工程7（2021）1149微生态学研究工程仿生血小板膜包覆纳米颗粒阻断金黄色葡萄球菌细胞毒性并保护免受致死性全身感染Jwa-Kyung Kima，b，c，Chang，Satoshi Uchiyamac，Hua Gongd，Alexandra Streamc，Liangfang Zhangd，e，Victor Nizetc，f，a韩国翰林大学圣心医院内科肾脏研究所肾脏科，安阳14068b韩国翰林大学圣心医院临床免疫科，安阳14068c美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校儿科宿主微生物系统和治疗部d美国加州大学圣地亚哥分校纳米工程系，La Jolla，CA 92093eMoores Cancer Center，University of California San Diego Health，La Jolla，CA 92037，USAf美国加州大学圣地亚哥分校斯卡格斯药学院，La Jolla，CA 92093阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2020年2020年9月5日修订2020年9月7日接受2020年12月1日网上发售关键词：纳米颗粒纳米海绵血小板金黄色葡萄球菌A B S T R A C T金黄色葡萄球菌（S.金黄色葡萄球菌）是一种主要的人类病原体，其能够产生严重的侵入性感染，例如具有高发病率和死亡率的菌血症、脓毒症和心内膜炎，并因日益广泛的抗生素耐药性而加剧，例如耐甲氧西林菌株（MRSA）。S.金黄色葡萄球菌的发病机制是由毒素的分泌引起的，所述毒素例如膜损伤性成孔A毒素，其具有不同的细胞靶点，包括上皮、内皮、白细胞和血小板。在这里，我们检查了使用人血小板膜包覆纳米颗粒（PNP）作为仿生诱饵策略，以中和S。 金黄色葡萄球菌毒素和保持宿主细胞防御功能。PNPs被封锁S.金黄色葡萄球菌分泌毒素，从而支持血小板活化和杀血小板活性。PNPs可阻断S.金黄色葡萄球菌分泌毒素，从而支持巨噬细胞氧化爆发、一氧化氮产生和杀菌活性，并减少MRSA诱导的嗜中性粒细胞胞外陷阱释放。在MRSA全身感染的小鼠模型中，PNP给药减少了血液中的细菌计数并防止死亡。综上所述，本研究的结果提供了 PNPs在毒素中和、细胞保护和增强宿主对入侵S.金黄色葡萄球菌感染。©2020 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CCBY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍血小板是血液循环中大量的小无核细胞碎片。血小板的经典功能涉及调节血液凝固和血管完整性。然而，新出现的证据已经揭示了血小板在感染性疾病中作为前哨效应细胞的作用[1对入侵病原体的先天免疫反应受到血小板串扰的显著影响，因为后者可以感知危险信号并作出反应*通讯作者。电子邮件地址：kjk816@hallym.or.kr（J.-K. Kim），vnizet@health.ucsd.edu（V.Nizet）。并引导白细胞到达损伤、炎症或病原体入侵的部位[4原住民有多种与宿主防御相关的确定角色[1，2，8，9]。它们可以通过释放抗微生物肽（包括防御素[10]、凯萨林菌素[11]、杀凝血酶素[12]和杀激肽[13]）直接杀死微生物。血小板还可以聚集以捕获微生物并限制病原体传播[14]。通过各种不同的机制，血小板调节储存在颗粒中的各种细胞内介质的释放[3]。这些分子可以诱导炎症并直接或间接影响免疫系统效应细胞的募集和活性[15]。血小板-白细胞和血小板-微生物相互作用的机制https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.09.0132095-8099/©2020 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可从ScienceDirect获取目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engJ. - K. Kim，S. 内山H. Gong等人工程7（2021）11491150·×-···受体[16]、Fc-c受体IIa[17]、Toll样受体（TLR）[18]、糖蛋白（GP）总之，血小板不仅仅是凝血剂;它们在宿主免疫和炎症反应的良好平衡中起着关键作用。金黄色葡萄球菌（S.金黄色葡萄球菌），包括耐甲氧西林菌株（MRSA），是一种主要的机会性革兰氏阳性细菌病原体，其产生多种疾病，包括侵入性血流感染、败血症和心内膜炎[21，22]。深层S。金黄色葡萄球菌感染通常伴有明显的免疫失调，部分由一系列分泌的毒素毒力因子（包括α-毒素）引起。S.金黄色葡萄球菌毒素可与宿主细胞上的同源表面受体结合，并通过形成膜孔、破坏信号转导途径或激活降解宿主分子的酶而损害其完整性和功能[23，24]。由于分泌毒素在驱动S.金黄色葡萄球菌病的发病机制、去除或中和毒素的方法已经成为改善患者结果的潜在治疗目标。在这方面，用于毒素中和的靶向抗体或纳米医学方法已经获得关注[25一种用于生物解毒的这样的方法涉及通过仿生起作用的天然细胞膜涂覆的纳米颗粒[28，29]。其独特的结构允许这些纳米颗粒作为诱饵，像海绵一样非特异性地吸收细菌膜毒素因子，从而中和因子的细胞溶解活性，而不考虑其精确的分子结构[30]。例如，通过用天然红细胞膜包被聚合物纳米颗粒开发的红细胞（RBC）膜包被的在大肠杆菌脓毒症小鼠模型中，巨噬细胞膜包被的纳米海绵结合细菌脂多糖（LPS）并隔离促炎细胞因子，从而减少细菌传播并在治疗小鼠中提供针对死亡的保护[34]。血小板已被证明有助于宿主的抵抗力对入侵的S.金黄色葡萄球菌感染。抗体介导的小鼠血小板耗竭受损S。与对照小鼠相比，金黄色葡萄球菌清除率更高，如肾脏中更高的细菌负荷、更夸张的细胞因子反应和存活率降低所证明的[35]。另一项研究表明，血小板可增强S.金黄色葡萄球菌通过腹腔巨噬细胞，可能通过依赖于血小板颗粒相关的B1-防御素的机制[8]。血小板是S.金黄色葡萄球菌A毒素，因为它们表达解整合素和金属蛋白酶含结构域蛋白10（ADAM 10），被鉴定的a-毒素在其表面膜上的受体[36]。在小鼠中，α-毒素介导的血小板损伤和聚集导致了S.金黄色脓毒症[37]。由于血小板在抵抗S. 金黄色葡萄球菌和病原体的膜毒素的目标，我们假设，可生物降解的聚合物纳米颗粒核心包被仿生人血小板膜，或血小板膜包被的纳米颗粒（PNP），可用于加强血小板介导的防御病原体。目前的工作提供了PNPs在毒素中和、细胞保护和增强宿主对入侵S.金黄色葡萄球菌感染。2. 材料和方法2.1. 血小板膜衍生血库批准的人O型阴性（通用供体）富血小板血浆（PRP）储存在标准酸-柠檬酸盐中，从圣地亚哥血库获得临床使用的有效期 24-48 小时内的葡萄糖（ACD）;该PRP用作全功能血小板膜的来源，基于我们之前的调查[38]。在PRP制备液中加入含50 mmol·L-1乙二胺四乙酸（EDTA;Thermo Fisher Scientific，USA）和300 l L蛋白酶抑制剂（PI;Thermo Fisher Scientific，USA）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液以限制血小板活化。在室温下以4000转/分钟（rpm）离心血小板15分钟;然后弃去上清液，将沉淀的血小板重悬于PBS + 1 mmol L-1EDTA和PI片剂中2.2. 血小板纳米海绵制剂将血小板制剂的等分试样（1.2mL）（约3 × 109个细胞）用于包被1 mg聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）核心.通过三个冻融循环获得血小板膜悬浮液：首先将等分试样在80 °C下冷冻，然后解冻至室温，然后以8000相对离心力（rcf）离心7分钟以沉淀。最后，将它们重悬于水中并通过Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo FisherScientific，USA）定量。PNPs分两个阶段得到：首先，使用溶解在丙酮中的0.67 dL g-1羧基封端的50：50 PLGA（LACTEL可吸收聚合物）以10 mg mL-1通过纳米沉淀预沉淀约80 nm的聚合物核;将1mL溶解的PLGA快速添加到3 mL水中，并将开放的混合物搅拌12 h以蒸发丙酮至最终的纳米颗粒浓度为100 mg mL-1。2.5 mg mL-1.其次，将血小板膜制剂与纳米颗粒核心以1：1的比例（膜蛋白与聚合物重量）组合。通过使用42 kHz的频率和100 W的功率超声处理5 min，使血小板膜囊泡分散并与PLGA颗粒融合，以实现膜包衣。2.3. PNP粒径分布及包覆分析1：1的膜蛋白与聚合物重量比产生比PLGA核稍大的颗粒，其表面ζ电位接近血小板膜衍生的囊泡的表面ζ电位，证实成功的膜包衣。实际上，包衣增强了PLGA核的胶体稳定性，PLGA核在生理盐浓度下易于聚集。通 过动态光散射（Zetasizer Nano ZS ZEN 3600; MalvernPanalytical Ltd.，UK），一式三份，用于尺寸和一致性。对于透射电子显微镜（TEM），将PNP置于用1%乙酸双氧铀（EM Sciences，USA）染色的400目碳涂覆的铜网（Electron Microscopy Sciences，USA）上，并在Zeiss Libra 120 PLUS能量过滤透射电子显微镜（EF-TEM，Germany）下研究。2.4. 细菌菌株和a毒素本研究使用MRSA菌株USA 300/TCH 1516及其同基因人白细胞抗 原 （ HLA ） 突 变 体 （ Sun BioRxiv ， USA ） 将 菌 株 在 Todd-Hewitt肉汤（THB; Thermo Fisher Scientific，USA）中在37 °C下繁殖对菌落形成单位（CFU）进行细菌接种确认的稀释平板接种。重组α-毒素购自Sigma-Aldrich（#H9395; USA）。J. - K. Kim，S. 内山H. Gong等人工程7（2021）11491151····×·····××2个2个2.5. 血小板分离在知情同意的情况下，通过简单的静脉切开术从健康人供体收集人静脉血，并用ACD（1：6 v/v; Sigma-Aldrich，USA）抗凝。从以1000 rpm离心10 min的血液制备PRP，无制动，仅使用PRP组分的上三分之二，以避免白细胞污染。通过以1500 rpm离心10 min从PRP中分离血小板，然后在室温下重悬于无血清Roswell Park MemorialInstitute（RPMI）1640培养基（Thermo Fisher Scientific，USA）中。2.6. 血小板细胞毒性试验经PNP预处理的人血小板（1 ×107/孔）（1 mg·mL-1）或溶剂对照置于室温下2.10. 巨噬细胞杀菌试验对于THP-1分化的巨噬细胞杀菌试验，用1 mg mL-1 PNP或载体对照处理不同的巨噬细胞30 min，然后用MRSA以MOI = 1.0个细菌/细胞感染。使用Triton X-100（0.025%; Sigma-Aldrich，USA）裂解细胞，并连续稀释用于CFU计数和计算与原始接种物相比的MRSA杀灭百分比。2.11. 巨噬细胞氧化爆发和一氧化氮产生测定对于氧化爆发测定，将THP-1分化的巨噬细胞用25μ mol/L的2，7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA; Thermo Fisher Scientific，USA）在缺乏Ca和Mg的Hank平衡盐溶液（HBSS; Mediatech，USA）中培养30min，然后暴露于3μLMRSA培养上清液中1小时将样品在500g（g= 9.8 m s-2）下离心5 min，并使用Promega测定法测定从血小板释放到培养基中的乳酸脱氢酶（LDH）2.7. 血小板杀菌试验为了评价分离的血小板对细菌的杀灭作用，首先在室温下用1.0 mgmL-1 的 PNP 或 载 体 对 照 预 处 理 分 离 的 血 小 板 30 min ， 然 后 用10μLMRSA以感染复数（MOI）=0.1个细菌/血小板感染1 h。对于CFU计数和计算与原始接种物相比的MRSA杀灭百分比，用SonicDismembrane 550（Thermo Fisher Scientific，USA）超声处理稀释板3秒。2.8. 血小板活化试验通过在37 °C下在THB培养基中生长过夜的细菌培养物的离心（4000 rpm，15 min）收集MRSA上清液。然后，将1× 107个血小板用1.25培养h PNP或载体对照。在37 °C下孵育后，将样品在室温下用藻红蛋白（PE）抗人CD 62 p（P-选择素）抗体（Biolegend，USA）染色20分钟，然后在ImL PBS中稀释。通过FACSCalibur流式细胞术（BD Biosciences，USA）测量P-选择素的表达，并使用Flowjov10.2软件（Becton，Dickinson and Company，USA）进行分析通过大小门控分离人血小板和PNP;然后分析人血小板群体的PE平均荧光。2.9. 巨噬细胞制备和细胞活力测定在RPMI + 10%胎牛血清（FBS）中培养人髓性白血病单核细胞（THP-1）（美国典型培养物保藏中心（ATCC），USA）。用25nmol L-1佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA; Sigma-Aldrich，USA）将THP-1分化成巨噬细胞 对于THP-1的细胞毒性，将5 × 10 -5THP-1接种在每个孔中，并在室温下用1 mg mL-1的PNP或载体对照预处理30 min，然后暴露于一定范围的MRSA上清液剂量（1.25-10.00μL）在37 ℃下搅拌1小时。使用3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑（MTT ）细胞增殖测定试剂盒（ab 211091;Abcam plc.，USA），其通过在590 nm处的吸光度读取来定量MTT至甲瓒的腺苷三磷酸（ATP）转化在室温下旋转30分钟。用MRSA（MOI = 1.0个细菌/细胞）感染，有或没有PNP，并在37 ℃下孵育。每15-30分钟，通过SpectraMax M3（Molecular Devices，USA）比较485 nm激发/520 nm发射处的荧光强度。为了在相同暴露条件下定量THP-1分化的巨噬细胞中的亚硝酸盐产生，根据制造商的方案使用Greiss试剂（Promega，USA）。2.12. 人中性粒细胞胞外陷阱染色和定量根 据 制 造 商 的 说 明 书 ， 使 用 PolymorphPrep （ ProgenBiotechnik GmbH，Germany）从健康成年人供体收集的血液中分离嗜中性粒细胞，所述健康成年人供体已给出知情同意接着，将5 ×10 5个嗜中性粒细胞置于24孔板的孔中，用载体对照、25 nmol L-1PMA、单独的MRSA或与PNP预混的MRSA刺激20min（MOI=10个细菌/嗜中性粒细胞），并在37℃下孵育3h。为了可视化，将在4%多聚甲醛中固定的细胞用PBS + 2%牛血清白蛋白（BSA; Sigma-Aldrich，USA）中的抗髓过氧化物酶（MPO）的抗体（1：300; Calbiochem，USA）染色1小时，然后置于Alexa Fluor 488山羊抗兔（1：500; LifeTechnologies，USA）中45分钟，最后用在2% PBS-BSA中稀释的1lmol L平行地，使用Quant-iTTM PicoGreen dsDNA测定试剂盒（Invitrogen，USA）在孔上定量中性粒细胞胞外陷阱（NET），其中加入微球菌核酸酶溶液以将NET的DNA释放到上清液中;向溶液中加入500 mmol L根据制造商的说明书制备PicoGreen溶液2.13. 细胞因子定量测定根据制造商的方案，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（RDsystems，USA）从感染的THP-1分化的巨噬细胞上清液（感染后4、8和24小时）定量细胞因子白细胞介素（IL）-8和IL-1b。实验一式三份或一式四份进行。2.14. 体内小鼠S. 金黄色葡萄球菌感染实验对于存活研究，MRSA培养物在THB中生长至对数中期，并在PBS中洗涤一次。然后，腹膜内（i.p.）注射到远系繁殖的10- 12周龄的CD1小鼠（CharlesRiver，USA）中。对于PNP治疗组，100μLJ. - K. Kim，S. 内山H. Gong等人工程7（2021）11491152·静脉注射（i.v.）两次，在MRSA感染后立即和第一次注射后3小时。每天监测存活率，持续6天。在使用相同MRSA攻击剂量和PNP处理方案的单独攻击实验中，在6 h处死小鼠以测定细菌CFU单位并定量血清和脾脏中的肿瘤坏死因子（TNF）2.15. 统计分析所有研究均一式两份或一式三份进行，并独立重复至少两次。所有数据均以平均值与平均值的标准误差（SEM）或标准偏差（SD）作图。通过单因素方差分析（ANOVA）或非配对双尾Student2.16. 伦理批准动物研究根据UC San Diego Institutional Animal Care and UseCommittee（IACUC;方案S 00227 M）批准的方案进行;尽一切努力减少动物数量并使痛苦最小化。用于血小板分离的血液是在UC SanDiego人类研究保护计划批准的书面知情同意书下通过静脉穿刺从健康志愿者获得的。3. 结果3.1. PNPs的制备和分析在这项研究中，我们的目标是构建由包裹在天然血小板双层膜中的PLGA聚合物核心组成的PNP。血小板膜壳提供了对母体血小板表面的忠实模仿，因此可以吸收毒素本发明的目的是为了降低血小板毒性并保护血小板对MRSA感染的防御功能（图1（a））。已发现来自最近过期（24-EDTA用作抗凝剂，螯合二价阳离子（包括钙），避免激活凝血过程，同时稳定血小板[38]。此外，添加PI以阻断血小板聚集[38]。超声处理程序产生用于融合到PLGA核心上的膜囊泡内部聚合物核心稳定外膜，防止其塌陷和与其他膜融合，优化体外和体内稳定性。膜涂覆后，PNP直径从（88.4 ± 5.6）nm增加到（120.0 ± 4.8）nm，如通过动态光散射所评估的，反映了聚合物核心与细胞膜双层的包封（图1A和1B）。1（b）和（c））。TEM清楚地显示PLGA聚合物核被单层膜均匀地包覆，表明成功的PNP形成（图1B）。 1（d））。3.2. PNPs预防MRSA上清液细菌毒素包括S.金黄色葡萄球菌A-毒素可损伤和抑制宿主细胞的功能[35，39]。我们首先研究了PNPs是否可以保护完整的人血小板免受MRSA上清液的细胞毒性作用。当人血小板与MRSA上清液孵育1小时时，观察到反映血小板损伤的显著LDH释放;然而，在PNP存在下，这显著减少：在单独的MRSA上清液中为0.52 ± 0.13（光密度（OD）值）（P=0.002）（图2（a））。与富含抗微生物肽的颗粒释放相关的血小板活化[2]可以是Fig. 1. PNPs的制定和分析。(a)模型显示了我们应用PNP调节免疫细胞、病原体结合和控制体内治疗功效的原理。（b，c）动态光散射以评估血小板膜涂覆之前和之后PLGA聚合物核的流体动力学尺寸（直径，以nm计）。(d)使用乙酸双氧铀复染的衍生的PNP的TEM图像。J. - K. Kim，S. 内山H. Gong等人工程7（2021）11491153通过P-选择素的表面表达定量 在将人血小板暴露于MRSA上清液后，我们发现与PNP共孵育显著减少了P-选择素表达的时间，并显著增加了其表达的强度（图1A和1B）。 2（b）和（c）），表明PNPs可以帮助保留这种关键的血小板应答功能。为了检查血小板细胞保护和功能活化是否改善先天免疫活性，在存在或不存在PNP的情况下评估血小板对MRSA的杀伤在PNP处理后观察到血小板MRSA杀灭的显著增强（图1A和1B）。（2）（d）和（e）），建议PNPs对MRSA诱导的血小板损伤的保护作用可能与其增强机体防御功能有关。3.3. PNPs预防MRSA上清液MRSA上清液对THP-1活力的影响在预先将MRSA上清液与PNP预孵育30分钟或不预孵育30分钟的情况下进行检查。如图3（a）中所示，在以下存在下观察到LDH释放减少近75%：图二、PNPs可预防MRSA上清液（S/N）诱导的人血小板损伤和功能障碍（a）PNP降低MRSA上清液诱导的血小板细胞毒性，如通过LDH释放和OD值测量的;细胞毒性在单独的MRSA上清液中为0.52 ± 0.13，在PNP处理的情况下为0.27 ± 0.08（P= 0.002）。（b，c）在存在或不存在PNP的情况下暴露于MRSA上清液的血小板上的P-选择素PNP处理导致P-选择素表达在早期时间点（10分钟）开始显著增加（d，e）PNP治疗后血小板活力增加伴随着MRSA杀灭的改善。**：P0.01; *：P0.001。图3.第三章。PNPs可预防MRSA上清液（S/N）诱导的巨噬细胞损伤和功能障碍（a）LDH细胞毒性试验和（b）MTT测定表明PNP处理显示THP-1细胞毒性降低约75%（c）PNP还改善了MRSA上清液处理后THP-1分化的巨噬细胞的活力(d)用PNP预处理THP-1分化的巨噬细胞显示出更高的杀菌效率，而与细菌载量和孵育时间无关。* ：P0.05;**：P0.01; *：P0.001。J. - K. Kim，S. 内山H. Gong等人工程7（2021）11491154×·PNPs。通过MTT测定进一步评估细胞活力，其显示当MRSA上清液与PNP预混合时，与对照相比，处理1小时后THP-1的活力显著增加（图3（b））。还在THP-1分化的巨噬细胞中测量了LDH释放，并揭示了PNP的显著保护作用（图3（c））。最后，在存在或不存在PNP的情况下，用活MRSA感染THP-1分化的巨噬细胞，表明纳米海绵处理显著增加了巨噬细胞对病原体的杀伤（图1B）。 3（d））。3.4. PNP对细胞毒性的保护保护保留了巨噬细胞和中性粒细胞效应子应答我们进一步检查了PNP对参与抗菌应答的某些关键巨噬细胞功能的影响。活性氧簇（ROS）的产生，即氧化爆发，是巨噬细胞抗菌防御的关键因素，如S.在氧化爆发功能受损的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶缺乏症（慢性肿瘤性疾病）患者中的金黄色葡萄球菌感染[40]。PNP处理增加响应于MRSA暴露的THP-1分化的巨噬细胞ROS产生（图4（a））。诱导型一氧化氮合酶（iNOS）产生的一氧化氮也有助于抗菌防御，更严重的沙门氏菌证实了这一点。在iNOS缺陷小鼠中的金黄色葡萄球菌感染[41]。PNP处理同样促进了响应于MRSA暴露的THP-1分化的巨噬细胞一氧化氮的产生（图4（b））。S.金黄色葡萄球菌感染诱导巨噬细胞焦亡，这是一种依赖于炎性小体激活并与IL-1b释放相关的细胞死亡程序[42]。IL-1b的产生在早期时间点适度减少（图4（c））;这与细胞毒性试验中LDH释放减少一致（图3（a）），表明焦亡是巨噬细胞对S.金黄色葡萄球菌攻击，并且相关的细胞毒性和细胞因子释放的程度可以通过PNP毒素吸收部分减轻。血小板表达IL-1b受体（IL-1 R）[43]，因此PNP对IL-1b细胞因子的隔离也可能造成了观察到的差异。最后，S。金黄色葡萄球菌毒素[44，45]和活化血小板[46]也会引起中性粒细胞胞外陷阱（NET），具有潜在的促炎和促凝血作用，可能加重脓毒症[47]或心内膜炎[48]。 PNP处理在体外显著抑制MRSA诱导的人嗜中性粒细胞的NET形成，如通过免疫染色可视化的和通过释放DNA的PicoGreen定量测量的（图1A和1B）。4（d）和（e））。3.5. PNPs改善鼠MRSA全身感染模型的存活率我们的上述体外研究表明，PNPs阻断MRSA诱导的血小板和巨噬细胞的细胞毒性，增强两种细胞类型的抗菌效果。这些发现表明PNPs对S的潜在治疗益处。金黄色葡萄球菌感染。在先前用于药代动力学和生物分布评估的啮齿动物静脉注射研究中，超过90%的PNP在30分钟内分布到组织中，最显著的是在肝脏和脾脏中[38]。重要的是，在非感染性适应症（包括免疫性血小板减少症[49]和动脉粥样硬化[50]）的鼠模型中先前使用PNP时未观察到异常凝血。我们挑战了八只老鼠的小组，3108CFUMRSA，100μL体积，i.p. 诱导全身感染，第对于PNP治疗组，我们在MRSA感染后立即将5 mg mL-1 PNP直接IV注射到血流中，并在第一次注射后3 h再次注射（图1B）。 5（a））。两种剂量的目的是提供适度扩展的治疗覆盖范围，寻求减轻病原体介导的毒性损伤，预防细胞因子风暴的传播，并预防败血症导致的早期死亡。用PNP治疗的小鼠的存活率显著提高，尽管没有抗生素治疗，但37.5%的小鼠存活5天，而对照组中的所有小鼠在前48小时内死亡（图1B）。 5（b））。在使用相同的攻击和处理条件的单独实验中，我们在MRSA攻击后6小时收集血液用于测定细菌CFU和血清细胞因子水平。两剂量PNP处理与血液中MRSA CFU的显著（P = 0.036）减少相关（图1A和1B）。 5（c）和（d）），并略有减少的趋势图四、PNPs对巨噬细胞活化和中性粒细胞杀菌机制的影响（a）PNP处理增加巨噬细胞氧化爆发，如通过DCFH-DA测定超氧化物产生所测量（b）在PNP处理的巨噬细胞中观察到反映一氧化氮产生的亚硝酸盐产生增加（c）在PNP处理的巨噬细胞中在最早（4小时）时间点减少细胞因子IL-1b的产生（d）在PNP处理存在或不存在的情况下由MRSA引发的人NET的免疫染色(e)通过PicoGreen测定对NET进行定量。* ：P0.05; **：P0.01; *：P0.001。J. - K. Kim，S. 内山H. Gong等人工程7（2021）11491155图五. PNPs改善鼠MRSA全身感染模型的存活率。(a)体内实验设置示意图。(b)腹膜内注射MRSA（每只小鼠3×108在接种细菌后0和3 h分别注射PNP 5 mg·mL-110 0lg，共2次（每组 8只）。PNPs治疗提供了显著的生存获益。（脾脏中未达到统计学显著性的计数。与对照组相比，PNP治疗组中响应于MRSA攻击的血清IL-6水平也降低（图1B）。 5（e））。4. 讨论在这项研究中，我们提供了一个证明的原则，治疗潜力的PNPs在系统性MRSA感染。这种益处可能是多因素的，并且可能包括：①减少毒素相关的血小板损伤，这允许更快速和有效地部署血小板抗微生物活性;②保护吞噬细胞如巨噬细胞免受MRSA溶细胞损伤，允许它们更有效地部署ROS和NO并实现有效的细菌杀伤;以及③隔离某些细菌毒素（例如，孔形成毒素）。此外，由于血小板表达TLR（例如，TLR2）和细胞因子受体（例如，IL-1 R），它们可通过抑制促炎性细菌细胞壁成分和细胞因子来调节脓毒症的过度炎症。后一种机制将与巨噬细胞膜包被的纳米颗粒的体内治疗作用平行，其在LPS内毒素血症和大肠杆菌脓毒症的鼠模型中提供针对致死性的保护[34]。虽然先前的工作表明RBC纳米海绵保护小鼠免受来自S.金黄色葡萄球菌上清液[31]，目前的工作与PNP是第一次报告的保护仿生膜包被的纳米粒子对全身感染的活S。金黄色。最近的一项研究表明，败血症的贡献，全世界范围内的人类死亡率为19.7%[51]，并且仍然没有专门批准用于治疗脓毒症的药物[52]。抗生素耐药菌株如MRSA的数量增加进一步使有效的脓毒症治疗复杂化[53]。在此背景下，在脓毒症中使用PNP或其他细胞膜包被的纳米海绵提供了一种更涉及靶向单个毒素或宿主炎性因子的特定分子结构的单克隆抗体或其它平台 可能支持PNP有效治疗特征的其他发现包括以下证据：它们减少巨噬细胞摄取，不诱导自体血浆中的人补体活化，选择性结合人和啮齿动物的受损血管内皮细胞，同样结合血小板粘附病原体[31]，可能有利于其在血管内S的常见部位蓄积。金黄色葡萄球菌感染。总之，我们的数据表明，PNPs可以通过吸收循环毒素在全身性MRSA感染期间保护血小板，从而使血小板遭受更少的损伤，存活更长时间，活化更快，并具有更强的抗菌作用。PNPs还可以保护和支持巨噬细胞或其他吞噬细胞类型的先天免疫功能。这种仿生解毒策略值得进一步探索，作为改善MRSA血流患者临床的一种替代疗法，从而扩展了目前的临床管理方法。5. 这项研究全身性MRSA感染的小鼠研究不能完全概括人类感染的速度和动力学，因为小鼠对病原体具有相对抗性，并且需要非常高的攻击剂量才能引起器官传播和死亡风险。此外，在假定脓毒症患者中，需要快速临床干预-通常在病原体的微生物确认之前-并且患者可能具有一种或多种增加不良结果风险的合并症。因此，纳米海绵疗法被设想为护理标准的补充。确认这 项 工 作 得 到 了 美 国 国 立 卫 生 研 究 院 资 助 HL 125352 和U01AI124316（VN）的支持。J. - K. Kim，S. 内山H. Gong等人工程7（2021）11491156遵守道德操守准则Jwa-Kyung Kim 、Satoshi Uchiyama、Hua Gong 、AlexandraStream、Liangfang Zhang和Victor Nizet声明他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。引用[1] 黄智英，詹CN，佩特里B，Chrobok NL，Kubes P. 枯否细胞上的血小板与血源性病原体的成核先于其他先天性免疫并有助于细菌清除。Nat Immunol 2013;14（8）：785-92.[2] Mantovani A，Garlanda C.先天免疫和炎症中的血小板-巨噬细胞伙伴关系。NatImmunol2013;14（8）：768-70.[3] Garraud O，Cognasse F.是血小板细胞吗？如果是，它们是免疫细胞吗？免疫学前沿2015;6：70。[4] McDonald B，Dunbar M.血小板和血管内免疫：血流感染和败血症时血管间隙的监护者。《前线免疫学》2019年;10：2400。[5] GaertnerF，Massberg S. 巡逻血管边界：血小板免疫感染和癌症。Nat RevImmunol2019;19（12）：747-60。[6] Kerris EWJ，Hoptay C，Calderon T，Freishtat RJ.止血和脓毒症中的血小板和血小板细胞外囊泡。J Invest Med 2020;68（4）：813-20.[7] Deppermann C，Kubes P.开始火灾，杀死虫子：血小板在炎症和感染中的作用。先天免疫2018;24（6）：335-48。[8] Ali RA，Wuescher LM，Dona KR，Worth RG.血小板通过直接杀菌活性和增强巨噬细胞活性介导宿主对金黄色葡萄球菌的防御。免疫学杂 志 2017;198（1）：344-51。[9] 李 文 龙 ， 李 文 龙 ， 李 文 龙 . 血 小 板 对 先 天 性 免 疫 反 应 的 调 节 。 FrontImmunol2019;10：1320.[10] Valle-Jiménez X，Ramírez-Cosmes A，Aquino-Domínguez AS ，Sánchez-PeñaF ， Bustos-Arriaga J ， Romero-Tlalolini MDalan ， et al. Human plateletsandmegakaryocytes express defensin alpha 1. 2 0 2 0 ;31（3）：344-54。[11] Pircher J，Czermak T，Ehrlich A，Eberle C，Gaitzsch E，Margaret A，et al.Cathelicidins 引 发 血 小板 介 导 动 脉 血 栓形 成 和 组 织 炎 症 。 Nat Commun2018;9（1）：1523.[12] Kwakman PHS，Krijgsveld J，de Boer L，Nguyen LT，Boszhard L，VreedeJ，等. 天然的杀凝血酶素-1和未折叠的杀凝血酶素-1通过不同的结构元件发挥抗微生物活性。J Biol Chem 2011;286（50）：43506-14.[13] TrierDA，Gank KD，Kupferwasser D，Yount NY，French WJ，MichelsonAD，et al. 血小板抗葡萄球菌反应通过P2X1和P2Y12受体诱导的活化和激肽释放而发生。Infect Immun2008;76（12）：5706-13.[14] GaertnerF，Ahmad Z，Rosenberger G，Fan S，Nicolai L，Busch B，等. 移动的血小板是收集和捆绑细菌的机械清道夫。Cell2017;171（6）：1368-82。[15] RossaintJ，Margaret A，Zarbock A. 血小板在白细胞募集和炎症消退中的作用。Front Immunol2018;9：2712.[16] Kim H，Conway EM.早期动脉粥样硬化形成中血小板和补体的相互作用。前血管医学2019;6：131。[17] 放大图片作者：Ilkan Z，Watson S，Watson S，Mahaut-Smith M. P2 X1受体扩增Fcc RIIa-诱导人血小板内Ca2+升高和功能反应。血栓血液学2018;118（2）：369-80。[18] CognasseF ， Nguyen KA ， Damien P ， McNicol A ， Pozzetto B ， Hamzeh-Cognasse H，et al. The inflammatory role of platelets via their TLR and Siglecreceptor. 免疫学前沿2015;6：83。[19] Berny-Lang MA ， Jakubowski JA ， Sugidachi A ， Barnard MR ， MichelsonAD ， Frelinger AL. P2Y12receptor blockade augments glycoprotein IIb-IIIaantagonist inhibition of platelet activation ， aggregation ， and procoagulationactivity. 美国心脏病学杂志2013;2（3）：e000026。[20] Kroll MH，Harris TS，Moake JL，Handin RI，Schafer AI.血管性血友病因子与血小板GpIb结合启动血小板活化信号。J Clin Invest1991;88（5）：1568-73.[21] Tong SYC，Davis JS，Eichenberger E，Holland TL，Fowler VG Jr. 金黄色葡萄球菌感染：流行病学，病理生理学，临床表现和管理。临床微生物学评论2015;28（3）：603-61。[22] Turner NA，Sharma-Kuinkel BK，Maskarinec SA，Eichenberger EM，ShahPP，Carugati M，et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus：an overviewofbasic and clinical research. Nat Rev Microbiol 2019;17：203-18.[23] Seilie ES，Bubeck Wardenburg J.金黄色葡萄球菌孔形成毒素：病原体和宿主复杂性的界面。Semin Cell Dev Biol2017;72：101-16.[24] Bhakdi S，Tranum
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