医学信息学解锁22（2021）100504计算和网络药理学分析，Bioburacin可能是COVID-19中的天然抗病毒化合物Rajesh Patila，1，Rupesh Chikhaleb， 1，Pukar Khanalc， 1，Nilambari Gurav d，Muniappan Ayyanar e，Saurabh Sinhaf，Satyendra Prasad g，Yadu Nandan Dey h，Manish Wanjarii，**，谢伦德拉·S Guravj，*aSinhgad技术教育协会，Smt. Kashibai Navale药学院，印度马哈拉施特拉邦浦那b英国诺里奇，诺里奇研究园，东英吉利大学药学院c药理学和毒理学系，KLE Belagavi药学院，KLE高等教育和研究学院（KAHER），Belagavi，590010，印度dPESe植物学系，A. Veeriya Vandayar Memorial Sri Pushpam College（Autonomous），Affiliated to Bharathidasan University，Poondi，Thanjavur，613 503，Indiaf印度拉贾斯坦邦乌代布尔Mohanlal Shukhadia大学药学系，邮编313 001gR.T.M.药物科学系。印度马哈拉施特拉邦那格浦尔大学hAdamas大学制药技术学院，加尔各答，700126，西孟加拉邦，印度i印度中央邦瓜廖尔地区阿育吠陀药物开发研究所，邮编：474009j果阿大学果阿药学院生药学和植物化学系，403 001，印度A R T I C L EI N FO关键词：穗花杉双黄酮新型冠状病毒2型桑葚苷A B S T R A C T双酚A是最大的一类植物衍生的多酚化合物，具有不同的生物学潜力，也被证明在治疗严重急性呼吸系统综合征（SARS）和中东呼吸系统综合征（MERS）方面有效。本研究验证了来自植物的15种生物活性生物素的分子对接、模拟和MM-PBSA研究，作为治疗COVID-19的合理的潜在抗病毒药物。 15种黄酮类化合物与SARS冠状病毒2型三种蛋白的分子对接研究结 构 蛋 白 -15 核 糖 核 酸 内 切 酶 （ NSP 15 ） 、 刺 突 蛋 白 受 体 结 合 结 构 域 （ S 蛋 白 的 RBD ） 和 主 要 蛋 白 酶（Mpro/3CLpro）进行了分子动力学模拟，并对选定的蛋白-配体复合物进行了分子动力学模拟。用MM-PBSA方法计算了分子动力学轨道的自由能。通过对靶蛋白的网络药理学分析，网络药理学分析表明，选择的生物素参与多种信号传导途径的调节，如p53、FOXO、MAPK、Wnt、Rap1、TNF、脂肪细胞因子和白细胞跨内皮迁移，其在免疫调节中起重要作用，使氧化应激和炎症最小化。分子对接和分子动力学模拟研究表明，黄芪酸、穗花杉双黄酮和桑苷具有抑制SARS-CoV-2关键蛋白的潜力，这些结果可进一步用于天然配体的设计。缩略语：2019-nCoV，2019新型冠状病毒; CoV，冠状病毒; ESTA，Angstrom; COVID-19，2019冠状病毒病; MD，分子动力学; MM-PBSA，分子力学泊松-玻尔兹曼表面积; NSP，非结构蛋白; ORF，开放阅读框; OPLS，液体模拟优化势能; RBD，受体结合结构域; RMSD，均方根偏差; SARS，严重急性呼吸综合征; SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒-2; SDF，结构数据文件; WHO，世界卫生组织。* 通讯作者。果阿大学果阿药学院生药学和植物化学系，403 001，印度。** 通讯作者。电子邮件地址：shailendra. nic.in，shailendra. nic.in（S.S.Gurav）。1、具有同等贡献的作者，被视为第一作者。https://doi.org/10.1016/j.imu.2020.100504接收日期：2020年9月22日;接收日期：2020年12月15日;接受日期：2020年12月15日2020年12月23日在线提供2352-9148/© 2020作者。出版社：Elsevier Ltd这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：http://www.elsevier.com/locate/imuR. Patil等人医学信息学解锁22（2021）10050421. 介绍在2019年12月期间，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）成为源自中国武汉市的全球大流行病，由于高风险，死亡率和发病率。冠状病毒含有高度包被的单链RNA，其基因组大小为26 -32个内切酶，并且其生命周期需要初始RNA合成、复制和转录[ 1-3 ]。所有冠状病毒基因组的三分之二编码pp1ab，pp1ab是一种复制酶多聚蛋白，由两个重叠的开放阅读框（ORF1a和ORF1b），被病毒蛋白酶切割成16种不同的非结构蛋白（NSP）[4]。在这些NSP中，NSP-15被认为具有涉及RNA的尿苷酸特异性切割的巢状病毒尿苷酸特异性内切核糖核酸酶（NendoU）活性。NSP-15/NendoU活性在先天免疫应答和病毒生命周期中很重要[5]。病毒表面突出的结构蛋白称为刺突（S）糖蛋白，以亚稳态融合前同源三聚体形式存在，使2019-nCoV能够通过结构重排进入宿主细胞S1的绑定阻止病毒生命各个阶段的蛋白质和结构蛋白进入、复制和增殖等周期可能表现出广泛的活性[6天然化合物，特别是来自植物资源，由于其丰富性、安全性和随后的活动范围广，因此在铅识别程序中的选择。类黄酮、生物类黄酮或多酚化合物是水果和蔬菜中存在的一组次级代谢物，并且众所周知其健康益处。黄烷酸是一组含有黄烷核或具有通过吡喃环连接的两个苯环的15-碳骨架的化合物，是研究充分的天然化合物，包含超过6000种结构良好表征的分子[10]。据报道，它们在感染性、致癌性、炎症性和免疫性方面具有健康益处慢性病[11值得注意的是，类黄酮具有针对过多的病毒进行了广泛的研究，以克服现有疗法的局限性[15最近的计算机模拟研究证明了天然化合物在COVID-19中的抗病毒潜力[1黄酮类化合物已被证明具有多方面的治疗作用血管紧张素转换酶2的刺突S糖蛋白亚基效果等作为抗炎，抗病毒，抗氧化剂，汽车-宿主细胞上的ACE 2亚基导致S2亚基转变为高度稳定的融合后构象，这加速了病毒进入过程。因此，靶向病毒蛋白酶的药物，具有放射保护作用，并且还显示出它们在治疗呼吸相关问题中的重要作用，这是药物有效对抗COVID-19的关键要求[1本Fig. 1. 结合位点残基（A）SARS-CoV-2 NSP 15蛋白（PDB ID：6 W 01）;（B）SARS-CoV-2刺突RBD（PDB ID：6 M0 J）（刺突RBD和ACE-2表面分别显示为绿色和玫瑰红色）;（C）SARS-CoV-2主要蛋白酶（Mpro）（PDB ID：6 WNP）（口袋残基的配色方案：S1红棒，S1′蓝棒，S2，绿棒和S4口袋青色棒）。（有关此图例中颜色的解释，请读者参考本文的Web版本R. Patil等人医学信息学解锁22（2021）1005043在调查中，尝试评估一些众所周知的具有多种治疗特性的抗COVID-19的生物素的效力，这可以有助于科学界探索和确定COVID-19的治疗方法。在本研究中，对15种植物黄酮类化合物与SARS-CoV-2的3种蛋白进行了分子对接，非结构蛋白15内切酶（NSP15）， 的刺突蛋白的受体结合结构域（S蛋白的RBD）和主要蛋白酶（Mpro，也称为3CLpro）作为靶蛋白。此外，对每种蛋白质上排名最高的化合物进行分子染色，动力学模拟和分子力学泊松玻尔兹曼表面积连续溶剂化（MM-PBSA）计算，以获得结合亲和力和可能的抑制模式2. 材料和方法2.1. 分子对接15个生物素的分子对接分析（补充文件） 是 进行 的 晶体结构的 NSP-15（PDB ID：6W01 ） 、 刺 突 蛋 白 的 RBD （ PDB ID ： 6M0J ） 和 Mpro （ PDB ID ：6WNP），的决议1.9,2.45和1.44A.分别使用2018年-1月1日分子对接方案的细节在补充文件中给出2.2. 分子动力学（MD）模拟和分子力学-泊松玻尔兹曼表面积连续溶剂化（MM-PBSA）计算用Gromacs 4.5.6软件包[29]进行MD模拟，并用ATB服务器上的Gromos 54 a7力场[30，31][32溶剂化在生物信息资源和应用设施（BRAF），C-DAC，Pune的远程服务器上对平衡的蛋白质-配体复合物进行25 ns的生产阶段MD模拟。此外，对25ns轨迹进行MM-PBSA计算[35，36]。MD和MM-PBSA计算的详细信息见补充文件。2.3. 苦参素的网络药理学对于网络药理学的评估，进行了三个主要步骤：（a）生物活性靶标的预测，（b）调节靶标的富集分析，以及（c）生物活性物质，靶标和途径之间的网络构建及其分析。简而言之，生物活性物质的靶标表1分子对接得分和蛋白质-配体结合自由能通过MM-PBSA分析计算的复合物，所有能量以kJ·mol-1计，括号中为标准偏差。化合物Dock评分MM-PBSA（ΔG结合）SARS-CoV-2 NSP-15核糖核酸内切酶（PDB ID：6 W 01）甘草酸-8.168-97.599（±32.621）黄芩苷-7.564-47.332（±17.273）R值-5.575-52.561（±18.521）瑞德西韦-5.636-62.637（±20.132）SARS-CoV-2加标RBD（PDB ID：6 M0 J）桑皮苷-7.121-59.846（±21.624）（R）-苦杏仁苷-6.978-14.521（±19.927）瑞德西韦-4.652-65.198（±19.800）SARS-CoV-2主要蛋白酶（M pro）（PDB ID：6WNP）电话：+86-10 - 88888888传真：+86-10 - 88888888穗花杉双黄酮-7.589-134.358（±19.769）瑞德西韦-7.766-111.488（±14.177）ΔGbind=结合自由能（kJ.mol-1），Dock Score= Glide Score。使用DIGEP-Pred [37]在0.5的药理活性（Pa）下预测，并且使用STRING富集调节的蛋白质[38] 版 本 11.0 ， 用 于 其 细 胞 组 分 、 生 物 过 程 、 分 子 功 能 和 KEGG（ https://www.genome.jp/kegg/ ） 途 径 数 据 库 。 类 似 地 ， 使 用Cytoscape [39]版本3.5.1构建生物活性物质、其靶标和调节途径之间的网络;删除任何重复项，并基于颜色图和节点大小的边缘计数2.4. 预测可能的抗病毒活性用PASS软件对所有黄酮类化合物的生物学谱进行了查询[40]在药理学活性（Pa）>药理学无活性（Pi）下，构建了完整的数据集。然后查询关键词“病毒“的完整数据集， 以 确 定 针 对 多 种 病毒 的可 能抗 病 毒活 性。3. 结果和讨论3.1. 分子对接研究SARS-CoV-2基因组5 '端的开放阅读框1ab（ORF 1ab）[41]. NSP15蛋白是一种NendoU，是由三聚体的二聚体产生的组装成六聚体的单体[42]。NSP15（PDB ID：6W01）的晶体结构已解决了1.90纳米的分辨率，并发现适合对接研究。每个单体具有348个氨基酸单位，并 构 成 催 化 C- 末 端 巢 状 病 毒 RNA 尿 苷 酸 特 异 性 核 糖 核 酸 内 切 酶（NendoU）结构域、中间结构域和N-末端结构域。然而，每个单体链的晶体结构中缺少23个残基，这些残基通过Prime模块建模。NendoU结构域具有内切核糖核酸酶活性，其负责切割双链（ds）RNA底物。 C-末端催化结构域由两个反平行的β-折叠组成，含有6个关键氨基酸His 235、His 250、Lys 290、Thr 341、Tyr 343和Ser 294（图1）。残基His235、His250、Lys290形成催化三联体，其中His235用作酸性残基，而His250和Lys290用作碱性残基。残基Ser294和Tyr343控制尿苷酸特异性核糖核酸内切酶特异性。柠檬酸根离子在该位点结合，并且在对接研究中利用该结合位点在这项计算研究中探索的另一个靶蛋白是SARS-CoV-2刺突RBD。SARS-CoV-2使用这种融合刺突糖蛋白通过ACE-2受体进入宿主细胞[43，44]。刺突糖蛋白具有两个亚基S1和S2，分别介导附着和膜融合。S1亚基与ACE-2受体的结合导致S2亚基转变为高度稳定的融合后构象[45，46]。RBD S1亚基具有5个相互反平行的扭曲β片层，称为β1、β2、β3、β4和β7片层。β4和β7链之间的区域具有短β5和β6链、α 4和α 5螺旋以及一些环的延伸插入。这种延伸的插入被称为受体结合基序（RBM），它具有与ACE-2结合的大部分残基[43]。我们最近的报道[4]证实了残基Lys417，Gly446，Tyr449，Tyr453，Leu455，Phe456，Ala475，Phe486，Asn487， Tyr489， Gln493， Gly496，Gln498，Thr 500、Asn 501、Gly 502、Tyr 505是与ACE-2的N端肽酶结构域结合的关键然而，在这些残基的簇中，Gln493、Asn501、Tyr449、Tyr489和Tyr505可以形成氢键相互作用，而Lys417形成盐桥相互作用。由ORF 1ab编码的两个重叠的多蛋白（pp 1a，pp 1ab）被主要蛋白酶（Mpro）和木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLpro）切割成NSP 1 -16 [47在这两种蛋白酶中，Mpro由于其在病毒复制中的关键功能而在药物开发中获得了很多关注[47]。SARS-CoV-2 Mpro的多种晶体结构其中，发现具有1.44 nm分辨率的晶体结构（PDB ID：6WNP）最合适。这个水晶R. Patil等人医学信息学解锁22（2021）1005044----图二. 五个排名靠前的化合物与Remdesivir在SARS-CoV-2 NSP 15内切核糖核酸酶结合位点的结合位姿和2D相互作用图。(A)甘草酸，（B）黄芩苷，（C）大黄素，（D）毛冬青苷元A，（E）橙皮苷，和（F）Remdesivir。结 构 还 具 有 在 其 结 合 位 点 共 价 结 合 到 Cys145 残 基 肽 抑 制 剂Boceprevir。主要蛋白酶形成两个原聚体的二聚体，并且每个原聚体具有三个结构域，结构域I，II，和III，其分别包含残基8-很好结合位点位于结构域I和II之间的裂缝处。残基Cys145和His41形成催化二联体。结合位点有四个口袋S1、S1′、S2和S4。S1口袋具有残基Phe140、Asn142、Glu166、His163、Leu141和His172，相邻的S1S2口袋被残基包围His41 、 Met49 、 Tyr54 、 Met165 和 Asp187 ， 而 S4 口 袋 被 残 基Leu167、Phe185和Gln192包围。五个排名靠前的黄酮类化合物的对接结果的基础上最低的对接得分为每种蛋白质的情况下进行了讨论。SARS-CoV-2 NSP 15核糖核酸内切酶的对接结果见表1和补充文件-表S1。SARS-CoV-2的NSP 15核糖核酸内切酶的对接结果表明，化合物甘草酸、黄芩苷、芦丁、毛冬青素A、橙皮苷在SARS-CoV-2的NSP 15核糖核酸内切酶上的对接得分较低，8.168至5.29;而标准药物Remdesivir的对接评分为5.636。NSP-25结合位点的关键残基属于C-末端催化结构域催化三联体His 235、His 250、Lys 290和Thr 341、Tyr 343和Ser 294。这将是值得研究的化合物如何与催化三联体残基和其他残基的相互作用。甘草酸被发现是最活跃的最低对接得分，8.168和糖部分上的羧酸根阴离子与质子化的His250残基形成氢键相互作用，并与碱性Lys290残基形成盐桥相互作用（图2）。另一个羧酸根阴离子与Gln245残基形成氢键，而糖苷配基部分上的羧酸根阴离子与Asn278形成氢键。甘草酸的疏水性五环糖苷配基部分结合在由疏水残基Leu346、Tyr343、Val292和Trp333以及一些带电残基如Lys345、Hip235和极性残基Thr341包围的疏水口袋处。Thr341和Gly248也形成氢键相互作用。黄芩苷的对接得分为-7.564，它与苯环之间形成π-阳离子相互作用，在色酮环上取代的环和带正电荷的Lys345残基。糖基上的阴离子羧酸根与质子化的His235残基之间形成盐桥相互作用 其它残基如极性Thr341、带正电荷的Lys 290和疏水Val 292也与羟基形成氢键。芦丁的色酮环与质子化的His 235形成π-π堆积以及π-阳离子相互作用。苯环上的羟基色酮环5位的羟基糖部分的羟基与Gly248残基形成氢键。冬青皂苷元A是一种含有疏水性五环类三萜核心环的化合物，具有两个羧酸基团，如Epik模块所预测的，这两个基团在pH 7.4下都被去质子化。其中一个羧酸根离子与质子化的His250残基形成离子盐桥相互作用，与极性的Thr341和质子化的His241残基形成氢键相互作用。橙皮苷色酮环5位上的羰基氧和羟基分别与Lys 290和质子化的His 250残基形成氢键;而糖部分上的羟基则与Lys 290和质子化的His 250残基形成氢键。与Glu340和Asp240残基形成氢键。有趣的是，发现参比药物Remdesivir与疏水Trp 333残基形成π-π堆积相互作用核糖上的羟基部分与带负电荷的Asp240残基形成氢键。磷酸氧原子与Gln245和质子化的His235形成氢键，而酯羰基与Pro344残基形成氢键。这些对接结果表明，与形成催化三联体His235，His250，Lys290的残基的氢键相互作用对于结合亲和力是重要的在SARS-CoV-2尖峰RBD的情况下，五个顶级的对接得分从低到高的化合物排序为多-小檗苷（R）-苦杏仁苷、橙皮苷、黄芩苷、Orientin。<<<<这表明SARS-CoV-2加标RBD对化合物桑苷的结合亲和力最有利（补充文件-表S2）。桑苷中糖部分上的羟基形成氢与带负电荷的Glu484和Glu406残基结合，R. Patil等人医学信息学解锁22（2021）1005045图三. 五种排名靠前的化合物和Remdesivir在SARS-CoV-2 Spike RBD结合位点的结合姿势。(A)桑苷、（B）（R）-苦杏仁苷、（C）橙皮苷、（D）黄芩苷、（E）Orientin和（F）Remdesivir。见图4。五种排名靠前的化合物与Remdesivir在SARS-CoV-2主要蛋白酶（Mpro）结合位点的结合姿势。(A)大黄素，（B）穗花杉双黄酮，（C）杨梅素，（D）黄芩素，（E）橙皮苷，（F）Remdesivir。带正电的Arg403残基（图3）。中心苯基查耳酮核心容纳在由残基Pro491、Leu492、Gln493、Tyr495、Tyr453和Leu455包围的疏水口袋中。 的情况下（R）-苦杏仁苷，苯环与正离子形成π-阳离子带电荷的Arg403残基Arg403还与氧原子的糖苷键糖部分上的羟基橙皮苷中苯环上的羟基与Gly 496形成氢键;而糖部分上的羟基与带负电荷的Glu 406，Asp 420，R. Patil等人医学信息学解锁22（2021）1005046图五. 均方根偏差。（A）NSP-15核糖核酸内切酶;（B）刺突RBD;和（C）主要蛋白酶（Mpro）的蛋白质骨架原子中的RMSD。配体原子中的RMSD-（D）NSP-15核糖核酸内切酶;（E）刺突RBD;和（F）主要蛋白酶（Mpro）（MAL：桑苷，AMY：（R）-苦杏仁苷，REM：Remdesivir，RUT：Raspine，AMA：穗花杉双黄酮）。和带正电的赖氨酸417。黄芩苷的色酮环上取代的苯环与Tyr 505形成π-π堆积作用，而糖部分上的羟基形成氢与Gln409和带负电荷的Glu406残基键合。去质子化的阴离子羧酸盐与带正电荷的Arg403残基形成盐桥。在Orientin的情况下，仅糖部分上的羟基与Asn501、Gly496、Ser494、Gln493残基形成氢键相互作用。瑞德西韦中的苯环也形成π-π堆积相互作用与Ser494残基，而核糖上的羟基形成氢与带负电荷的Glu406残基结合。来自氰基的氮与带正电荷的Arg403残基形成氢键，而来自磷胺酮基团的氮原子与Gln493残基形成氢键。如前所述，这些相互作用中的大多数是与来自加标RBD和ACE-2的界面的残基簇。发现许多有利的相互作用与一些重要的残基，如Gln493，Asn501，Tyr449，Tyr489，Tyr505和Lys417。与SARS-CoV-2主要蛋白酶（Mpro）的对接结果表明，芦丁的对接得分最高（-8.859R. Patil等人医学信息学解锁22（2021）1005047---（补充文件-表S3）。其它类黄酮，即穗花杉黄酮、杨梅素、黄芩素、橙皮苷的对接得分在7.589 - 7.137之间.参比药物Remdesivir的对接得分为7.766，这表明芦丁的结合亲和力比参比药物更强。 最佳对接芦丁的绑定姿势发现构象异构体在S1口袋处与两个残基去质子化的Glu166和极性Asn142形成氢键，而在S1 ′口袋处与 T h r 2 6 形成氢键相互作用（图1）。 4）. 3，4二羟基-苯基取代基上的羟基与Asn 142和Thr 26残基在S1和S1′口袋处形成氢键。α-L-吡喃鼠李糖上的羟基与S2口袋的极性Ser 46残基和S4口袋的极性Gln 189残基因此，芦丁在SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）的所有口袋中占据结合位点并形成重要的氢键相互作用。另一方面，Remdesivir也占据了所有的口袋，但它形成与S1口袋残基Glu166和S1′口袋残基Thr26的氢键相互作用。 取代在磷酰胺与S2口袋质子化残基His 41形成π-π堆积相互作用。穗花杉黄酮与S1口袋残基Glu166、S1′口袋残基Thr25、S2口袋残基His41和Ser46形成氢键相互作用。它还与质子化的His 41残基形成π-π堆积相互作用 杨梅素与Glu 166和Leu 141S1口袋的Arg188残基和S2口袋的Arg188残基。Baicalein，与核心色酮环上的羟基橙皮苷是芦丁的类似物，与S1形成氢键口袋残基Asn142、Leu141和Glu166。这些结果表明，类黄酮芦丁由于与抗氧化剂的相互作用而具有更好的结合亲和力。SARS-CoV-2主要蛋白酶（Mpro）结合位点所有口袋的关键残基。3.2. 分子动力学研究和MM-PBSA计算分子动力学模拟（MDS）比分子对接更能准确地提供配体的结合模式。足够长时间的MDS提供了配体以及蛋白质主链和侧链原子的构象采样。另一方面，它也提供了溶剂化体系的各种非键相互作用和随之而来的能量方面的基本信息。此外，它还捕获了蛋白质折叠事件、环柔性的影响和结合位点适应。这消除了对接研究的局限性，并提供了结合自由能和结合亲和力的准确估计。在本研究中，进行了25 ns MDS研究，以评估具有最佳对接分数的化合物的构象稳定性、结合自由能和结合亲和力，并将结果与参考药物Remdesivir进行比较。在SARS-CoV-2 NSP-15内切核糖核酸酶的情况下，选择排在第一位的黄维甲酸、黄芩苷、芦丁用于MDS;而在SARS-CoV-2刺突物RBD的情况下，选择黄酮类化合物桑皮苷和（R）-苦杏仁苷。在SARS-CoV-2主要蛋白酶的情况下，选择黄酮类化合物芦丁和穗花杉双黄酮。还进行了参比药物remdesivir的MDS。在MDS期间，通过使系统经受由最陡下降准则的能量最小化的初始步骤来缓解硬脂碰撞。在NPT和NVT条件下对最小化系统进行平衡步骤。的使平衡的系统经受25 ns生产阶段MDS，后MDS分析，包括各种非键相互作用的分析，如H-键，π堆积和疏水相互作用。 为了了解MDS期间系统的稳定性，在时间尺度上，测量配体和蛋白质的参数，如均方根偏差（RMSD）和均方根波动（RMSF）。在分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）计算中使用后MDS轨迹来估计结合自由能。RMSD是蛋白质和配体的构象稳定性的良好量度，并且其是蛋白质和配体的位置偏离程度的量度。见图6。蛋白质残基中的RMSF。(A)与SARS-CoV-2 NSP-15核糖核酸内切酶的复合物;（B）与SARS-CoV-2刺突RBD的复合物（MAL：桑苷，AMY：（R）-苦杏仁苷，REM：Remdesivir）;和（C）与SARS-CoV-2主要蛋白酶（Mpro）的复合物（RUT：Raspine，AMA：穗花杉黄酮）。原子从起始位置。偏差越低，构象稳定性越好[50]。蛋白质原子的RMSD分析显示，SARS-CoV-2 NSP-15核糖核酸内切酶与瑞德西韦的复合物具有最低的RMSD，平均为0.24 nm（图5）。直到15 ns，与瑞地昔韦的复合物具有与瑞地昔韦几乎相等的RMSD，但此后它增加，平均RMSD为0.29 nm.黄芩苷的复合物稳定迅速，平均RMSD为0.299 nm。芦丁的络合物具有最大的偏差，平均RMSD为0.39 nm。研究发现，尽管瑞德西韦R. Patil等人医学信息学解锁22（2021）1005048图7.第一次会议。 分子与结合位点残基之间形成的氢键数。SARS-CoV-2 NSP-15核糖核酸内切酶（A）甘草酸，(B) 黄芩苷，（C）Raspine，（D）Remdesivir; SARS-CoV-2 Spike RBD（E）Mulberroside，（F）（R）-Amygdalin，（G）Remdesivir; SARS-CoV-2主要蛋白酶（Mpro）。（H）Rb2，(I) Amentoflavone，（J）Remdesivir.对接得分较高，与其它复合物相比，其复合物快速稳定在SARS-CoV-2刺突RBD的情况下，桑苷和（R）-苦杏仁苷具有最好的对接分数。这两种化合物和参比药物Remdesivir的蛋白质原子的RMSD显示，桑苷和Remdesivir在蛋白质原子中具有几乎相似的偏差，平均值分别为0.26和0.23，表明在两种情况下具有更好的稳定性[51]。而（R）-苦杏仁苷复合物的RMSD具有略高的平均值0.33，表明与其它两种复合物相比稳定性较低在SARS-CoV-2主要蛋白酶的情况下，化合物即芦丁和穗花杉双黄酮显示出更好的对接得分，并且瑞德西韦具有非常接近的RMSD值，分别为0.25、0.26和0.22。此外，这些结果支持对接分数。配体原子中RMSD的测量在判断蛋白质-配体复合物的整体稳定性的情况下R. Patil等人医学信息学解锁22（2021）1005049-在SARS-CoV-2 NSP-15核糖核酸内切酶与配体的复合物中，黄芩苷原子的偏差最小，平均RMSD值为0.14 30 nm，而remdesivir原子具有较高的偏差，平均RMSD为0.30 nm（图5D）。黄酮类化合物中黄酮酸和芦丁的平均RMSD分别为0.24和0.22 nm。 发现RMSD与分子中可旋转键的数目成正比。例如，具有4个可旋转键的黄芩苷具有最低的RMSD值，而具有14个可旋转键的瑞德西韦具有最高的RMSD值。对于分别具有7个和6个可旋转键的甘草酸和芦丁，RMSD值成比例地变化。 在SARS-CoV-2 spike RBD与配体的复合物中，所有配体均采用稳定构象，RMSD约为0.25在25 ns MDS结束时，有趣的是，在桑椹苷的情况下，直到约17.5ns，RMSD几乎是稳定的，具有约0.15 nm的较低RMSD值，但此后它迅速上升到约0.25nm，并保持稳定，直到模拟结束。在SARS-CoV-2主要蛋白酶（Mpro）的复合物的情况下，可以看出类黄酮 穗花杉双 具有 最小偏差 从起始平均RMSD为0.13 nm的结构，表明 其与主要蛋白酶的复合物。而参比药物Remde-sivir具有更高但恒定的偏差，RMSD约为0.25 nm，直到20ns，但此后在模拟结束时上升至约0.35 nm。这表明Remdesivir的起始结构存在较大偏差。有趣的是，芦丁也有一个较高的初始RMSD约0.25 nm，但RMSD下降到一个稳定的构象与RMSD约0.2 nm后不久，20ns的模拟。蛋白质-配体复合物的稳定性可以用以下术语来评估： 蛋白质残留物原子中的均方根波动（RMSF）[52]。它是蛋白质残基弹性的一个很好的度量，并指出了结合位点的适应和其他现象。在SARS-CoV-2 NSP-15内切核糖核酸酶的情况下，芦丁和黄芩苷的一组残基的波动是明显的;而这些在烟酸和瑞德西韦中是最小的（图11）。 6）。最大的波动出现在集群中 n端在1 - 50的范围内的残基，并且在225-346的范围内的结合位点残基中观察到一定程度的微小波动。在SARS-CoV-2刺突RBD-配体复合物中，从N-末端区域的350至375的残基和从375至500的结合位点残基的簇具有较高的波动。N末端残基的波动是 最小 作为 观察到 remdesivir 和 最大值（R）-苦杏仁苷的结合位点残基的变化规律与所有化合物相似。在SARS-CoV-2主要蛋白酶（Mpro）复合物的情况下，结合位点在所有三种化合物中观察到残基25-配体的结合亲和力取决于非键合相互作用，如氢键相互作用、疏水和离子相互作用[53]。形成的氢键的数量和它们的寿命指示复合物的强度和结合亲和力。对所有蛋白质-配体复合物的氢键形成进行了严格评价。在SARS-CoV-2 NSP-15核糖核酸内切酶的情况下，与胡芦巴酸形成最多10个氢键，而与芦丁形成7个氢键（图7）。在黄芩苷和瑞德西韦的情况下，形成5个氢键。在整个模拟期间形成的氢键的平均数量的估计在判断哪个分子不断形成更多数量的氢键时可能是至关重要的[54]。甘草酸、芦丁、黄芩苷和瑞德西韦分别形成平均4.45、2.41、1.57和1.85个氢键。因此，琥珀酸在整个MDS中不断地形成近似的氢键，而其它化合物恒定地形成近似的1此外，参与氢键形成的残基和氢键的寿命进行了研究。在这种情况下，使用程序PyContact [55]，一种用于分析非共价相互作用的基于GUI的工具。氢键的形成用一种截断半径为0.35 nm，截断角度为120nm标准[56]。在对于黄芩酸，残基Val 292和Tyr 343形成具有最长寿命的氢键，而对于黄芩苷，残基Lys 290形成具有最长寿命的氢键（补充文件S4-图S2）。类黄酮芦丁与具有最长寿命的残基Gln245、Lys290和Tyr343形成氢键。参比药物Remdesivir与残基Gly248、His235、Lys290、Gln245、Tyr243、His250和Gly247形成氢键，具有最长的寿命。这些结果表明，瑞德西韦可以与结合位点的许多关键残基产生氢键。还观察到残基Lys290、Tyr343和Gln245在氢键形成中是重要的。在SARS-CoV-2加标RBD的情况下，与Remdesivir形成最多8个氢键;而桑苷和（R）-苦杏仁苷各形成7个氢键。然而，与瑞德西韦、桑苷和（R）-苦杏仁苷形成的氢键的平均数分别为3.52、3.81和3.70，这表明与桑苷形成氢键的事件更频繁地发生。残基氢键寿命分析表明，Tyr120、Leu 122、Tyr 156、Tyr 162和Arg 70残基形成的氢键与更长的寿命一致（补充文件-图S3）。（R）-苦杏仁苷残基Arg 70和Glu 73形成具有较长寿命的氢键。有趣的是，Remdesivir与残基Glu160、Tyr120、Tyr162、Ser161、Arg70和Gly163形成几个这样的氢键。这些结果表明Tyr120、Tyr162和Arg70残基在这些化合物中的重要性。根据形成的氢键的一致性，瑞德西韦可能具有比桑苷更强的结合亲和力。在SARS-CoV-2主要蛋白酶（Mpro）的复合物的情况下，芦丁、穗花杉双黄酮和瑞德西韦分别形成12、7和9个最大数目的氢键。芦丁、穗花杉双黄酮和瑞德西韦在模拟期间形成的平均氢键数分别为5.95、2.05和4.75。因此，很明显，与穗花杉双黄酮和瑞德西韦相比，芦丁始终形成更多数量的氢键。由于这种氢键的形成，与其他两种化合物相比，R13可能具有更有利的结合亲和力结合位点的氢键形成模式以氢键寿命的形式进行了研究，表明芦丁可以与SARS-CoV-2主要蛋白酶结合位点的残基数量形成氢键（Mpro）（补充文件-图S4）。 有趣的是，发现所有四个口袋都参与这种关键氢的形成。特别是，发现S1口袋残基Glu 166、Gly 143和Cys 145，S1氢键是一致的在穗花杉双黄酮的情况下，这些残基和S1口袋残基His163被发现参与氢键的形成。Remdesivir与大多数这些残基以及Thr190、His164和Pro168残基形成氢键。这些结果表明，残基Glu166，His41，Gln189在形成关键氢键相互作用中是重要的。进行MD轨迹的MM-PBSA计算可以提供结合自由能方面的结合亲和力的更准确的估计。 g_mmpbsa程序[35，36]可用于计算非键相互作用能，如范德华能、静电能、极性溶剂化能、溶剂可溶解表面积（SASA）能，这些能量值用于计算结合自由能（ΔG结合）（补充文件-表S4）。非键相互作用能如范德华能和静电能分别以库仑和Lennard-Jones（LJ）势函数表示，具有主要影响结合自由能（ΔG结合）估计。在在SARS-CoV-2 NSP-15内切核糖核酸酶蛋白-配体复合物的MDS病例中，MM-PBSA结果显示，黄曲霉酸具有最低的范德华能，97.599 kJ/mol。与参比药物Remdesivir相比，阿糖胞苷酸的结合自由能低得多这可以是R. Patil等人医学信息学解锁22（2021）10050410表2生物活性物质及其对调节目标的计数生物活性靶蛋白计数生物活性靶蛋白计数（R）-苦杏仁甙8石蒜碱1穗花杉双24桑苷15黄芩素22杨梅素28黄芩苷4荭草苷13甘草5葛根素8酸橙皮素19橙皮苷9黄芩素28毛冬青皂苷元A2总计（靶蛋白计数）：199部分是由于形成的氢键数目较多，因此在结合位点处的相互作用最有利。这证明了在所有的黄酮类化合物中，甘草酸最有利于-在SARS-CoV-2 NSP-15内切核糖核酸酶的结合位点上有效地相互作用。黄芩苷和芦丁具有更低的ΔG结合，可能比参比药物具有更不利的相互作用。当比较由阿糖胞苷酸和瑞德西韦形成的相互作用时残基Asn 278、Ser 294、Cys 293、Glu 340、Leu 246、Leu 346、Lys346、Lys 345、His 243和Trp 333;而观察到参比药物Remdesivir未与这些残基形成相互作用（补充文件-图S5）。在SARS-CoV-2刺突蛋白-配体复合物的MDS的情况下，MM-PBSA计算的结果表明，与其他两种黄酮类化合物相比，瑞德西韦具有最低的结合自由能。然而，发现桑苷具有比Remdesivir更好的范德华相互作用。但是，在决定黄酮类化合物与该靶蛋白的更好结合亲和力在SARS-CoV-2主要蛋白酶（Mpro）蛋白的MDS的情况配体复合物中，发现穗花杉双黄酮具有比remdesivir更好的更低的结合自由能。但只有极性溶剂化能的贡献有很大的不同，在最终的结合自由能。3.3. 网络药理学3.3.1. 生物活性物质的靶点总共199种蛋白质被15种黄酮类化合物调节，其中杨梅素和黄芩素是主要的蛋白质调节剂，即28种（表2）。类似地，PLAU和TIMP1蛋白是受最大数量的生物活性物质调节最多的蛋白，即，11（表3）。3.3.2. GO富集和网络分析基因本
