工程20（2023）36研究葡萄糖和脂质代谢-文章硫化氢促进脂肪细胞分化、增生和肥大Richa Vermaa，Ming Fua，b，Guangdong Yanga，Lingyun Wua，b，Zhang，Rui Wangb，Zhanga心血管和代谢研究中心，劳伦特大学，萨德伯里，ON P3E 2C6，加拿大b加拿大多伦多约克大学生物系，安大略省M3J 1P3阿提奇莱因福奥文章历史记录：2021年12月12日收到2022年8月19日修订2022年9月25日接受2022年10月28日网上发售关键词：脂肪发生脂肪细胞气体递质葡萄糖h2s的胰岛素脂质肥胖A B S T R A C T硫化氢（H2S）是脂肪细胞和脂肪组织中内源性产生的，刺激脂肪生成.然而，H2S对肥胖发展的综合致病作用在这里，我们发现降低内源性H2S水平降低了小鼠脂肪细胞中的脂质积累.外源性H2S处理显著增加了原代小鼠前脂肪细胞在成脂诱导6天后的成脂作用。在脂肪形成的早期阶段，H2S促进细胞增殖，并为细胞经历增生做好准备。H2S处理10天后虽然H2S能促进脂肪堆积和脂肪形成，但对脂肪分解没有影响.随着营养超载和高糖/胰岛素孵育，H2S进一步刺激葡萄糖消耗和恶化脂肪细胞肥大。H2S可上调细胞增殖相关基因（CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPb）、细胞分裂周期25（Cdc 25）、微小染色体维持3（Mcm 3）和细胞分裂周期45（Cdc 45））和调节细胞增殖的细胞周期蛋白依赖性激酶2蛋白（Cdk 2）。H2S还上调胰岛素受体b（Irb）激活的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和蛋白激酶B（Akt）途径，导致脂肪形成。总之，H2S增加脂肪细胞分化、肥大和增生，这意味着它在肥胖症中起致病作用©2022 The Bottoms.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）中找到。1. 介绍硫化氢（H2S）是一种气体递质，在多种细胞信号传导途径中起关键作用[1H2 S的生理功能包括舒张血管、降低血压[4，5]、抑制胃上皮细胞凋亡[6]、减轻炎症[7]和氧化应激[8]。另一方面，胰腺和外周组织中内源性H2S水平的增加有助于糖尿病的发病机制和并发症[9]。据世界卫生组织（WHO）统计，2016年，39%的18岁及以上成年人超重，13%肥胖[10]。脂肪组织和脂肪细胞是肥胖症的中心，因为它们在体内储存和代谢脂质[11，12]。前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化称为脂肪形成，一直是肥胖相关细胞研究的焦点。H2S作为脂肪形成诱导剂的作用已在*通讯作者。电子邮件地址：lwu2@laurentian.ca（L. Wu），ruiwang@yorku.ca（R.Wang）。3T3L1细胞[13，14]。Yang等人[15]观察到H2S通过其S-硫水合作用刺激过氧化物酶体增殖物激活受体c（PPARc）的他们的研究还表明，脂肪形成促进剂（胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）和地塞米松（DEX））增加了胱硫醚裂解酶（CSE）的表达，在分化的前脂肪细胞中产生更多的H2S。脂肪细胞增生所起的作用（即，增加的细胞数量）在肥胖发展中的作用一直存在争议[16有人提出，具有较小脂肪细胞大小的增生可能具有保护作用[19]。脂肪组织具有有限的储存能力，并且更多脂肪细胞的存在可以允许以脂质形式储存过量能量以降低脂毒性。其他研究表明脂肪细胞增生可能晚于脂肪细胞肥大（即，增加的细胞大小），并可能与肥胖相关的代谢后果的更大严重性和更少的可逆性相关[20在正能量平衡的慢性状态下，肥大脂肪细胞在达到临界细胞大小后变得代谢不活跃，其特征在于脂质过载和胰岛素抵抗。在这一点上，https://doi.org/10.1016/j.eng.2022.09.0102095-8099/©2022 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engR. 维尔马，M。Fu，G.Yang等人工程20（2023）3637······×···········补充额外的脂肪前体细胞以修复Meta改变[23]。在持续营养过剩的情况下，脂肪细胞的增生导致脂肪组织扩张，并且在过量能量下新募集的脂肪细胞变得肥大。在这种恶性循环中，脂肪细胞的增生和肥大都是增加脂肪组织质量和引发肥胖和肥胖相关Meta并发症的原因[24]。到目前为止，H2S在肥胖发展中的作用主要是用3T3L1细胞研究的。然而，这种永生化的白色前脂肪细胞系不能复制体内前脂肪细胞的生理特征。此外，这种细胞模型不能完全解决脂肪组织水平和全身水平肥胖发展的复杂性[24]。此外，目前对H2S在脂肪细胞肥大和增生中的作用还缺乏了解.因此，我们研究了外源性和内源性H2S对小鼠前脂肪细胞和脂肪组织中脂肪细胞分化、肥大和增生的影响，以及潜在的机制。2. 材料和方法2.1. 从脂肪组织中提取脂质并测定H2S产生率野生型（WT）小鼠是保持对a C57 BL/6 J× 129SvEv背景。在至少10代杂合CSE-KO小鼠与具有相同遗传背景的WT小鼠回交后，产生了内部饲养的纯合CSE-KO小鼠[4]。本研究中使用的所有WT和CSE-KO小鼠均通过基因分型进行验证每组WT和匹配的CSE-KO小鼠（8周龄，雄性）来自相同的世代。去除表皮和皮下脂肪组织脂肪垫;然后使用Bligh和Dyer提取方法[25所有动物实验均符合美国国立卫生研究院出版的实验室动物护理和使用指南（NIH出版号85-23，1996年修订），并得到加拿大劳伦特大学动物护理委员会的批准如前所述测量WT和CSE-KO脂肪组织的H2S产生速率[15，28，29]。简单地说，分离小鼠脂肪组织，并使用50 mmol L-1冰冷的磷酸钾缓冲液（pH 6.8）匀浆然后将组织同源物与10 mmol L-1L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，Canada）在37 ℃下孵育。90分钟后，加入三氯乙酸（Sigma-Aldrich）以终止反应。用FLUOstar OPTIMA微孔板分光光度计（BMG LABTECH，德国）在670 nm的吸收波长下检测H2S与N，N-二甲基-对苯二胺硫酸盐（Sigma-Aldrich）相互作用产生的亚甲蓝水平。2.2. 细胞培养从小鼠附睾脂肪垫中分离前脂肪细胞[30]。清除附着的血管后，收集组织，用无菌4.8 mmol·L-1氯化钾，1.3mmol·L-1CaCl2，1.2mmol·L-1KH2PO4 ， 1.2mmol·L-1MgSO4 ， 24.8mmol·L-1NaHCO3百分之三牛血清白蛋白、5 mmol L-1葡萄糖、100U mL-1青霉素和0.1 mg mL-1链霉素。使用剪刀切碎组织并消化与II型胶原酶（3 mg·mL-1）在37 ℃下孵育45 min。将细胞悬浮液通过250μm过滤器过滤。丢弃剩余的未消化组织碎片的将过滤的细胞悬浮液在室温下以450g（g= 9.8m s-2）离心10分钟。丢弃含有成熟脂肪细胞的下层，并加入红细胞裂解缓冲液（随后，将细胞通过40μm筛网过滤并离心（450 g，室温下10 min）。得到的基质-维管细胞沉淀（即，前脂肪细胞）重悬于含有10%胎牛血清（FBS）和抗生素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。在用0.4%台盼蓝（细胞活力> 95%）进行细胞计数后，将细胞接种在多孔板中，并在37 °C下在具有5%CO2的95%空气的潮湿气氛中培养24小时。使细胞生长，胰蛋白酶消化，并以8 × 104个细胞/板接种在12 孔 板 中 。 细 胞 汇 合 后 ， 用 含 IBMX （ 0.5mmol L-1 ） 、 DEX（ 0.251mol L-1 ） 和 胰 岛 素 （ 101gmL-1 ） 的 适 应 性 培 养 基（ADP）替换。诱导细胞脂肪生成6天。将细胞用ADP进一步培养两天 。然 后 ，吸 出 培养 基并 转 换为 仅 含胰 岛素 （ 10μgmL-1 ） 的DMEM，持续接下来的4天。为了研究营养素超载的影响，我们使用棕榈酸（PA，350lmol L-1）作为营养素处理原代培养的前脂肪细胞20天。为了研究能量失衡模型，我们用高糖（HG，25 mmol L-1）和高胰岛素（HI，50 1g mL-1）刺激前脂肪细胞20天，ADP与或不与硫氢化钠（NaHS; 60l mol L-1）。在不同的实验中，ADP分化的前脂肪细胞用5l mol L-1的蛋白激酶B（Akt）抑制剂capivasertib[31，32]处理所有6天，或用5lmol L-1的细胞周期蛋白依赖性激酶2（Cdk 2）抑制剂3-[1-（3H-咪唑-4-基）-甲-（Z）-亚基]-5-甲氧基-1，3-二氢-吲哚-2-酮（SU 9516）[33，34]处理脂肪形成诱导的前3天。2.3. 油红O染色和甘油三酯定量油红O染料可与甘油三酯结合通过用4 mL蒸馏水稀释6 mL油红O溶液（O 1391，Sigma-Aldrich），通过0.22 μ m过滤器过滤来制备油红O工作溶液。实验分为4组，每组分别接受0、10、30、60和100lmol L-1 NaHS处理。第1组作为对照，在DMEM中具有WT前脂肪细胞第2组由ADP中的WT前脂肪细胞组成。组3由ADP + DL-炔丙基甘氨酸（PPG）中的WT前脂肪细胞组成，DL表示外消旋混合物。第4组包括ADP中的CSE-KO前脂肪细胞。脂肪形成诱导6天后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞3次，并用4%福尔马林溶液固定1小时。除去福尔马林后，用PBS洗涤细胞三次。接下来，将500μL的60%异丙醇加入板中，然后迅速拆除。 板完全干燥后，将500μL油红O工作溶液加入细胞中。在添加油红O后20分钟，在显微镜下观察处理的细胞。如果染色剂没有被细胞吸收（如在显微镜下观察到的），我们将细胞在油红O溶液中再保持10分钟。然后用蒸馏水洗涤细胞以去除所有染色残留物，并再 次进行 显微 镜观察 。使 用IX 71 倒置 显微镜 （ Olympus ，Canada）拍摄图像。使用DP 2-BSW版本2.1q处理所有图像。为了定量染色细胞中的甘油三酯，使用1 mL 100%异丙醇从细胞中提取油红O染色剂通过上下移液充分混合异丙醇使用FLUOstarOPTIMA微孔板分光光度计（BMG LABTECH）在510 nm处测量所得油红O浸提液在异丙醇中的吸光度根据Ramirez-Zacarias等人的工作，预先绘制了标准三油酸甘油酯校准曲线[35]。三油酸甘油酯，代表脂质积累水平，R. 维尔马，M。Fu，G.Yang等人工程20（2023）3638·····以各种浓度溶解于氯仿中;通过氮气（N2）吹扫蒸发溶剂，并在通风橱中放置过夜三油酸甘油酯在Eppendorf管中固化，并用油红O工作液染色。20分钟后，将油红O残余物用双蒸水洗涤3然后用异丙醇提取被三油酸甘油酯吸收的油红O，并在510 nm处检测其吸光度用固定量的甘油三酯制备标准曲线，用于测定前脂肪细胞中未知的甘油三酯含量（mg）。2.4. 脂解测定使用Elabscience（中国）的NEFA比色测定试剂盒测定WT和CSE-KO 小 鼠 的 脂 肪 组 织 或 前 脂 肪 细 胞 的 非 酯 化 游 离 脂 肪 酸（FFA）含量[36，37]。用组织或细胞匀浆测定总FFA含量。总脂质蓄积量与脂质含量与FFA浓度的比值一致，其可描述为：FFA释放量（mmol L-1）/mg蛋白质除以脂质含量（mg）/mg蛋白质。2.5. 脂肪细胞直径和细胞表面积的显微镜评价测量油红O染色细胞的直径和表面积，并使用ImageJ 1.52a软件（NIH，USA）进行数字分析2.6. 小鼠脂肪细胞在脂肪形成诱导20天后，用PBS洗涤细胞，并使用含有低葡萄糖水平（5.5mmol L-1）的无FBS DMEM血清饥饿24小时。用PBS再洗涤后，将细胞与含有10%FBS、25 mmol L-1葡萄糖和50 1g mL-1胰岛素的DMEM孵育12 h。收集培养物培养基并使用来自Abcam（USA）的葡萄糖比色测定试剂盒（ab282922）测试葡萄糖浓度。葡萄糖消耗量计算为初始葡萄糖浓度（25 mmol L-1）与在培养基中孵育12 h后的浓度之差。2.7. 试剂和抗体胰岛素和DEX购自Sigma-Aldrich，IBMX购自ACROS，USA，NaHS购自Calbiochem（USA）。抗磷酸促分裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）的抗体（1：1000，SC-81503），MEK（1：1000，sc-81504），对微生物敏感脂肪酶（HSL）（1：1000，4107）和p-HSL（1：1000，45804）购自Santa Cruz Biotechnology，Inc。（美国）。磷酸化Akt抗体（1：1000，9271），Akt抗体（1：1000，9272），磷酸-胰岛素受体b（IrbY1146）（1：500，3023），Irb（1：500，3025），联素（1：1000，2789），过氧化物酶体增殖物受体c（1：1000，95128），CCAAT/增强子结合蛋白b（C/EBPb）（1：1000，3082）和甘油醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶 （ GAPDH ） （ 1 ： 2000 ， 5174 ） 购 自 CellSignaling Technology （ UK ） 。 Capivasertib 购 自 MedChemexpress，SU9516购自Selleck Chemicals LLC（USA）。2.8. Western blotting首先在冰上用补充有蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich）的放射免疫 沉 淀 测 定 缓 冲 液 （ RIPA ） 裂 解 细 胞 。 将 等 量 的 蛋 白 质（60μg/20μL/孔）变性并用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE ） 解 析 ， 然 后 转 移 到 硝 酸 纤 维 素 膜 （ PallCorporation，USA）上。在那里-之后，用5%牛奶封闭膜，然后在4 °C下在振荡器上与一抗（1：1000）孵育过夜。使用过氧化物酶缀合的二抗（1：2000），并且用增强的化学发光（GE Healthcare，UK）显现特异性蛋白质条带。2.9. RNA分离和逆转录聚合酶链反应为了进行RNA分离和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），使用TriReagent （ Invitrogen ， USA ） 从 细 胞 中 分 离 总 RNA 。 根 据NewEnglandBiolabs（Canada）的方案，通过使用逆转录酶和随机寡聚引物的逆转录方法制备第一链互补脱氧核糖核酸（cDNA）。用于C/EBPb的引物为50-ACAGCGACGAGTACAA-GATCC-30（上游）和50-GACAGTTGCTCCACCTTCTTCT-30细胞分裂周期45（Cdc 45）的细胞分裂周期为50-AAGGGGAATCTGCGAGAAAT-30（上游）和50-GGCCAGGAATT结果表明，Gins 1的细胞分裂周期为：TATGCTTGA-30（下游），Mcm3的细胞分裂周期为：50-TGAGCAAGACTGTGGACCTG-30（上游）和50-CTTCCTCCTTTTCCGCTTCT-30（下游），Gins1的细胞分裂周期 为 ：50-CTGGACGAGGGGATCTGATA-30 （ 上 游 ） 和50-CCCATATTCCCACCTGAGTG-30（下游），Cdc 25的细胞分裂周期为：50-CCATTCAGATGGAG-GAGGAA-30（ 下 游（ 上 游 ）和50-TTTAAGGCTC CCAGGATGTG-30（下 游） 。使 用SYBR green （BioRad ，USA）聚 合酶 链式 反应（PCR）主混合物（Bio-Rad，Canada）进行信使RNA（mRNA）表达水平的定量。该反应在与iCycler光学系统软件（3.1版）相关联的iCycler iQ 5装置（Bio-Rad）上进行。通过使用“2-DD CT“[38]计算相对mRNA定量给定的靶cDNA和内源性β-肌动蛋白基因参照。DDCT是靶样品和对照样品之间的DCT的差异，其中后者是没有ADP处理的细胞2.10. 统计分析所有数据均表示为平均值±标准误差。通过单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett多重比较事后检验进行统计分析认为p值0.05具有统计学显著性。3. 结果3.1. 脂质含量和H2S产生速率与WT脂肪组织相比，CSE-KO脂肪组织（皮下和内脏脂肪库）的脂质含量和H2S产生率均显著降低（图1（a））。WT和CSE-KO脂肪组织之间FFA浓度的差异不显著（图1B）。 1（b））。 NaHS处理不改变从WT和CSE-KO小鼠分离的脂肪细胞中的FFA浓度（图1B）。 1（c））。已知HSL是脂肪组织中甘油三酯催化转化为FFA的主要酶[39]。HSL的磷酸化活化在WT和CSE-KO脂肪组织中处于相同水平（图1A和1B）。1（d）和（e））。类似地，WT和CSE-KO原代脂肪细胞的磷酸化HSL水平之间没有显著差异，其根本不受NaHS的影响（图1A和1B）。1（d）和（f））。成脂标志物过氧化物酶体增殖物激活受体c和过氧化物酶体增殖物激活受体c的表达水平WT中的C/EBP b高于CSE-KO脂肪组织和原代脂肪细胞（图1A和1B）。 1（d）、（g）和（h））。NaHS处理增加了WT和CSE-KO小鼠的原代脂肪细胞中两种标志物的表达（图2）1（d）和（h））。R. 维尔马，M。Fu，G.Yang等人工程20（2023）3639·····图1.一、CSE-KO（KO）和WT小鼠脂肪组织中的脂质蓄积和脂解（a）皮下和内脏脂肪组织中的脂质含量（CSE-KO和WT脂肪组织之间*p0.05，n = 6）。(b)皮下和内脏脂肪组织（Imol）/毫克组织/毫克脂质的FFA水平（每组n(c)从WT和CSE-KO小鼠分离的原代脂肪细胞中的FFA水平（1mol）/106个细胞/毫克脂质（n= 6）。（d）内脏脂肪组织和小鼠原代内脏脂肪细胞中不同蛋白质的表达水平（e，f）（e）内脏脂肪组织和（f）小鼠原代内脏脂肪细胞中的p-HSL/HSL表达水平（n= 6）。（g）内脏脂肪组织和（h）小鼠原代内脏脂肪细胞中的PPARc和C/EBPb的表达水平（每组n= 6KO-ADP和WT-ADP：分别来自CSE-KO和WT小鼠的 ADP诱导的脂肪细胞#与KO-ADP相比p 0.05，@与KO-ADP + NaHS相比p 0.05， * 与WT-ADP相比p 0.053.2. 小鼠前脂肪细胞NaHS（10-在不存在分化培养基的情况下（对照组），用10- WT前脂肪细胞与CSE抑制剂PPG的孵育显著降低脂肪形成（图1A和1B）。2（a）和（b））。分化的CSE-KO前脂肪细胞（KO + ADP）的油红O染色显著低于WT前脂肪细胞。如果没有NaHS治疗后，无显著差异之间CSE-KO + ADP、WT + ADP + PPG和非分化对照组然而，60和100lmol L-1的NaHS处理导致PPG处理的前脂肪细胞和CSE KO前脂肪细胞的前脂肪细胞分化。3.3. NaHS诱导的时间依赖性脂肪形成图3（a）描述了WT小鼠前脂肪细胞的脂肪形成诱导6天的实验设计。将分化细胞暴露于60lmol L-1 NaHS中不同时间（图3（b））。NaHS暴露的前两天未引起分化细胞油红O染色的显著变化。延长NaHS暴露4天和6天显著增加了分化细胞中油红O染色和脂质积累的程度（图1A和1B）。3（c）和（d））。R. 维尔马，M。Fu，G.Yang等人工程20（2023）3640·图二、从WT和CSE-KO小鼠分离的前脂肪细胞的脂肪生成（a）将细胞在不同条件下培养6天;通过油红O染色指示它们的分化对照：未进行任何处理的WT细胞组;比例尺代表200μm。（b）不同组小鼠脂肪细胞中甘油三酯的蓄积（*p0.05;每组n3.4. NaHS诱导的前脂肪细胞将WT小鼠前脂肪细胞培养20天以诱导脂肪形成。单独用NaHS处理的前脂肪细胞不能存活，并且在孵育10天后死亡。PA或HG/HI诱导20天后，脂肪细胞和脂滴明显大于仅接受ADP处理的细胞。棕榈酸PA和高葡萄糖HG/高胰岛素HI的这些作用通过NaHS处理进一步增强（图4（a））。此外，所有NaHS处理组中的葡萄糖消耗显著高于其相应的非NaHS处理组（图4（b））。使用ImageJ软件V1.53t（NIH，USA）计算脂滴直径和细胞大小（图1A和1B）。4（c）和（d））。3.5. NaHS诱导的小鼠前脂肪细胞体外NaHS处理分化的前脂肪细胞（ADP + NaHS）24 h导致有丝分裂克隆扩增（MCE）基因（C/EBPb、Cdc 45、Mcm3和Cdc 25）的上调，对于Gins1（图） 5（a））。溴脱氧尿苷（BrdU）测定证实，10-100 lmol L-1的NaHS处理增加ADP处理的一种3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2-甲基-4-（三氟甲基）苯并[d]咪唑，- 基）-2，5-二苯基溴化四氮唑（MTT）测定显示，分化细胞的NaHS处理增加了活细胞的数量（图1B）。 5（c））。接下来，我们研究了NaHS对负责细胞周期从G0到G1进展的调节剂的影响。 如图5（d）所示，与非分化对照细胞相比，用ADP的脂肪形成分化显著降低了p27（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂）的蛋白表达水平，但不降低Cdk2的蛋白表达水平。NaHS处理与成脂分化（ADP +NaHS）进一步降低了p27的表达，但增加了Cdk 2的表达。虽然它们并不显著，但在以下情况下，Cdk2和p27表达分别观察到增加和减少的趋势：我们处理的非微分细胞与NAHS(Ctrl+NaHS）。R. 维尔马，M。Fu，G.Yang等人工程20（2023）3641图三. NaHS诱导的脂肪形成的时间过程。(a)脂肪生成诱导方案。(b)不同实验组（组I、II、III和IV）的NaHS处理方案。箭头表示H2S + ADP处理的持续时间，虚线仅表示ADP处理的持续时间.(c)来自WT小鼠脂肪组织的前脂肪细胞的分化;将来自所有组（I-IV）的细胞 (d)分化小鼠前脂肪细胞组中的甘油三酯蓄积; 6天后使用三油酸甘油酯标准曲线定量甘油三酯（*p0.05 vs组I;所有组n3.6. NaHS对丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3（PI 3）/Akt通路的非分化细胞的NaHS处理不会磷酸化Irb（图6（a））。然而，NaHS处理的成骨细胞（ADP + NaHS）早在6小时后就增加了Ir b和MEK磷酸化（图1A和1B）。6（a）和（b））。ADP单独增加Irb磷酸化的时间依赖性的方式。MEK磷酸化在所有时间点都增加（即，第6、12和24小时）。 6（b））。NaHS治疗的区分与单独用ADP或NaHS处理相比，前脂肪细胞（NaHS + ADP）处理6天显著增加Akt磷酸化和脂联素表达（图1A和1B）。6（c）-（e））。已知脂联素可促进脂肪生成并增加成熟前脂肪细胞中的脂质含量[16]。3.7. Cdk2和Akt抑制对小鼠脂肪细胞SU9516在NaHS处理前3天内抑制Cdk 2的分化。SU9516处理显著抑制NaHS处理组和未处理组中 的 细 胞 增 殖 （图1B）。（ 见 第 7（a）段）。NAHS在存在或不存在SU9516的情况下，处理对分化中的前脂肪细胞的活力没有显著影响（图7（a））。Capivasertib在分化的前脂肪细胞中抑制Akt所有6天后，NaHS对分化的脂肪细胞中脂质蓄积的刺激作用消失（图7（b））。MTT测定证实了SU9516对前脂肪细胞活力的抑制作用图7（c）。油红O和脂质定量分析证实了capivasertib对脂肪生成和脂质蓄积的抑制作用图7（d）。4. 讨论脂肪细胞是专门的细胞，在能量过剩期间积累大量甘油三酯，然后在能量不足期间消耗储存的甘油三酯[40，41]。脂肪细胞的发育始于间充质干细胞，这些间充质干细胞被定向为脂肪细胞谱系，即前脂肪细胞[40脂肪生成通过前脂肪细胞形状、大小和其他形态学和生理学特征的变化而发生。大鼠主动脉周围、肾脏周围和棕色脂肪组织中内源性H2S的产生已有报道[42，43]. 除了CSE之外，胱硫醚β-合酶（CBS）是另一种R. 维尔马，M。Fu，G.Yang等人工程20（2023）3642#图四、NaHS诱导的来自WT小鼠脂肪组织的分化脂肪细胞的肥大将小鼠原代前脂肪细胞成脂诱导20天。（a）在培养的第10天（灰度）和第20天（油红O染色）拍摄细胞图像 比例尺在两个NaHS处理组的左图中为200 μm，在中图和右图中为50 μ m。（b）用含25mmol·L-1葡萄糖的新鲜DMEM培养脂肪细胞12 h后，每毫克蛋白的葡萄糖消耗量（mg·dL-1）（n= 6）。使用ImageJ软件测量（c）脂滴直径和（d）脂肪细胞直径（n = 10;* p <0.05 vs ADP + PA; p<0.05 vs ADP + HG/HI;Xp<0.05vsADP;@p<0.05）。HG：25mmol·L-1;HI：501g·mL-1。H2S生成酶尽管在大鼠脂肪组织中检测到CSE蛋白和CBS转录物 使用RT-PCR和蛋白质印迹，我们先前表明CBS和CSE在3 T3 L1前脂肪细胞、小鼠白色脂肪组织（附睾、肾周和肠系膜）和棕色脂肪组织中表达，CBS mRNA和蛋白质水平低于CSE [15]。另一种产生H2S的途径是由3-巯基丙酮酸硫转移酶（MST）催化的用胰岛素、地塞米松和IBMX的混合物刺激脂肪形成与CBS、CSE和MST的上调相关，并增加了培养的3T3L1细胞中的H2S浓度[13，15，44]。由于CSE在内脏和皮下脂肪组织中的表达比CBS和MST更丰富[15]，因此CSE对脂肪组织中的H2S产生贡献最大如果生长超过70%汇合并随后传代，3T3L1细胞在激素刺激下失去完全分化的能力[45，46]。原代培养的前脂肪细胞表现出与其来源的特定组织相似的特征，为研究脂肪组织的复杂性提供了生理学相关的模型。脂肪基质细胞来源的前脂肪细胞可长期冻存，增殖和分化能力的损失较小。此外，原代培养的前脂肪细胞可以来自具有不同遗传背景的WT或遗传修饰动物，这对于同质细胞系如3T3L1是不可能的[47]。我们使用的脂肪组织来自五周龄的小鼠。在这个年龄，小鼠产生的未分化前脂肪细胞多于成熟脂肪细胞[30]。在原代前脂肪细胞培养中有两种类型的细胞污染：红细胞和内皮细胞R. 维尔马，M。Fu，G.Yang等人工程20（2023）3643·图五、培养24小时后，NaHS诱导的前脂肪细胞增生（a）检测60lmol·L-1NaHS（每组5只）对融合后前体脂肪细胞增生基因mRNA表达的影响。（b）不同条件下细胞增殖的BrdU测定（每组n=5）。（c）不同条件下细胞活力的MTT测定（每组n = 4）。(d)Western blotting检测不同条件下前体脂肪细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1B（p27）和Cdk 2的蛋白水平（每组n=6）。 GAPDH用作上样对照（<与对照组相比，* p 0.05;<与0lmol·L-1NaHS相比，# p 0.05）。BrdU：溴脱氧尿苷;MTT：溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑。细胞我们首先在消化前从脂肪组织中去除所有可见的血管;然后，我们使用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞（RBC）。离心后，将来自血管的内皮细胞聚集在一起，并使用40μm孔径的过滤器过滤。如果在培养过程中观察到任何异常的细胞形状（相对于前脂肪细胞的梭形），则标记该区域并使用细胞刮刀刮除。我们的原代前脂肪细胞培养显示没有内皮细胞污染，这将形成特征性的鹅卵石单层。成熟的脂肪细胞，也就是脂肪负载的细胞，存在于漂浮层中，每次我们离心消化的组织样本时，漂浮层都会被丢弃。为了确认脂肪细胞谱系，我们在分化过程结束时观察了脂肪细胞特异性生物标志物PPARc和脂肪酸结合蛋白4（FABP4）的蛋白表达[48]。仅将具有PPARc和FABP4表达的前脂肪细胞培养批次冷冻保存并用于进一步研究。CSE-KO小鼠提供了一种独特的工具来评估CSE催化的内源性H2S产生在脂肪形成过程中的作用[4]。在这项研究中，我们发现CSE-KO小鼠脂肪组织中的脂质积累显著降低，其内源性H2S水平显著低于WT小鼠脂肪组织。这一结果是第一个直接证据表明，内源性H2S有助于增加脂肪组织中的脂质积累。PPG抑制CSE降低了脂肪形成的程度，这进一步说明了CSE在脂肪形成过程中的作用（图1）。2）的情况。在成脂刺激下，外源性H2S（NaHS，10-在存在CSE抑制剂PPG或CSE-KO前脂肪细胞的情况下，WT前脂肪细胞在分化后表现出减少的脂质积累，证明了CSE产生的内源性H2S在脂肪形成中的作用。NaHS形式的外源H2S也R. 维尔马，M。Fu，G.Yang等人工程20（2023）3644图六、NaHS激活的MEK/细胞外信号调节激酶（ERK）和Akt通路。 用60lmol·L-1NaHS处理WT小鼠前脂肪细胞，并在ADP刺激下培养。(a)Irb（p-Irb）蛋白的磷酸化。(b)MEK（p-MEK）蛋白的磷酸化。(c)Akt磷酸化（p-Atk）和（d）脂肪形成诱导6天后的脂联素（Adipon）表达水平（所有图中每组n= 6; *p0.05，与ADP相比;#p 0.05，与NaHS相比）。(e)NaHS激活的MEK/ERK和Akt通路。在上述条件下增加脂肪形成（图11）。2）的情况。显然，我们的研究表明，H2S对脂肪形成的影响依赖于脂肪形成诱导剂，因为在没有脂肪形成诱导剂的情况下，在前脂肪细胞中没有观察到脂质此外，H2S处理培养的脂肪细胞没有改变脂解，因为它没有改变FFA浓度或HSL磷酸化。这些观察结果表明H2S刺激的脂肪生成和脂质积累与脂解无关.胰岛素是脂肪形成的主要激素诱导剂，通过胰岛素受体（IR）激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI 3-K）/Akt通路以促进脂肪细胞分化。IBMX和地塞米松联合调节PPARc，通过蛋白激酶A（PKA）途径促进脂肪形成。Xue等[49]报道，外源性H2S通过增加IR敏感性激活肌管和3 T3 L1细胞中的PI 3-K/Akt通路，导致体外和体内葡萄糖摄取改善。胰岛素敏感性可通过IR底物蛋白IRS 1和IRS 2的丝氨酸/苏氨酸磷酸化来调节。Akt是脂肪形成的重要下游调节蛋白我们已经证明Akt活性的抑制导致脂肪形成受抑制（图1A和1B）。7（b）和（d））。此外，Akt途径的抑制降低了NaHS诱导的前脂肪细胞中甘油三酯的积累。因此，我们证明了NaHS刺激其下游Akt信号传导以诱导小鼠前脂肪细胞的脂肪形成。成脂分化有两个主要阶段：早期脂肪化或MCE和终末分化。MCE是以C/EBPb增加为标志的同步过程。当暴露于适当的环境和遗传因素时，前脂肪细胞经历MCE，增加DNA复制，形成克隆，并转化为脂肪细胞表型[50]。脂滴积聚发生在终末期[40，42，50每个脂肪形成阶段表现为不同的转录和遗传变化和调节[52 我们的研究证实，延长H2S处理ADP 4和6天导致更大程度的脂肪形成，表明油红O染色和脂质积累，在小鼠前脂肪细胞。NaHS上调MCE基因（Cdc45、Mcm3和Cdc25c）的表达和在脂肪诱导下的Cdk2蛋白表达（图5）。H2S也通过其R. 维尔马，M。Fu，G.Yang等人工程20（2023）3645见图7。Cdk2和Akt介导NaHS刺激的小鼠脂肪细胞增殖和脂肪形成。(a)SU9516抑制Cdk2活性（b）用capivasertib（Capi）抑制Akt活性后脂肪细胞中的脂质蓄积，用油红O染色测量(c)有或无Cdk2抑制剂（SU9516）的活脂肪细胞的MTT测定。使用以下公式计算细胞活力：第3天/第0天×100%。(d)在加或不加Akt抑制剂capivasertib的不同组中，小鼠脂肪细胞中甘油三酯（mg）/mg蛋白的蓄积（每组n= 6; *p 0.05）。磷酸化（图6）。Akt和MEK磷酸化通过PPARc反式激活为脂质积累和分化铺平了道路[15]，标志着终末阶段。因此，H2S通过作用于脂肪形成的早期和终末阶段而促进脂肪形成.在我们以前的研究中，我们证明了H2S导致了PPARc，3 T3 L1细胞中的S-巯基化[15]。在此，我们证实WT脂肪组织比CSE-KO脂肪组织具有更高的C/EBPb和PPARc表达同样，外源性H2S在成脂诱导的前两天增加原代前脂肪细胞中C/EBPb和PPARc的成脂诱导剂如胰岛素通过MAPK途径启动MCE，导致C/EBPb活性增强[6，55]。C/EBPb是启动转录级联反应的关键因子，转录级联反应最终导致PPARc表达[6]并诱导较高的PPARc S-硫化[15]和脂肪细胞分化。C/EBPb可以在脂肪形成诱导的24小时内通过MAPK（MEK/细胞外信号调节激酶（ERK））和Cdk 2在ThreeThreat-188处的磷酸化而被激活[6，15，56]。H2S处理显著上调分化细胞中Cdk 2和MEK的表达，导致C/EBPb基因的上调表达（图5（a））。此外，C/EBPb刺激有助于激活DNA解旋酶的克隆扩增基因，这有助于DNA复制。C/EBPb的激活增加了重要的细胞周期基因Cdc 45、Mcm 3、Gins 1和Cdc 25 c的表达。 这种增加的基因表达可以上调前脂肪细胞中的DNA复制，导致细胞增殖[54，55，57]。细胞周期基因通过DNA解旋酶发挥作用。复制型DNA解旋酶的核心由六种不同的多肽（Mcm 2 -7）形成。通 过 与 Cdc 45 和 异 源 四 聚 体 Gins 复 合 物 -Cdc 45-Mcm 2 -7-Gins（CMG）复合物形成复合物来激活复制解旋酶。Mcm 3是Mcm 2 -7复合物的组分因此，CMG复合物调节真核细胞染色体DNA复制。Cdc25是一种磷酸酪氨酸磷酸酶，其有助于S期和M期进入的细胞。敲除这些基因导致3 T3 L1前脂肪细胞中MCE的消失[22，58这种抑制作用证明上述基因是C/EBPb促进MCE的关键下游效应子。Cdk2是一个重要的细胞周期调节因子，控制克隆扩张。通过G1/S转换。使用Cdk2抑制剂（SU9516）阻断前脂肪细胞进入S期，我们在前三天阻止了前脂肪细胞的克隆扩增（图7（a））。较低的克隆扩增导致脂肪细胞中甘油三酯的显著低的积累（图1A和1B）。 7（a）和R. 维尔马，M。Fu，G.Yang等人工程20（2023）3646（c）款）。本实验证明，Cdk2调节的前脂肪细胞的克隆扩张是脂肪形成所必需的。我们证明了H2S促进了脂肪细胞分化早期的MCE过程，如显著上调Cdk2和抑制p27水平所证明的。 此外，除Gins 1外，H2S处理显著增加了所有其他C/EBPb靶基因的表达（图5（a））。Gins和Cdc 45与Mcm2 -7的结合虽然Gins1的表达在H2S处理的分化细胞中没有改变，但由于Mcm和Cdc45基因导致的总体DNA螺旋酶反应显著增加，从而增加DNA复制和MCE。为了证明H2S诱导MCE，我们发现，基于BrdU掺入测定和MTT测定，H2S增加了分化和非分化前脂肪细胞的增殖（图5（b））。在间充质干细胞[28，61]和其他非脂肪细胞（如心肌细胞和脐静脉内皮细胞[62-64]）中也报道了H2S的类似促增殖作用有趣的是，MTT试验显示H2S仅在脂肪形成诱导下增加活细胞数量（图5（c））。虽然BrdU掺入标记S期DNA复制的程度，但MTT测定检测细胞活力的终点。可能是成脂诱导促使细胞通过细胞周期进程的所有检查点，并且H2S增加了这些细胞的活力。脂肪量扩张可通过脂肪细胞增生或
我的内容管理
展开
