2018-2019年中国北方地区牛乳腺炎肺炎克雷伯菌耐药性分析

工程10（2022）146研究抗菌剂耐药性-供试品2018-2019年中国北方地区临床型牛乳腺炎肺炎克雷伯菌分子流行病学分析宋世凯a，#，何文娟a，#，杨大伟b，马纳尔·本莫福克a，王耀a，李继云c，孙承涛a，宋祥斌a，马世珍a，蔡昌d，e，丁双阳a，吴聪明a，沈章琪a，杨旺a，a中国农业大学动物医学院动物源性食品安全检测技术北京市重点实验室，北京100193b中国兽医药品监察所，北京100081c湖南农业大学兽医学院，湖南长沙410125d研究和创新办公室，默多克大学，默多克6150，澳大利亚e浙江农林大学动物科学技术学院中澳动物健康大数据分析联合实验室，浙江杭州311300阿提奇莱因福奥文章历史记录：2020年8月31日收到2021年1月8日修订2021年1月28日接受2022年2月25日在线提供保留字：临床型乳腺炎肺炎克雷伯菌分子特征种群结构耐药性A B S T R A C T肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae，K.肺炎（KpI）是引起奶牛乳房炎的主要诱因，与高死亡率和产奶量降低有关。然而，缺乏关于牛K.肺炎，限制其通过食物链传播的风险评估。在此，我们调查了K.对中国北方地区6301份奶牛临床型乳房炎（CM）乳样进行了肺炎克雷伯氏菌（Pneumoniae）的检测。总共183K。肺炎分离株，2018年和2019年的检出率分别为3.0%和2.8%。就像人类临床上的K。pneumoniae，均为CMK。肺炎克雷伯菌属（Klebsiella）143株，肺炎克雷伯菌属（KpI）143株。拟肺炎亚种类克雷伯氏菌（KpII-B）（n= 37）和变异克雷伯氏菌（KpIII）（n= 3）。我们在KpI分离株中检测到超广谱β-内酰胺酶编码基因blaSHV-2a、blaCTX-M-14和blaCTX-M-15，以及clpC、lpfA、lacI、lacZ、lacY和fecABDEIR操纵子，这可能有助于它们在奶牛中的致病性和宿主适应性奶牛场中KpI的高流行率可能是有问题的，因为它显示出比KpII-B和KpIII分离株相对更高的抗生素耐药性和毒力基因携带率此外，我们观察到CM和人类感染相关KpI分离株之间的种群结构存在明显差异，与人类侵袭性感染相关的基因很少在牛分离株中观察到，这表明很少有CM相关KpI分离株。肺炎分离株对人类健康构成威胁。然而，牛KpII-B分离株与人类感染的分离株具有高水平的核苷酸序列同一性，并且经常携带固氮基因nif，这表明牛和人类的KpII-B分离株与植物来源的细菌之间©2022 The Bottoms.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae，K.肺炎）在自然界中普遍存在，并感染广泛的宿主，包括植物、动物和人类[1]。它是奶牛临床型乳房炎（CM）的主要诱因之一[2]-一种主要与细菌感染相关的流行且昂贵的疾病[3，4]。一般来说，CM*通讯作者。电子邮件地址：wangyang@cau.edu.cn（Y. Wang）。#这些作者对这项工作做出了同样的革兰氏阴性菌引起的CM比革兰氏阳性菌引起的CM更难治愈[5]，革兰氏阴性菌感染的平均费用为211.03美元/例，而革兰氏阳性菌CM的平均费用为133.73美元/例[6]。大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）、克雷伯氏菌（K.肺炎是牛CM的第二个最常见的革兰氏阴性原因，但就产奶量降低、弃奶、治疗成本、死亡和淘汰而言，它是最有害的[7，8]。 鉴于K.肺炎在奶牛养殖中的感染，对种群结构、抗生素耐药性和发病机制的研究尤为重要。https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.01.0152095-8099/©2022 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可从ScienceDirect获取目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engS. 宋，W。He，D.Yang等人工程10（2022）146147×根据gyrA、parC和染色体定位的β-内酰胺酶基因序列进行系统发育分析，将K.肺炎克雷伯氏菌分离株可分为三个不同但密切相关的亚群：克雷伯氏菌;肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella quasipneumoniae，KpI ） 、 类 肺 炎 克 雷 伯 氏 菌 （ Klebsiella quasipneumoniae ， K.quasipneumoniae，KpII）和变栖克雷伯氏菌（Klebsiellavariicola，K.variicola，KpIII）[9-12]。所有三种细菌群均与人类肠外感染相关，来自美国的报告已在患有乳腺炎的奶牛的乳汁样本中鉴定出KpI、KpII和KpIII分离株[13，14]。然而，由于传统的实验室诊断方法不能可靠地区分三个克雷伯氏菌群[15，16]，因此估计牛乳腺炎中三个克雷伯氏菌群中每一个的真实负荷仍然具有挑战性。评价K. 在奶牛肺炎的感染中，大多数研究集中在毒力因子和抗生素耐药性上。几种细菌因素可能有助于K。奶牛中肺炎感染，包括Fe3+转运相关的fec基因、lac操纵子和金属（铁、锌和钙）代谢相关的基因[14，17]。然而，已知的致病因子在肠道定植和/或入侵人类中发挥作用，似乎并不参与克雷伯氏菌的致病性。pneumoniae在牛CM中的表达。例如，clbA-Q（编码大肠杆菌素）、iucA-D和iutA（编码需氧菌素）、irp、ybt和fyu（编码耶尔森氏杆菌素）、iroBCDEN（编码沙门氏菌螯铁蛋白）、mceA-J（编码微菌素）以及rmpA和rmpA 2（类粘蛋白表型A的调节因子）在克雷伯氏菌中很少观察到。从CM奶牛中回收的肺炎分离株[17]。此外，由于K.肺炎对抗生素治疗反应差，由该病原体引起的乳腺炎可导致显著的经济损失[18]。K.来自奶牛的肺炎分离株在不同地区之间差异显著。在欧洲和美国，克雷伯氏菌属（Klebsiellaspp.）从CM病例中分离的菌株仅显示出对四环素（5.6%-在中国，一项研究显示克雷伯菌属对头孢喹肟、卡那霉素、头孢噻呋、多粘菌素B 和四环素的耐药率相对较高（10%-[21]第20段。K.在欧洲和美国的奶牛中也检测到了含有多种抗生素耐药基因的肺炎分离株，包括赋予对β-内酰胺类（blaCTX-M、blaSHV和blaTEM）、四环素类（tet（B））和喹诺酮类（oqxAB）耐药的那些[14，17，22，23]。然而，很少有研究调查了克雷伯菌的耐药性概况。肺炎克雷伯氏菌分离株。根据《2017年中国奶业统计年鉴》[24]，截至2016年底，中国约有1500万头奶牛尽管K.肺炎克雷伯氏菌在CM病例中的种群结构和分子特征尚不清楚。肺炎克雷伯氏菌的感染。这种信息的缺乏限制了我们对K风险的理解。 pneumoniae感染奶牛，并阻碍了关键控制点的识别。为此，我们于2018 - 2019年连续采集了中国北方地区三个规模化奶牛场的CM奶牛的牛奶样品，检测了K. pneumoniae分离株，并评估其抗菌药物敏感性。然后，我们利用全基因组测序（WGS）和生物信息学分析系统地研究了CM相关K的群体结构和分子特征。中国北方地区奶牛肺炎。最后，我们比较了100个KpI和36个准肺炎克雷伯菌肺炎亚种的全基因组序列。从人临床样本中分离出的具有当前研究中获得的KpI和KpII-B序列的类似肺炎克雷伯菌（KpII-B）分离株，以在基因组水平上评估牛和人相关KpI和KpII-B菌株之间的关系。2. 材料和方法2.1. 牛群、样本采集和细菌培养于2018年1月至2019年12月从位于山东、河北和黑龙江省的三个具有代表性的大型商业奶牛场采集样本。每个奶牛场有3000-奶牛饲喂全混合日粮，在挤奶厅挤奶，并圈养在自由饲养场。挤奶前，对奶牛进行CM筛查，并由畜群兽医根据可见症状（包括乳房肿胀、发热、硬度、发红和/或乳汁呈水样并伴有薄片、凝块或脓）确认疑似病例。如前所述进行乳汁样品的采集和细菌分离[25，26]。简言之，从显示明显乳腺炎症状（如乳房明显采集后，所有样品均在低温（2-8 °C）下储存 对于每种样品，将10 μ L牛奶接种到CHROMagar定向板（CHROMagar Company，France）上，并在37 ℃下孵育18 -24小时。嫌疑人K。回收肺炎链球菌分离株（蓝色菌落）并煮沸以提取DNA，将其用于16 S核糖体RNA（rRNA）基因测序和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析，使用先前描述的引物[27]。2.2. 抗菌药物敏感性试验克 雷 伯 氏 菌 的 药 敏 试 验 。 根 据 临 床 实 验 室 和 标 准 化 研 究 所（CLSI）指南，使用肉汤微量稀释法进行肺炎分离株的分离[28]。E.coli ATCC ®25922用于常规质量控制（QC）。所有测试的抗生素通常用于人类和/或动物感染，包括头孢曲松、头孢噻呋、氟苯尼考、庆大霉素、阿莫西林/克拉维霉素、卡那霉素、环丙沙星、替加环素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、四环素、美罗培南和多粘菌素。根据CLSI文件VET 08[28]和M100-S28[29]以及欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）指南[30]解释结果。MIC50和MIC90的值分别代表抗微生物剂抑制50%和90%细菌生长的最小浓度2.3. 全基因组测序使用HiPure细菌DNA试剂盒（Magen，中国）从过夜培养物中提取基因组DNA。使用KAPA HyperPrep试剂盒（Roche，Switzerland）预 测 序 DNA 文 库 ， 并 使 用 Illumina HiSeq 2500 平 台 （ AnnoroadGenomics Co.，中国）。使用SPAdes（版本3.13.0）重新组装序列读数，最小组装覆盖率为50[31] 。从美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库下载了总共100个人KpI和36个人KpII-B WGS。KpI序列对应于2016年至2019年中国的人类临床分离株，而人类KpII-B序列对应于2015年至2020年中国、巴基斯坦、泰国、美国、墨西哥、希腊、荷兰和尼日利亚的人类分离株。详细的菌株信息见附录A中的表S1S. 宋，W。He，D.Yang等人工程10（2022）146148≥2.4. 分子分析K.使用Kleborate（版本0.4.0）通过将基因组组装体与来自NCBI数据库的一组策展的克雷伯氏菌组装体进行比较来确定肺炎克雷伯氏菌群[17]。已知的抗生素耐药性和毒力基因是使用基于K.肺炎细菌分离株基因组序列数据库（BIGSdb）和毒力因子数据库[32]。采用多位点序列分型技术（MLST）对K.肺炎分离株[33]。使用BioNumerics（版本7.0;Applied Maths，Belgium）计算的Simpson多样性指数用于评估基因型多样性。使用BioNumerics和BURST算法生成所有ST的最小生成树[34]。通过在线网站，将产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的SHV变体与不产ESBL的SHV变体分离[35]。2.5. 单核苷酸多态性过滤和系统发育分析所有草图基因组用于核心基因组比对，并通过将核心基因组序列与K. pneumoniae菌株NTUH-K2044参考基因组[17]。使用Harvest软件包（版本1.1.2）[36]中的Parsnp构建基于多个核心基因组SNP比对的邻接（NJ）系统发生树，并使用交互式生命树（iTOL）进行可视化2.6. 基因组注释和泛基因组分析使用快速原核基因组注释工具Prokka注释组装的基因组草图[37]。将所得通用特征格式版本3（GFF 3）文件用作输入文件，并使 用 Roary[38] （ 版 本 3.11.2 ） 生 成 泛 基 因 组 （ 包 括gene_presence_absence.csv文件）Scoary是一种全基因组关联研究（GWAS）分析软件[39]，用于计算细菌附属基因组与宿主性状之间的关联 根据GWAS分析和基因功能注释的结果，我们对可能影响K.奶牛肺炎在5%-95%的K. pneumoniae基因组被定义为共同辅助基因。使用R（版本3.5.3）中的prcomp函数对这些常见辅助基因进行主成分分析（PCA）[17]。3. 结果3.1. K的流行。牛CM乳汁样品中的肺炎共183K。在来自三个奶牛场的6301个CM牛奶样品中回收了肺炎分离株（图1）。附录A中的S1）。K. 在两个采样年中，肺炎的发生率相当一致（p = 0.97），2018年的发生率为3.0%（92/3053，95%置 信 区 间 （ CI ） ： 2.4%-3.7% ） ， 2019 年 的 发 生 率 为 2.8%（91/3248，95% CI：2.2%-3.5%）。在三省间的年检出率无显著性差异。K. 2018年，河北省的猪群中发生了肺炎（3.5%，26/751，95%CI：2.3%-5.0%），而2018年黑龙江省的猪群中发生了最低的年患病率（2.5%，21/831，95%CI：1.6%-3.8%）（图1）。 1和表S2附录A）。图1.一、K. 2018年至2019年，中国北方地区CM奶牛的牛奶样本中存在肺炎。3.2. K.种群结构和遗传多样性。 pneumoniae WGS和NJ系统发育树分析核心基因组的等位基因谱显示，183 K.肺炎克雷伯氏菌可分为三个不同 的 群 ： 克 雷 伯 氏 菌 群 ; 肺 炎 克 雷 伯 氏 菌 （ KpI ， 78.1% ，143/183 ） ， KpII-B ， （ 20.2% ， 37/183 ） ;变 栖（ KpIII ，1.6%，3/183）（图2（a））。这些基因组之间和基因组内核心基因的平均核苷酸序列同一性分别为96.2%使用5%-95%的基因组中存在的5174个共同辅助基因进行进一步的MLST分析表明，显着的遗传多样性内的三个群体。在143株KpI分离株中共观察到50株ST，Simpson三种KpIII分离株属于两种不同的ST，Simpson 最常见的KpI基因型（n5分离株）为ST 2324（18.9%，27/143）、ST 107（8.4%，12/143）和ST 116（7.7%，11/143），而不超过3个KpII-B或KpIII分离株属于同一ST（图2（c））。KpI基因型的分布和动态分析显示，同一牛群CM奶牛中没有一致的优势ST。ST116是2018年黑龙江牛群中最流行的ST（42.9%，9/21），而ST 2324（33.3%，5/15）是2019年黑龙江牛群中最流行的ST。ST 2324是2018年山东牛群中最流行的ST（55.2%，16/29），而2019年该牛群中ST107（23.3%，7/30）。然而，在两个采样年，在河北省的牛群中均未观察到优势KpI ST（图12）。 2（d））。3.3. 药敏在183K 。肺炎分离株对甲氧苄啶/磺胺甲恶唑的耐药率较高（97.3%，178/183），而对四环素（20.2%，37/183）和头孢噻呋（14.8%，27/183）的耐药率中等。头孢曲松钠、氟苯尼考、庆大霉素 、 头 孢 噻 肟 钠 的 耐 药 率 分 别 为 5.5% （ 10/183 ） 、 5.5%（10/183）、2.7%（5/183）、阿莫西林/克拉维酸（1.1%，2/183）、卡那霉素（1.1%，2/183）、环丙沙星（0.5%，1/183）和替加环素（0.5%，1/183），所有菌株均对美罗培南和多粘菌素敏感。然而，观察到分离物的耐药性谱的S. 宋，W。He，D.Yang等人工程10（2022）146149图二.种群结构的K.肺炎分离株。(a)基于核心基因等位基因图谱的系统发育网络和NJ系统发育分析。(b)基于183株K. pneumoniae基因组。（c，d）183 K的最小生成树。结果表明，中国北方地区奶牛CM的基因型分布及动态变化规律。在三个不同的群体中。12种检测抗生素对KpI分离株的最小抑菌浓度（MIC）分布比KpII-B和KpIII分离株更宽，尽管在所有三个抗生素组中观察到除头孢曲松、头孢噻呋和四环素外的所有抗生素的MIC50和MIC 90值相似（表1）。3.4. 耐药性和毒力基因谱在183株分离株中共检测到57种抗菌药物耐药基因（附录A中的表S5），其中78.9%（n= 45）在KpI分离株中鉴定。编码β-内酰胺酶的基因是最丰富的耐药基因，100%的分离株携带blaSHV（21.0%产ESBL的blaSHV变体和79.0%不产ESBL的blaSHV变体），3.5%携带blaCTX-M（blaCTX-M-14和blaCTX-M-15），2.8%携带blaTEM-1。此外，在KpI分离株中检测到氨基糖苷类耐药基因strAB、苯酚耐药基因catA和floR、磺胺类耐药基因sul 2、甲氧苄啶耐药基因dfrA以及四环素耐药基因tet（A）和tet（D），患病率范围为4.2%-32.2%（附录A中表S5相比之下，KpII-B和KpIII分离株分别仅携带β-内酰胺抗性基因blaOKP-B和blaLEN（图11）。 3（a））。我们也观察到ESBL编码基因blaSHV-2a（n = 22）、blaCTX-M-14（n = 2）或blaCTX-M-15（n = 3）阳性的27株KpI分离株对头孢噻呋表现出高水平耐药。总体而言，在183株分离株中检测到70种毒力相关基因（表S5）。在所有三个营养群中均检测到编码1型和3型菌毛（主要粘附结构）和AcrAB外排泵（一种针对宿主先天免疫系统提供保护的新型毒力因子）的基因。然而，1型菌毛调控基因fimK在所有KpI和KpIII分离株中均被鉴定，但在KpII-B分离物。铁载体系统，包括肠杆菌素、耶尔森氏杆菌素、沙门氏菌螯铁蛋白和需氧菌素，是克雷伯氏菌的关键毒力因子。pneumoniae，并协助从环境中获取铁--一种有限的资源。 肠杆菌素编码基因存在于所有KpI、KpII-B和KpIII分离株中，而需氧菌素（编码基因簇kvgAS的双组分调控系统也仅在KpI分离株中发现（4.2%）。尿囊素利用基因（allABCDRS、ylbEF、glc、fdrA和ybb）在37.8%的KpII-B和11.2%的KpI分离物中被鉴定，而铁离子摄取操纵子kfuABC在所有KpII-B和KpIII分离物中被发现，但仅在29.4%的KpI分离物中被发现。S. 宋，W。He，D.Yang等人工程10（2022）146150表12018-2019年研究期间，中国北方地区CM奶牛中KpI（n= 143）、KpII-B（n= 37）和KpIII（n= 3）分离株的抗生素耐药性特征抗生素系统群MIC（1g/mL-1）ATCC® 25922耐药率aMIC50mic90分别范围对于克雷伯氏菌属对于每一组阿莫西林/克拉维酸KpI2/18/41/0.5-32/162/11.1%（2/183）1.4%（2/143）KpII-B2/14/22/1-8/40（0/37）KpIII2/14/22/1-4/20（0/3）头孢噻呋KpI180.25-80.2514.7%（27/183）18.9%（27/143）KpII-B111–20（0/37）KpIII120.5-20（0/3）头孢曲松KpI0.0620.01-1280.035.5%（10/183）7.0%（10/143）KpII-B0.120.120.06-0.120（0/37）KpIII0.120.120.06-0.120（0/3）美罗培南KpI0.030.030.01-0.060.030（0/183）0（0/143）KpII-B0.030.030.03-0.030（0/37）KpIII0.030.030.03-0.030（0/3）庆大霉素KpI0.250.50.06-640.252.7%（5/183）3.5%（5/143）KpII-B0.250.50.25-10（0/37）KpIII0.250.50.25-0.50（0/3）卡那霉素KpI110.25-12811.1%（2/183）1.4%（2/143）KpII-B111–20（0/37）KpIII111–10（0/3）四环素KpI4641–64120.2%（37/183）25.9%（37/143）KpII-B441–80（0/37）KpIII444–40（0/3）替加环素KpI0.510.25-80.250.5%（1/183）0.7%（1/143）KpII-B0.510.25-10（0/37）KpIII0.50.50.5-0.50（0/3）环丙沙星KpI0.030.060.01-80.010.5%（1/183）0.7%（1/143）KpII-B0.060.060.01-0.120（0/37）KpIII0.030.060.03-0.060（0/3）氟苯尼考KpI442–12845.5%（10/183）5.6%（8/143）KpII-B442–165.4%（2/37）KpIII442–40（0/3）粘菌素KpI121–20.50（0/183）0（0/143）KpII-B121–20（0/37）KpIII111–10（0/3）甲氧苄啶/磺胺甲恶唑KpI8/1528/1520.25/4.75-8/1520.25/4.7597.2%（178/183）96.5%（138/143）KpII-B8/1528/1528/152-8/152100%（37/37）KpIII8/1528/1528/152-8/152100%（3/3）a根据CLSI文件VET 08和M100-S28以及EUCAST指南（2018）对结果进行解读3.5. 牛和人为确定牛与人K. pneumoniae分离株的基因组水平，并评估风险的牛K。为了研究肺炎克雷伯氏菌分离株与人类健康的关系，我们基于来自243个KpI基因组的约3 266 330个核心基因组SNP构建了NJ系统发育树，其中包括100个公开的中国人类KpI分离株和143个来自本研究的分离株。系统发育分析揭示了与基因型一致的深分支和复杂多样的种群结构（图4（a））。总体而言，从奶牛中分离的KpI菌株表现出更大的遗传多样性比那些从人类，与辛普森的多样性指数的MLST数据的94.2%和40.4%，分别。虽然来自人和牛的菌株没有形成可区分的宿主特异性簇，但在人源性和牛源性KpI分离株之间的群体结构中发现了明显差异。ST 2324、ST 107、ST 116、ST 43、ST 111和ST 2777在中国人临床分离株中ST 11、ST 23和ST 25为常见菌株。虽然在人KpI分离株中ST 11是优势基因型（63%，63/100），但在牛分离株中没有一致的优势基因型。此外，ST 661、ST 15和ST 37 KpI分离株在人类和奶牛中都有发现（图4（a）），并且共有2300-对243个基因组中的辅助基因进行了比较分析，发现4432个共同辅助基因存在于5%~ 95%的基因组中。进一步的PCA分析表明，仅基于辅助基因分析不能可靠地区分牛源和人源KpI分离物然而，人临床ST 11分离株和来自患有CM的奶牛的ST 2324分离株之间的辅助基因存在显著差异（图4（b））。此外，在ST 2324分离物中检测到固氮相关基因（nif操纵子），表明它们可能来源于植物[17，40]。然后，我们根据GWAS分析和毒力基因扫描的结果，检查了来自奶牛或人类的KpI分离株所特有的基因共鉴定出654个基因与牛源性KpI相关（比值比（OR）> 1），发现1154个基因与人KpI相关（OR> 1）（表S5）。其中，与耶尔森氏杆菌素（irp、ybt和fyu）、需氧杆菌素（iucA-D和iutA）、大肠杆菌素（clbA-Q）、沙门氏菌螯铁蛋白（iroBCDEN）、微菌素（mceA-J）、rmpA和rmpA 2合成相关的基因clpC、lpfA、kfuABC、lac操纵子基因（lacI、lacZ和lacY）和Fe3+转运蛋白相关基因（fecABDEIR）在牛源分离株中更为常见。在这两种情况下，这些独特的基因可能有利于宿主入侵和适应，以及逃避宿主免疫反应（图11）。 4（c））。3.6. 牛和人接下来，我们比较了牛和人KpII-B分离株的系统发育特征。因为很少有临床KpII-BS. 宋，W。He，D.Yang等人工程10（2022）146151图3.第三章。来自奶牛的KpI（n= 143）、KpII-B（n= 37）和KpIII（n= 3）分离株的基因组特征条形图显示了每个谱系（KpI、KpII-B和KpIII）中（a）关键抗性基因和（b）毒力因子中每一个的存在（颜色）和不存在（灰色）x轴：菌株数量;y轴：菌群。来自中国的分离物基因组（n= 11）可从数据库获得，我们下载了25基因组序列从巴基斯坦（n= 8）、泰国（n= 2）、美国（n=5）、墨西哥（n= 1）、希腊（n= 1）、荷兰（n= 1）和尼日利亚（n= 7）。 与KpI分离株一样，系统发育树显示人或牛KpII-B分离株均无宿主特异性簇（附录A中图S2（a））。一个人临床KpII-B分离株（09 A323）和两个来自CM奶牛的分离株（SD 130 -19和SD 52 -19）显示出非常密切的关系，共有326个核心基因组SNP（326/3 296 574，占整个核心基因组的0.01%）。2019年在希腊报告了人KpII-B分离株09A323，而2019年从中国回收了两种牛KpII-B分离株（SD 130 -19和SD52 -19）。尽管人KpII-B分离株和两种牛KpII-B分离株具有高度的核苷酸序列同一性，这表明KpII-B可能在人和牛之间传播，但尚不清楚这种传播是如何发生的。然后，我们检查了来自大肠杆菌的KpII-B分离株中的毒力因子。牛和人类虽然肠杆菌素合成操纵子clbA-Q牛KpII-B分离株中尿囊素利用基因allABCDRS、ylbEF、glc、fdrA和ybb的流行率（37.8%）远高 于 人 临 床 分 离 株 （ 13.9% ） 。 nif 固 氮 相 关 基 因 在 来 自 人 类（44.4%）和奶牛（29.7%）的KpII-B分离物中的流行率也很高，表明这些分离物最初可能是植物病原体[17，40]（图17）。S2(b)附录A）。4. 讨论本文对K.对我国奶牛肺炎克雷伯氏菌的流行情况、抗菌药物敏感性、分子特征、种群结构及与肺炎克雷伯氏菌的关系进行了研究。来自牛和来自人的肺炎分离物。年患病率（3.0%）2018年和2019年的2.8%）相似先前报告的平均患病率（2.3%，311/13498）克雷伯氏菌属的 [25] 但 低 于 克 雷 伯 氏 菌 属 。 中 国 东 北 地 区 的 牧 群 （ 14.4% ，183/1271）[41]。我们第一次把3K分类。肺炎克雷伯氏菌群KpI、KpII-B和KpIII。以前仅在美国的CM奶牛中鉴定出这些CMPs组[14]，并且与我们的结果一致，发现KpI是主要的CMPs组。然而，没有对来自美国的分离株的种群结构、抗菌药物敏感性特征或致病菌群的分子特征进行进一步分析。与其他人类临床K. pneumoniae分离株[17，42]，我们在中国北方地区患有CM的奶牛中鉴定出高比率的KpI和低比率的KpII-B和KpIII，以及分离株之间的显著遗传多样性。抗微生物化疗通常用于奶牛乳房炎的预防和控制。然而，随着奶牛乳房炎相关病原体中抗菌素耐药性的增加[43]，这种过度使用可能导致泛耐药菌株的出现。在我们的研究中，KpI分离株对卡那霉素（1.4%）、阿莫西林/-S. 宋，W。He，D.Yang等人工程10（2022）146152见图4。人感染（n= 100）和CM奶牛（n= 143）KpI分离株基因组特征的比较分析。(a)基于核心基因组SNP的KpI分离株的NJ系统发育树（b）基于KpI基因组中的辅助基因的PCA分析（c）来自奶牛和人类的KpI分离物中不同基因的检出率* ：p0.05，代表奶牛和人的KpI分离株之间存在显著差异。克拉维他（1.4%）和头孢噻呋（18.9%）低于克雷伯菌属报告的值。2019年从中国大型奶牛群中的CM奶牛中分离出（分别为15%，38%和21%）[21]。AmpCb-内酰胺酶基因blaDHA和ESBL基因（bla-CTX-M-14、blaCTX-M-15、blaSHV-27和blaSHV-2a）通常与人KpI分离株的多药耐药性相关[44]，在本研究中，在奶牛KpI中分别不存在和相对较高（24.5%）。在KpI分离株中blaCTX-M-14（1.4%）和blaCTX-M-15（2.1%）的低流行率与来自奶牛的许多不同肠杆菌科的结果一致[14，22，45]，而在本研究中在相对较高比例（15.4%）的KpI分离株中观察到的blaSHV-2a先前在奶牛中未报告。然后，我们比较了存在于分离株中的毒性基因，这三个组中的每一个。铁摄取操纵子kfuABC和尿囊素酶相关基因如allABCDRS、ylbEF、glc、fdrA和ybb在KpII-B分离株中比在KpII-B分离株中更普遍。KpI分离株，而编码好氧菌素（iucA-D和iutA）、耶尔森氏杆菌素（irp、ybt和fyu）和KvgAS双组分调控系统（kvgAS）的基因这些发现与人类临床K.肺炎分离株[17]。 重要的是我们只找到了1菌毛调控基因fimK，该基因促进K.在鼠肺炎中，在KpI分离株中，肺炎菌毒力[46]。综上所述，我们的结果表明，基于抗菌素耐药性和毒力相关基因的流行率，KpI分离株在奶牛中的致病潜力大于KpII-B和KpIII分离株。S. 宋，W。He，D.Yang等人工程10（2022）146153KpI分离物是奶牛乳腺炎的重要原因，也是人类感染的常见原因[47]。 然而，在我们的研究中，MLST分析表明，在人口结构（基因型）的KpI分离的牛和人类的显着差异。ST 11和ST 23是人类临床分离株中的主要基因型，先前的研究将ST 11与多药耐药性[48，49]和ST 23与高毒力[50，51]联系起来。相比之下，ST 2324、ST 107、ST 116、ST 43、ST 111和ST 2777分离株在CM奶牛中更常见与铁载体合成和荚膜调节相关的基因在人类临床KpI分离株中高度流行，但在奶牛KpI分离株中罕见然而，kfuABC在奶牛分离株中的流行率显著高于人源分离株。这些群体结构和毒力基因携带的差异可能表明，来自奶牛的KpI分离株对人类健康的威胁相对较小与牛源KpI和人源KpII-B菌株在群体结构和致病潜力上的显著差异例如，牛源性和人源性KpII-B分离株在系统发育树上共享分支，并且携带很少的已知毒力基因。像玉米这样的植物为克雷伯氏菌提供了合适的栖息地，其能够产生有利于植物生长的固氮酶[40]。nif基因在所有KpII-B分离物中普遍存在，表明它们可能最初是植物寄生细菌。此外，两个CM衍生的KpII-B分离株与人类临床KpII-B菌株具有高水平的核苷酸序列同一性，提高了种间传播的可能性我们还发现clpC、lpfA、lac操纵子基因和Fe3+转运蛋白相关基因在牛CM相关KpI分离株中比在人临床分离株中更普遍因此，这些基因可能是重要的致病性或寄主适应性/特异性的K。奶牛肺炎热休克蛋白ClpC是一种由clpC编码的ClpATP酶，据报道影响金黄色葡萄球菌在非专职吞噬细胞中的细胞内存活能力[52]。LpfA是大肠杆菌长极菌毛的主要菌毛亚基，由lpfA基因编码，是大肠杆菌的关键病毒因子。在乳腺炎形成过程中有助于上皮细胞的侵袭[53-55]。报告表明，lac操纵子基因（lacI、lacZ和lacY）和Fe3+转运蛋白相关基因（fecABDEIR）对KpI分离株的代谢至关重要，并可能赋予奶牛选择性生长优势和适应能力[14，17]。5. 结论总之，我们的研究表明，K。在中国北方地区的CM牛中，分离到的菌株中有三个群（KpI、KpII-B和KpIII）。根据抗菌素耐药性和毒力基因的流行情况，KpI分离株对奶牛的危害可能大于KpII-B和我们认为，由于牛源KpI分离株的种群结构和毒力基因携带的差异，它们对人类健康的威胁相对较小此外，潜在的毒力因子编码基因kfuABC，clpC和lpfA，乳糖操纵子，和铁3+转运蛋白相关基因，所有这些都被确定在KpI分离物从奶牛乳房炎，很少观察到在人类临床KpI分离物。此外，我们的研究结果表明，KpII-B分离株可能来源于植物病原菌株，并指示人类和奶牛之间的宿主间传播，这应该进行监测。致谢我们感谢三个奶牛场的领导和工作人员，特别是赵尊阳博士和赵女士。夏章，感谢他们在取 样 过 程 本 研 究 得 到 了 国 家 自 然 科 学 基 金 （ 81991535 和81861138051）和中国农业科学研究系统（CARS-36）的资助。遵守道德操守准则Shikai Song、Wenjuan He、Dawei Yang、Manar Benmouffok、Yao Wang、Jiyun Li、Chengtao Sun、Xiangbin Song、ShizhenMa 、 Chang Cai 、 Shuangyang Ding 、 Congming Wu 、 ZhangqiShen及Yang Wang声明彼等并无利益冲突或财务冲突须予披露。附录A.补充数据本文的补充数据可在https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.01.015上找到。引用[1] 放大图片作者：A. 克雷伯菌属作为医院病原体：流行病学，分类学，分型方法和致病因素。临床微生物学评论1998;11（4）：589-603.[2] Fuenzalida MJ，Ruegg PL.威斯康星州2个奶牛场由肺炎克雷伯氏菌引起的非严重临床型乳腺炎的分子流行病学研究J Dairy Sci 2020;103（4）：3479-92.[3] Jamali H ， Barkema HW ， Jacques M ， Lavallée-Bourget EM ， Malouin F ，Saini V，et al. 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