2022年秋季发表的有创神经记录芯片研究

芯片|Vol 1 |2022年秋季是的ZP. 等人芯片1，1000241月8×芯片研究文章BIOCHIPSDOI：10.1016/j.chip.2022.100024一种用于有创神经记录的流苏型多层柔性探针叶紫鹏1，景奇1，倪怡玲2，吴志勇1，肖晓2，熊&世胜1，1复旦大学信息科学与技术学院，上海200433 2复旦大学智能科学技术研究院，上海200433电子邮件：xiaoxiao@fudan.edu.cn（Xiao Xiao），sxiong@fudan.edu.cn（Shi-Sheng Xiong）Cite as：Ye，Z.-P. 等人用于侵入性神经记录的流苏型多层柔性探针芯片1，100024（2022）.https://doi.org/10.1016/j.chip.2022.100024收稿日期：2022年接受日期：2022年在线发布：2022年有创神经探针是脑皮质内神经信号记录系统的关键部件之一。然而，它们可在麻醉期间和麻醉后引起脑损伤和组织反应。因此，在脑研究中需要具有高柔性、生物相容性和简单植入方法在这里，我们提出了一种新的方法来制造多层柔性流苏型神经探针，使用低成本的无掩模激光直写光刻，结合简单的释放和组装方法来制备整个植入系统。该探头有32个记录电极，面积为88 μm2，排列成两排不同深度，16个分离柄，旨在大范围记录神经信号。聚酰亚胺和金分别用作绝缘层和导电层。在聚乙二醇（PEG）涂层的帮助下，雄穗结构被机械增强以成功植入，并且我们的形态学表征显示涂层探针的直径小于50 µm。力学性能测试也证明其具有脑植入所需的刚度电化学测试结果表明，该探针经简单镀金处理后具有较低的阻抗。最后，在体实验表明，我们的探针可以成功地用于神经记录。关键词：神经探针，流苏型，微加工工艺，无掩模光刻，聚酰亚胺介绍植入式神经探针是用于记录或干扰神经活动状态的电生理设备，已广泛用于神经生物学的基础研究1，2。大多数可用于脑深部区域信号记录的植入式神经探针由具有高杨氏模量的材料探针（Si衬底）6-8，或涂覆有绝缘体的金属微丝（金属微丝）9、10。尽管所有这些探针都可以容易地植入并且在急性记录中表现良好11、12，但是它们在机械强度和几何形状上与动态和柔性脑组织显著不匹配，这导致强烈的免疫应答13。因此，更多的神经胶质细胞聚集在界面处并阻碍信号记录14、15。使用时在慢性信号记录中，实验对象的正常运动可能导致失配加剧，探头逐渐偏离原始位置，记录信号的质量下降16。近年来，研究者更倾向于开发基于柔性材料的植入式神经探针，大量研究表明，SU- 817、18、19、聚对二甲苯20-22和聚酰亚胺23-25等生物相容性强的柔性材料可显著减少植入过程中和植入后的组织损伤。通过使用柔性材料，探针更好地与脑组织配合。结果，生物体的组织免疫反应降低26、27，这有利于稳定的长期慢性神经信号记录28。虽然柔性探针在以往的研究中表现出了良好的应用性能，但由于柔性结构通常无法提供足够的压力，大多数柔性探针不能直接穿透脑组织定位于目标记录区域。一些研究表明，在植入过程中，柔性探针无法穿透硬脑膜，或探针的实际植入位置偏离预期29。因此，已经开发了附加的辅助策略来改善植入期间柔性探针的暂时刚度，例如使用由SU-8柄30制成的可移除的梭，使用钢针将探针引导到脑组织31、32中，或者使用注射器将网状探针注射到目标位置33处。然而，其他器械的引入在最近的一项研究中，研究人员提出了一种新型的柔性神经探针，称为神经流苏，其植入物由许多具有三明治结构的离散电极丝组成34，35。通过将神经流苏底部浸入熔融的聚乙二醇（PEG）中，所有流苏状电极丝在表面张力和毛细管力的作用下粘附在一起形成束，导致横截面积大大减小，而包裹在周围的固化的PEG增强了植入过程中的机械刚度。该研究为解决种植体植入困难问题提供了一种新的途径，无需引入复杂的辅助装置，也无需扩大种植体覆盖区。然而，与基于CMOS的神经探针36、37相比，基于CMOS的神经探针36、37可以为每个柄提供多个通道，由于记录位点的数量较多，单层神经雄穗的记录通道数受到互连轨道的宽度和密度的限制，导致在大的研究文章DOI：芯片|Vol 1 |2022年秋季是的ZP. 等人芯片1，1000242月8×频道数同时，神经雄穗的记录位点主要是水平排列的，根据活体实验结果，电极利用率低于预期。在设计和制造过程中可以进行一些改进，以进一步提高探头的性能。基于前面工作34，35的流苏设计和PEG机械增强方法，本文提出了一种新的流苏型柔性神经探针，其通过无掩模激光直写光刻来制造，可以容易地修改几何设计以满足各种需求并降低成本。该探头具有多层结构，提供更多的内在刚性，以避免屈曲，并增加了记录通道的数量，而不会扩大整体尺寸。此外，32个记录电极的多方向布置使得可以通过单个注入过程在大范围上记录信号在将探针连接到中间回路后，我们用PEG浸涂它，这提供了额外的机械增强以确保顺利植入。最后进行了在体神经记录，成功记录到内侧前额叶皮层（mPFC）的神经信号。利用光学显微镜、扫描电镜、电子拉力测试仪和电化学阻抗谱等对探针的结构、形貌、机械强度和电阻抗等关键性能进行了相对于原始的神经雄穗（当记录通道数相等时），我们设计的新探针可以进一步减小植入体的尺寸，提高通道的整体利用率，这有利于在更大的脑范围内研究神经活动结果和讨论形态学分析Fig. 1显示了所制造的探针的特定形态和结构。在探针的顶部，有两排宽为0.3 mm、长为0.8 mm的金焊盘，负责将信号传输到后端电路。这两排焊盘和相应的连接线制造在不同的聚酰亚胺层上，以实现电绝缘（图1a）。在探针的中间，有17根宽度为10 µm的电极丝，几个横向条带将所有电极丝限制在一起，形成网状结构，这将有助于植入并确保有序束的形成（图1b）。在探头的底部，两排电极垂直对称排列。除了中间的参比电极外，每个电极的面积为8 8 µm2，其接触面积是其他电极的四倍，一根灯丝上两个电极之间的距离设置为250 µm，旨在记录一个大脑区域（内侧前额叶皮层）不同层的神经信号 两个电极丝之间的距离为10 µm，每个电极丝设计为便于植入的柄形状（图1）。 1 c）。SEM图像揭示了所制造的探针的更多结构细节。可以观察到，两行电极在探针底部呈V形排列，上排电极的颜色比下排电极更亮（图1d），表明它们处于不同的高度：下排电极制作在厚度为1.5µm的聚酰亚胺层上;上排电极制作在总厚度为3 µm的两个聚酰亚胺此外，SEM图像（图1e）显示了由于在蚀刻工艺期间使用铝掩模而导致的非常陡峭的侧壁和平坦的表面探头的内部结构如图1f和图S1所示两个100 nm厚的金层封装的聚酰亚胺，只留下两个暴露的记录网站在每个电极丝。由于聚酰亚胺具有小的弹性模量，因此优于-图1|制作探针的形态和结构。光学显微镜图像：a，神经探针的焊盘和互连线（比例尺：100 µm）; b，探针的增强网格面积（比例尺：50 µm）; c，探针的32个电极记录位点和1个参比电极（比例尺：50 µm）。SEM图像：d，所有电极的概览（比例尺：40 µm）;e，电极的详细视图，其中参比电极（中间）面积是记录电极面积（左/右）的四倍（比例尺：8 µm）。示意图：f，探头的一个电极丝，显示由三个聚酰亚胺层和两个金层组成的夹层结构。研究文章DOI：芯片|Vol 1 |2022年秋季是的ZP. 等人芯片1，1000243月8=×图2|组装探针的电镀和电化学阻抗测试。a、电镀工艺。组装好的探头、地线、电镀液和电镀装置形成一个完整的电路回路。b，在不同频率下电镀Au之前和之后所有电极的平均阻抗考虑到其稳定性、生物相容性和电绝缘性能29、38，我们选择其作为基底和绝缘层。考虑到聚酰亚胺的重要性，我们采用多步真空退火工艺形成超薄聚酰亚胺薄膜，保证了聚酰亚胺39的良好质量。我们使用了几种标准的微制造方法，包括无掩模光刻，金属沉积，和反应离子蚀刻（RIE），以预处理的多层，高密度结构的探针。所有过程均在洁净室中完成，以确保不引入颗粒或其他污染物。机械表征进行机械测试以确保制造的探针是柔性的，但足够坚固以完成植入。杨氏Eσ（1）ε我们的聚酰亚胺的杨氏S2b（通常，聚酰亚胺的杨氏抗弯刚度（k）也是测量物体在一定力42下的变形和构象能力的重要参数，其与材料的杨氏模量（E）和物体在弯曲方向上的厚度（t）有关它们之间的关系可以表述如下：第1113章（2）我们的聚酰亚胺具有低杨氏弯曲刚度相当低，具有高舒适性，这意味着邻近探针的脑组织将承受较小的应力43。此外，记录部位将更紧密地结合到被测组织44，从而改善记录的神经信号的质量和稳定性通常，具有低弯曲刚度的探针难以植入，因为其不能提供在可接受的变形下穿透脑膜所需的力。本文选择PEG作为机械增强材料来解决这一问题，它可以通过聚集所有通道来减少接触面积，并提高植入过程中的瞬时硬度值得注意的是，涂覆的PEG将在生理环境中快速溶解，使得探针可以恢复期望的柔性34、35。用PEG涂覆的雄穗探针作为实验对象进行屈曲测试（图S2a）。力-距离曲线（图S2 c）表明，探针传递的压力迅速增加，平均水平为3.8 mN，变形为1 mm。为了在啮齿动物脑中成功植入，需要至少1 mN的应力45，这可以通过我们的探针容易地实现。电特性对于用于记录神经信号的探针，单个电极记录部位的大小应等于或小于一个神经元，以确保高选择性。然而，在这种情况下，电极阻抗将很大，这将降低记录信号的信噪比（SNR），并在随后的分析中引起困难，因此已经开发了各种方法来降低电极阻抗46、47。在这里，我们采用了简单的Au电镀工艺，通过增加接触面积来降低电极阻抗，电镀电极的SEM图像如图S3所示。图2a示出了电镀工艺的概述，并且用相同的系统进行阻抗测试。结果表明，所有32个电极的平均阻抗呈现出一致的下降与频率的增加。然而，Au电镀后的电极的阻抗总是比电镀前小一个数量级以上（图2b），表明Au电镀的有效性。在最接近大脑中记录信号的1kHz频率下，电镀前后的平均阻抗值为分别为3.67 M▲和0.27 M▲平均相位角与频率曲线见图S4。考虑到我们的探针的单个电极面积仅为8 8 µm2，这样的阻抗水平相对较小，这有利于在随后的体内实验中获得具有高SNR的神经信号48。自由活动小鼠中的神经信号记录探针被验证用于体内神经活动记录。将麻醉的成年C57 BL/6 J小鼠进行开颅术，将其头部固定在立体定位装置中。的以1 mm s-1的速度将设置探针植入mPFC中。将远端不锈钢骨螺钉插入颅骨，手术期间的外部接地（图）。S5）。术后6 h，小鼠恢复迅速，活动自如，提示该探针系统相对较轻（0.89 g），不会对小鼠造成太大负担在三天恢复后，在自由活动小鼠中进行慢性神经信号记录（图3a，图S6）。来自连续记录的4s段的代表性示例和相应的神经元研究文章DOI：芯片|Vol 1 |2022年秋季是的ZP. 等人芯片1，1000244月8−×图3|从mPFC记录的神经活动。a、植入后小鼠可自由活动。b，从三个代表性通道记录的原始数据（比例尺：垂直100µV，水平500 msc，顶部：从mPFC记录的高通滤波迹线（250 Hz），底部：时间窗口期间的尖峰光栅（比例尺：垂直为100µV，水平为500 msd，通道01自发尖峰的平均波形（比例尺：垂直20µV，水平100 µs滤波后的信号显示出mPFC活性的自发上升和下降状态，这意味着神经元网络的活性和非活性状态（图2）。 3 b、c）。自发尖峰表现出类似的波形，对应于单个单位神经放电（图1）。 3 d）。在记录信号的质量方面，我们的探头已经达到了入门级商业探头的标准，但与成熟的基于CMOS的神经探头仍有一定的差距（例如，我们的探头记录的噪声我们将在未来的工作中进一步改进制备方法和整合信号预处理单元，以提高信号质量。结论在本工作中，我们成功地制作了一个32通道的多层柔性神经探针。与之前报道的神经流苏设计34、35相比，我们的探头增加了记录通道的数量，而没有扩大植入物的尺寸。主要的制造过程是使用无掩模激光直写光刻完成的，这使我们能够在必要时自由地改变探针的设计并降低成本（图S7 - 8）。简单的释放/组装方法进一步确保了我们探针的高可靠性和可重复性。形态学表征显示了结构的完整性，而机械和电学表征证实了探针在植入中的可行性体内实验表明，该探针可用于神经记录。综上所述，本研究通过可调整的制造方法和通用的组装工艺，制备了一种流苏式未来，我们将用这些流苏式的探头，形成一个无线的封闭-回路神经刺激/记录系统（图S9）进行更深入的生物学研究。方法探针制造我们的探针是通过低成本、高分辨率、多层光刻工艺制造的，如图4所示。最终的器件显示了一个层压结构，其中两个金层夹在三个聚酰亚胺层之间。电信号通过两层金传导，聚酰亚胺用于绝缘和支撑。探针制造的关键步骤如下：（a）通过磁控溅射（PRO LinePVD 75，Kurt J.Lesker Company，PA，USA）在表面上具有SiO2层的1.5cm 1.5cm Si衬底的一半上沉积100nm的铝牺牲层(b)旋涂聚酰亚胺酸溶液（U-Varnish S，UBE Corporation，Tokyo，Japan）以在基底上形成均匀的膜，并将样品立即置于80 °C的热板上进行烘烤以除 去 残 留 的 然 后 将 样 品 转 移 到 真 空 退 火 炉 （ RSS-110-S ，UniTemp，Munich，Germany）中，并在150 °C、200 °C、250 °C下烘烤0.5小时，然后在300 °C下烘烤3小时，以形成1.5 μ π ι绝缘聚酰亚胺膜。(c)将LOR 5A剥离抗蚀剂（MicroChem，TX，USA）旋涂在基板上并在190 °C下烘烤2分钟，随后旋涂S1805抗蚀剂（Rohmand Haas Electronic LLC，MA，USA）并在115 ° C下烘烤。然后使用无掩模激光直写光刻系统（Microwriter ML3，DurhamMagneto Optics Ltd.，Cambridge，UK）。在AZ 300 MIF Developer中开发后研究文章DOI：芯片|Vol 1 |2022年秋季是的ZP. 等人芯片1，1000245月8图 4|多层柔性神经探针的制造过程（未按比例绘制）。a-b，牺牲层和聚酰亚胺衬底的形成。 g–j, k–m, n，聚酰亚胺的蚀刻。o，释放探针。（AZ电子材料有限公司，Hayes，UK），第一层电极通道被揭示。（d）通过溅射依次沉积10 nm的钛粘合层和（e）将样品浸入去除剂PG（MicroChem，TX，USA）中，所有光致抗蚀剂溶解，留下金属膜（微电极、连接线和焊盘）。(f)在顶部形成第二个1.5 μm绝缘聚酰亚胺膜，工艺流程与步骤（b）相同（g）将双层光致抗蚀剂第二次旋涂，然后烘烤。之后，再次使用直写光刻来揭示第二层电极通道。(h)通过溅射依次沉积10 nm钛粘合剂层和（i）100 nm金层，然后进行剥离工艺.(j)使用与步骤（b）中相同的制备方法在结构的顶部上形成第三1.5 μm绝缘聚酰亚胺膜。(k) 第三次旋涂双层光致抗蚀剂，然后烘烤。硬掩模层通过直写光刻法图案化(l) 通过溅射沉积100 nm铝层（m）然后实施剥离工艺以形成硬掩模，该硬掩模用于在蚀刻期间保护探针的主要区域。(n)通过反应离子 蚀 刻 （ RIE ） （ 20 sccm O2 ， 200 W ， 150 mTorr ， 30 min ）（Plasmatherm，Advanced Vacuum，Lomma，Sweden）蚀刻所制备的聚酰亚胺层，以形成探针的流苏形状以及暴露记录电极位置和接合焊盘。(o)将探针浸入0.3 molL-1 FeCl3溶液，以去除底部的牺牲层，顶部的硬掩模层。之后，用去离子水冲洗探针的流苏结构，并且我们标记出流苏区域和互连线之间的分界线（这也是牺牲层的边界），然后使用金刚石切割器沿着该分界线在背面的Si衬底上最后，获得了具有自由附着雄穗的探针所制造的基于聚酰亚胺的多层神经探针（修整前）如图5a所示。由于探针仍然位于刚性基底上，因此整个结构保持在同一平面上，所有信息都可以很好地呈现。焊盘区域的宽度为11.5mm，可植入的雄穗的长度为6mm。为了获得可调节高度的系统并便于实验的实施，定制印刷电路板（PCB）和柔性印刷电路（FPC）（JLC Electronics Co.，有限公司、中国深圳）。将PCB的一端焊接到标准32通道Omnetics连接器（A79022-001，Omnetics Connector Corporation，MN，USA），而另一端通过FPC连接器（AFA 01-S16 FCA-00，JUSHUO electronicsCo.，有限公司、深圳，中国）。然后将探针侧的所有接触焊盘引线键合到FPC上，以构建完整的记录系统（图5d）。使用微控制楔形接合机（7476 E-79，West Bond，Inc.，CA，USA）用于引线键合工艺。研究文章DOI：芯片|Vol 1 |2022年秋季是的ZP. 等人芯片1，1000246月8++图 5|神经探针的组装。a，基底修整之前的聚酰亚胺基柔性神经探针的照片。b，基底修整和PEG涂覆后探针的照片c，PEG涂层后探针尖端的SEM图像（比例尺：200 µm）;d，组装记录系统的示意图。该系统由四个部分组成：制造的神经探针，柔性印刷电路（FPC），带有FPC连接器的定制印刷电路板（PCB）和标准Omnetics连接器。中间的插图显示了神经探针和FPC之间的引线键合连接（比例尺：3mm）。采用铝硅键合线作为连接介质。有关装配策略的更多信息，请参见补充材料S9和S10。机械增强PEG由于其优异的生物相容性和生物降解性，经常被用作可植入生物实验中的机械增强材料49，50。本工作中，由于探针的可植入部分具有松散的流苏结构，在后续的体内信号记录实验中无法直接穿透脑膜进入脑组织具体步骤如下：将PEG-4000粉末在90 °C水浴中加热至熔融状态，然后将其自立，将探针的雄穗部分浸入其中;之后，我们以1.5 mm s-1的匀速将探针从PEG中取出（图S13）;最后，我们将探针置于室温下，直到PEG固化。在用PEG涂覆之前，将形成雄穗结构的电极丝分居了在此过程中，雄穗在表面张力和毛细管力的作用下收缩成簇PEG固化后，雄穗的网状部分形成圆柱体，为顶端结构提供支撑;同时，雄穗的末端变成具有非常小的横截面的尖锐针状物（图5b）。图5c显示了用PEG涂覆后雄穗的SEM图像;所有32根细丝被拉在一起，雄穗的总直径小于50 μm，这表明植入物尺寸非常小。PEG包被的探针的其他图片如图所示。S14。探针表征使用光学显微镜（Axiolab 5，Zeiss，Munich，德国）和SEM（Gemini 300，Zeiss，Munich，德国）来表征所制造的神经探针的形态和结构使用电子张力测试仪（CMT-4304-QY，Shanghai Ch GarmentCo.，有限公司、中国上海在拉伸测试中，将两个探针边缘附接到夹具，并且拉伸速率设定为5 mm min-1。记录张力和应变数据，直到发生断裂。在屈曲测试中，雄穗区域被压缩在刚性基底中，同时探针的顶部被固定在夹具上该com-加压速率设定为1 mm min-1。记录压力和弯曲距离，直至总弯曲达到4 mm，超过穿刺针可植入的最大深度。在NanoZ 1.3型测试系统（White Matter LLC.，USA）。我们的探头通过FPC和PCB连接到测试系统，并且有一根地线从PCB中引出并延伸到生理盐水中，形成一个完整的电路回路。在100 - 5000Hz的频率下测量所有32个电极的平均阻抗。体内电生理记录使用来自上海计划生育研究所（Shanghai，China）实验动物业务部的雄性成年C57 BL/6小鼠（8周龄，体重在“20-30”g之间动物以12小时光照/黑暗周期饲养，光照时间为06：00至18：00。所有实验均按照复旦大学动物管理和使用委员会（实验动物科学系）批准的国家动物管理和使用指南进行。使用异氟烷（3- 3.5%，300-500 mL min-1）麻醉小鼠，然后通过以下电极分离实验，使用异氟烷（0.75-两个不锈钢螺丝（一个作为外部接地，另一个作为锚）通过钻孔插入颅骨而不刺穿硬脑膜。在内侧前额叶皮质（mPFC）上进行2 mm2的方形开颅术，并小心地去除硬脑膜将设计用于慢性神经记录的探针（图S11a）植入mPFC（根据前囟的位置：前后，1.60 mm;中间-外侧，0.50 mm;背腹侧，将整个组件密封并使用牙科丙烯酸树脂固定到头骨研究文章DOI：芯片|Vol 1 |2022年秋季是的ZP. 等人芯片1，1000247月8将探针连接到32通道Apollo放大器（Jiangsu Yige Inc.，中国江苏）。以30 kHz的采样率进行电生理记录。250-Hz高通滤波器用于单个单元记录。使用Offline Sorter（Plexon Inc.，TX，USA）通过将波形投影到主成分空间中并识别孤立的簇。在我们的体内实验中，在探针植入后三天安排正式的信号记录，此时小鼠从麻醉中恢复并且可以自由移动和觅食。此外，此时包裹探针的PEG完全溶解，确保了神经信号的有效记录。引用1. 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