 16）该连锁峰位于JPH 3TSS上游45，503bp处，并且也与ZCCHC 14-DT连锁，尽管相关性低得多（r =0.36，q 2