医学信息学解锁24（2021）100597TMPRSS 2的结构洞察和抑制机制实验已知的抑制剂甲磺酸卡莫司他、萘莫司他和盐酸溴己新控制SARS冠状病毒2的分子模拟研究凯拉斯湾 Sonawane a，b，*，Sagar S. Barale b，Maruti J. Dhanavade c，Shailesh R.Waghmare b，Naiem H. Nadaf b，Subodh A. 放大图片作者：Ali Abdulmawjood Mohammeda，Asiya M. 马坎达尔湾，Prayagraj M.安比卡？凡迪洛卢a. 作者：Nitin M. Naikb，Vikramsinh B.更多baShivaji大学生物化学系结构生物信息学单位，Vidyanagar，Kolhapur，416004，Maharashtra，印度b印度马哈拉施特拉邦，科尔哈普尔，维德亚纳加，希瓦吉大学，微生物学系，邮编：416004。c印度马哈拉施特拉邦Sangali的Bharati Vidyapeeth's微生物学系A R T I C L EI N FO保留字：COVID-19SARS-CoV-2TMPRSS 2分子对接分子动力学模拟A B S T R A C T严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）是导致全球大流行的Covid-19的原因，迄今为止，尚无有效的治疗方法。SARS-CoV-2的S 宿主细胞的ACE2和ACE2正被用于设计控制新冠肺炎的新药。类似地，宿主细胞的跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS2在病毒“S”蛋白的蛋白水解切割中起重要作用，然而，TMPRSS 2的三维结构信息和抑制机制还有待实验探索。因此，我们认为， 我们已经使用分子动力学（MD）模拟的TMPRSS 2同源模型来使用分子模拟技术研究实验已知的抑制剂甲磺酸卡莫司他、萘莫司他和盐酸溴己新（BHH）的抑制机制。对接前，所有三个抑制剂的几何优化的半经验量子化学RM1方法。分子对接分析表明，卡莫司他甲磺酸盐和其结构类似物Nafamostat强烈相互作用的残基His296和Ser441存在于TMPRSS 2的催化三联体，而BHH结合与Ala386以及其他残基。比较分子动力学模拟揭示了所有对接复合物的稳定行为。MM-PBSA计算还揭示了与萘莫司他和BHH相比，甲磺酸卡莫司他与TMPRSS 2活性位点残基的结合更强。因此，这种结构信息可能有助于理解TMPRSS2抑制的机制方法，这可能有助于设计新的先导化合物来防止SARS冠状病毒2进入人类细胞。1. 介绍严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的迅速爆发对全球公共卫生造成了严重威胁[1]。早些时候，其他β冠状病毒如严重急性呼吸综合征（SARS-CoV）和中东呼吸综合征（MER-S-CoV）引起人类呼吸道疾病[2，3]。由SARS-CoV-2引起的疾病被命名为COVID-19，并已被WHO宣布为全球大流行[1，4]。截至目前，已有超过195个国家受到SARS-CoV-2的影响。继美国、巴西、印度和少数欧洲国家受到严重影响，死亡率更高在意大利COVID-19的潜伏期约为5.2天[5]，但老年患者（年龄>70岁）的潜伏期较短[5]。COVID-19感染发病后最常见的症状是咳嗽、发热和疲劳，而其他症状包括头痛、痰液生成、腹泻、咯血、淋巴细胞减少和呼吸困难[6此前有人认为SARS-CoV-2起源于蝙蝠，但主要通过人与人之间的接触以及通过感染者咳嗽或打喷嚏后形成的飞沫核传播[10]。SARS-CoV-2是一种有包膜的病毒，* 通讯作者。Shivaji University，Vidyanagar，Kolhapur，MS，416004，India.电子邮件地址：kds_biochem@unishivaji.ac.in（K.D. Sonawane）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100597接收日期：2021年2月15日;接收日期：2021年5月5日;接受日期：2021年5月6日2021年5月26日网上发售2352-9148/© 2021由Elsevier Ltd.发布这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：www.elsevier.com/locate/imuK.D. Sonawane等人医学信息学解锁24（2021）1005972基因组，属于结节病毒目冠状病毒科和β冠状病毒属 [11]。最近，已经表明SARS-CoV-2通过其刺突糖蛋白与上皮细胞上存在的受体即血管紧张素转换酶-2（ACE-2）相互作用进入宿主细胞[12]。在肺、肾和心脏细胞中观察到ACE-2的高水平表达[13，14]。然而，观察到的大多数死亡是由于肺损伤。SARS-CoV-2刺突糖蛋白的突变可能给疫苗的开发和进一步应用带来一定的困难。已经报道了关于Nafamostat的体外研究，Nafamostat是一种TMPRSS 2抑制剂，用于阻断MERS-CoV感染[15]。类似地，粘液溶解性止咳剂盐酸溴己新的成分也可作为TMPRSS 2的抑制剂用于治疗流感病毒和冠状病毒感染[16]。然而，早些时候已经报道了治疗流感病毒和冠状病毒感染的几个潜在靶点[17]。Steardo等人，2020年报道，冠状病毒可以感染脑细胞，导致更复杂的临床情况[18]。目前，各种广谱抗病毒药物被用于治疗新冠肺炎患者。抗疟疾药物如氯喹及其衍生物羟氯喹已显示出控制感染的积极作用[19]。SARS-CoV-2的糖基化刺突另一个药物靶标，已知切割病毒刺突“S”蛋白的宿主细胞的跨膜丝氨酸蛋白酶（TMPRSS2）Hoffman及其同事的出色工作表明，可以通过靶向宿主细胞蛋白酶如TMPRSS 2来阻断流感病毒和冠状病毒的进入，而不会对Calu-3细胞系产生毒性[24]。因此，抑制TMPRSS 2可能是一种有希望的治疗方法，以阻止病毒进入人体细胞，以控制SARS-CoV-2感染。然而，没有关于这三个方面的明确文献三维结构，显示了在分子水平上详细的TMPRSS2抑制机制中不同结构域和特定残基的参与。因此，在本研究中，我们使用同源建模技术生成了TMPRSS 2的三维模型，并进行了显式分子动力学模拟（MD）以获得稳定的结构。此外，该MD模拟模型然后用于使用分子对接技术研究TMPRSS 2与其实验已知的抑制剂如卡莫司他甲磺酸盐、萘莫司他和盐酸溴己新之间的分子相互作用。分子对接分析显示，甲磺酸卡莫司他、那法莫司他和盐酸溴己新与TMPRSS 2的活性位点口袋处存在的氨基酸相互作用。因此，TMPRSS 2的这种抑制机制可能有助于设计新的方法来控制SARS-CoV-2进入人体细胞。2. 材料和方法2.1. TMPRSS2的序列检索和同源性建模从UniProt检索跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS2的氨基酸序列（登录号C9JKZ3）[25]。此外，使用BLASTp程序搜索合适的模板以构建TMPRSS2的同源性模型[26]。使用在线服务器PRIMO进行TMPRSS2的同源性建模[27]。通过使用模板如人血浆激肽释放酶（5TJX.pdb）和Hepsin（5CE1.pdb）预测TMPRSS2的三维结构[28]。然后，使用ModRefiner[29]对预测模型进行了细化。使用不同的在线服务器（如PROSA [30]、PROBsum [31]和PDBsum [32]）对TMPRSS 2的细化模型进行了验证。对经验证的具有良好质量的TMPRSS 2同源模型进一步进行使用最速下降法的能量最小化、平衡MD和最后的500 ns分子动力学（MD）模拟，以获得TMPRSS 2的稳定结构，分子对接研究。详细程序将在随后的章节中讨论。2.2. 抑制剂的制备、参数化从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），然后在Open Babel的帮助下转换为PDB格式[33]。嵌合体的Dock Prep工具用于计算电荷并制备这些分子用于对接程序[34]。2.3. 半经验量子化学方法优化缓蚀剂的几何然后使用市售分子建模软件SPARTAN版本18，通过半经验量子化学RM 1方法对Dock Prep制备的抑制剂甲磺酸卡莫司他、萘莫司他和盐酸溴己新进行全几何优化[35]。2.4. TMPRSS 2结合口袋的预测使用在线服务器Computed Atlas of Surface Topography of ProteinsCASTp [36]预测TMPRSS 2的结合口袋。基于相关丝氨酸蛋白酶中存在的共有残基选择潜在的结合口袋。2.5. TMPRSS 2同源模型的分子动力学模拟为了获得分子对接程序的稳定模型，在LinuX环境中使用GROMACS2018.2对预测的TMPRSS 2同源性模型进行了显式分子动力学（MD）模拟[37]。液体模拟的优化势全原子力场（OPLS-AA）[38]用于生成拓扑TMPRRS 2受体，以使用单点电荷（SPC）溶剂模型研究其在水性环境中的稳定性。在使用Gromacs中的工具进行模拟之前，已根据TMPRSS 2的C-末端和N-末端的生理pH指定质子化状态。将TMPRSS2蛋白定心到离立方体边缘6.9nm处，然后通过使用单点电荷（SPC 216）水模型将系统溶剂化。在添加six数量的氯离子用于中和系统之后，NaCl浓度保持在100mM。周期性边界条件（PBC）适用于所有方向，其次是50000步的最速下降能量最小化。短程非键合Lennard-Jones相互作用被截断到1.0 nm。长程静电相互作用通过粒子网格埃瓦尔德（PME）计算[39]。线性约束求解器（LINCS）算法用于约束所有键[40]。进行两步平衡（NVT和NPT），首先在使用Nose-Hoover恒温器[41]在310 K温度下进行100 ps的NVT系综（恒定的粒子数，体积和温度），以及使用Nose-Hoover恒温器和Parrinello-Rahman恒压器在310 K下通过施加位置限制[42]进行100 ps的NPT系综（恒定的粒子数，压力和温度）。生产MD运行以2fs时间步长进行500ns，没有位置限制，并且以每20ps间隔保存轨迹用于进一步分析。为了进行与甲磺酸卡莫司他、萘莫司他和盐酸溴己新复合的TMPRSS 2的MD模拟，分别从各自的复合物产生蛋白质（TMPRSS 2）和配体分子的拓扑结构。蛋白质的拓扑结构由GROMACS 2018.2使用OPLS-AA力场生成，配体的拓扑结构由在线PRODRG服务器生成[43]。该制备的系统进一步与上述TMPRSS2模型类似地处理作为对照。K.D. Sonawane等人医学信息学解锁24（2021）1005973××-==-=+--2.6. MD轨迹通过GROMACS的内置工具如g_rms、g_rmsf、g_hbond、g_gyrate、g_energy、g_sas和do_dssp评价TMPRSS 2蛋白和与所有抑制剂对接的复合物的整体稳定性。溶剂可及性表面积通过Gromacs模块的g_sasa计算[37]，而范德华力和疏水接触通过使用Discovery studio测定。2.7. TMPRSS 2与其抑制剂的采用分子动力学模拟的TMPRSS 2稳定模型，对三种抑制剂卡莫司他、萘莫司他和盐酸溴己新进行分子对接。利用分子动力学模拟的TMPRSS2模型进行了分子对接研究，其中最小势能是从MD轨迹的顶部簇的平均结构（平均结构）获得的。通过使用在线对接服务器“Achil-les”，一种可在http：//biwww.example.com获得的盲对接服务器（使用Autodock ™），与卡莫司他甲磺酸盐对接的TMPRSS 2的MD模拟模型o-hpc.eu/software/blind-docking-server/。TMPRSS2模型作为受体和PDB格式的卡莫司他甲磺酸盐分别发送到服务器进行对接计算。对整个蛋白质进行一系列对接计算，找出结合位点，并使用姿态聚类算法对结果进行聚类2.8. AutoDock分子对接已发现同源建模和分子对接技术可用于研究几种酶和配体之间的折叠模式和分子相互作用[44通过使用Autodock 4.2和拉马克遗传算法（LGA）确认了甲磺酸卡莫司他、萘莫司他和盐酸溴己新与建模的MD模拟蛋白（即TMPRSS 2）的活性位点的结合能力[55]。这里，通过将蛋白酶结构域置于网格框中进行盲对接。TMPRSS 2的所有残基保持刚性。网格尺寸设定为70 × 70 × 70 μ m，以容纳具有0.375 μ m网格间距的配体。在X处选择网格中心59.832 Y50.088 Z42.894坐标，突变率0.02，交换率0.8。&群体大小固定为150，产生50个构象，27000代，25000评价。最佳对接复合物基于2.0 μ g的默认RMSD公差范围进行聚类。使用AutoDock的内置程序评估最佳对接姿势的抑制常数（Ki）。用AutoDock和UCSF Chimera观察配体-受体相互作用[33]。2.9. MM-PBSA法计算对接复合物的结合自由能使用分子力学泊松玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）评价所有三种抑制剂与TMPRSS 2的结合亲和力[56]。采用MM-PBSA方法计算了TMPRSS 2 与 三 种 抑 制 剂 的 结 合 自 由 能 。 通 过 使 用 GROMACS 的g_mmpbsa工具计算结合自由能，为此从300至500 ns MD轨迹收集总共20个快照程序g_mmpbsa工具将系统的总结合能分解为ΔG结合 ΔGMMΔG溶液 通过MmPbSaDecomp.py python脚本计算每个残基在结合自由能中的贡献这有助于确定参与蛋白质-配体复合物相互作用的残基。结合自由能计算如下：ΔG结合=ΔGTMPRSS 2复合物-（ΔGTMPRSS 2+ΔG抑制剂）ΔG结合=ΔEMM+ΔG SolvΔEMM=ΔE vdw+Δ EΔGSolv=ΔGnps+ΔGps3. 结果和讨论3.1. TMPRSS2同源模型的结构分析通过使用多个模板、人血浆激肽释放酶（5TJX.PDB）和Hepsin（5CE1.PDB）预测具有489个氨基酸的TMPRSS2（登录号C9JKZ3）的三维结构。血浆激肽释放酶模板与TMPRSS2序列的同源性最高为42.56%。TMPRSS 2由胞内结构域（残基1 - 84）、跨膜结构域（残基84-106）和低密度脂蛋白受体结构域（LDLRA：残基133-147）组成。TMPRSS 2的本同源模型具有两个胞外结构域;富含半胱氨酸的结构域（残基148 -242）和丝氨酸蛋白酶结构域（残基255-489）（图1）。在TMPRSS 2模型的末端丝氨酸结构域中发现了催化三联体的残基，如His296、Asp345和Ser441（图1）。CATSp分析显示结合口袋中的His296、Asp345和Ser441氨基酸残基以及几个其他残基（图2，图S1补充材料）。TMPRSS2模型通过在线服务器ModRefiner进行模型优化和能量最小化[29]。通过各种在线服务器评估预测模型，PROSA [29]分析表明，TMPRSS 2的预测模型的Z评分为7.48（图3A）与具有Z分数为6.64,（补充图S1），其在X射线和NMR天然结构的范围内。TMPRSS 2模型的大多数氨基酸残基显示负相互作用能，表明预测的3-D结构的质量良好（图3B）。此外，还进行了PROPERTIES分析，以检查预测的TMPRSS2模型的质量[31]。该分析显示99%的残基存在于允许区域中，并且仅1%的残基存在于不允许区域中（图3C），表明TMPRSS2模型的良好质量3.2. 活性部位预测丝氨酸蛋白酶的活性位点通常由催化三联体中的Ser、His和Asp残基组成[57]。使用CASTp在线服务器预测TMPRSS2活性位点残基[36]。CASTp服务器显示Fig. 1. 显示SRCR的TMPRSS 2预测模型：丝氨酸蛋白酶结构域（蓝色）中的清道夫受体富含半胱氨酸结构域（品红色）和催化三联体His296、Asp345和Ssr441（橙色）。(For关于这一图中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版。）K.D. Sonawane等人医学信息学解锁24（2021）1005974图二. CATSp预测的TMPRSS 2结合口袋中的橙色活性位点残基(For关于这一图中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版几个口袋，从其中选择一个口袋，使得来自催化三联体的至少一个残基仍然存在于所选口袋中，这导致在TMPRSS 2中鉴定出三个结合口袋。由于TMPRSS2是丝氨酸蛋白酶，因此选择具有Ser、Thr、His、Asp残基的口袋用于进一步研究。然而，从所选择的口袋中，我们观察到残基His296 、 Glu299 、 Asp435 、 Gln438 、 Ser441 、 Asp345 、 Ser346 、Thr459、Ser460和Thr461可能参与TMPRSS 2活性（补充图 2）的情况。3.3. 半经验量子化学方法在本研究采用半经验量子化学RM1方法优化了甲磺酸卡莫司他、萘莫司他和盐酸溴己新的几何构型。对缓蚀剂的键距、键角和扭转角进行了全几何优化，得到了合适的三维结构。然后，使用半经验量子化学RM 1方法（图4）将这些几何优化的抑制剂进一步用于与TMPRSS 2的MD模拟稳定模型（图5）的分子对接研究。 5）。3.4. TMPRSS 2与对接复合物中抑制剂的分子相互作用甲磺酸卡莫司他、萘莫司他和盐酸溴己新抑制剂的半经验量子化学优化结构图3.第三章。TMPRSS2模型的PROSA分析A）Z评分，B）局部模型质量。C）TMPRSS2模型的Ramchandran图K.D. Sonawane等人医学信息学解锁24（2021）1005975见图4。TMPRSS2抑制剂甲磺酸卡莫司他（洋红色）、萘莫司他（绿色）和盐酸溴己新（紫色）的三维结构。(For关于这一图中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版图五. MD模拟之前（绿色）和之后（青色）的TMPRSS2模型的叠加，其中在半胱氨酸结构域（品红色）和丝氨酸结构域（蓝色）的MD模拟之前（红色）和之后（品红色）的棒中具有二硫键。(For关于这一图中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版。）（图4）用于与TMPRSS 2的MD模拟稳定模型（图5）进行分子对接。最初，虽然活性位点是由CATSp服务器预测的，但是为了进一步获得TMPRSS 2的抑制剂的结合概率，通过使用在线盲对接服务器进行盲对接。 对于卡莫司他甲磺酸盐，我们获得了总共29可能的集群使用2.0 RMSD公差的绑定姿态。其中，具有-6.23kcal/mol最低结合能位姿的是用活性残留物观察。通过AutoDock分析对接复合物显示TMPRSS 2的残基Tyr 337、Asp 345、Gly 391和Ser 441形成氢键;而Val 280、Ala 295、His 296、Glu 299、Lys 342、Lys 392、Thr 393、Gln 438和Asp 440参与范德华相互作用。分子对接研究揭示，卡莫司他甲磺酸盐可以适合TMPRSS 2的丝氨酸蛋白酶结构域的口袋， 如不同确认中 所 示 （图1B）。 6 A）。K.D. Sonawane等人医学信息学解锁24（2021）1005976-±±TMPRSS 2与萘莫司他（甲磺酸卡莫司他的结构类似物）的对接复合物也显示出与催化残基的类似类型的氢键相互作用（图6B和表1和2）。然而，盐酸溴己新分别以单氢键和双氢键与Asp440和Thr393相互作用，而萘莫司他显示与TMPRSS 2的Gln317的氢键和与Gln438的双氢键（图6C，表1和2）。对接的复合物分析显示，甲磺酸卡莫司他和萘莫司他结合在TMPRSS 2的相同口袋与甲磺酸卡莫司他和萘莫司他相比，盐酸溴己新（BHH）与TMPRSS2的对接复合物分析显示更少的氢键相互作用。BHH的氮原子与TMPRSS2的Thr 393相互作用（图6C;表1和2）。然而，TMPRSS 2的残基如Val278、His279、Val 280、His296、Gly391、Lys392、Gln438、Asp440和Ser441提供了额外的疏水相互作用（图6，表1）。TMPRSS 2与卡莫司他甲磺酸盐的对接复合物显示出卡莫司他甲磺酸盐的胍基与催化三联体中存在的活性位点残基如Ser 441和Asp345之间的强氢键相互作用（图6A和表1）。TMPRSS 2的Ser441残基与Camostat甲磺酸盐的氧原子和氢原子相互作用，原子间距离分别为2.21和1.94 nm。类似地，TMPRSS 2的其他相互作用残基如Glu299、Thr393、Gln438和Asp440也显示出氢键结合能力。因此，这些相互作用可以将卡莫司他甲磺酸盐稳定到TMPRSS 2中存在的丝氨酸蛋白酶结构域的结合口袋中（图6A和表1）。分子动力学模拟的TMPRSS 2模型与卡莫司他甲磺酸盐、萘莫司他和发现盐酸溴己新复合物为-6.23 kcal/mol，-7.20 kcal/kcal/mol和5.51 kcal/mol（表1）。TMPRSS 2与甲磺酸卡莫司他和萘莫司他的对接复合物显示出较低的结合能，与盐酸溴己新相比具有较小的差异。甲磺酸卡莫司他、萘莫司他和盐酸溴己新的抑制常数（Ki）分别为26.98μM、5.25μ M和5.25 μ M。91.26μ M，如表1所示。3.5. TMPRSS 2同源模型的分子动力学模拟为了得到稳定的3-D结构，使用GRO- MACS 2018.2 OPLS-AA全原子力场对生成的TMPRSS 2同源模型进行500 ns MD模拟。TMPRSS2模式的动力稳定性主要是基于均方根偏差（RMSD），RMSF和回转半径（Rg）。同源模型和分子动力学模拟模型的叠加图如图5所示。不含抑制剂的TMPRSS 2的主链RMSD在500 ns内显示稳定行为，RMSD值为0.45 ± 0.03nm（图7A）。蛋白质的结构稳定性也已经基于回转半径（Rg）来定义。由于二级结构的空间排列，Rg测量蛋白质的紧凑性。TMPRSS 2的Rg值在2.22-2.36 nm之间，平均为2.248 0.002 nm表示由于TMPRSS2的适当折叠而导致的紧凑性（图 7 B）。TMPRSS 2是存在于人细胞上的膜蛋白，由多个域组成[17]。具有两个结构域（半胱氨酸结构域和催化丝氨酸结构域）的TMPRSS 2模型分别显示0.31 ± 0.01 nm和0.39 ± 0.01 nm的平均RMSD值（图1）。 8a和见图6。TMPRSS（青色）棒中的活性位点残基与A）甲磺酸卡莫司他（品红色）; B）萘莫司他（绿色）; C）盐酸溴己新（紫色）的对接相互作用; D）在TMPRSS 2活性位点残基（青色）的活性位点内显示甲磺酸卡莫司他（品红色）、萘莫司他（绿色）和盐酸溴己新（紫色）的所有三种抑制剂的对接复合物的叠加。(For关于这一图中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版K.D. Sonawane等人医学信息学解锁24（2021）1005977表1TMPRSS 2与其抑制剂的分子对接结果Thr393，Gln438，Asp440，Ser441，Ala 295GLU299Tyr 337His279，Val 280，His296，Gln317，Trp384，Gly391，Thr393，Ser 394，Glu395，Gly439，Asp440，Ser 441，Gln438，嗯-7.20 5.25uM 33盐酸溴己新5702220Val 278、His 296、Lys 392、Thr 393、Asp440、Ser 441。-5.5191.263嗯表2分子对接后TMPRSS 2与甲磺酸卡莫司他、萘莫司他和盐酸溴己新之间的氢键相互作用。对于TMPRSS 2-盐酸溴己新，其为70 ns（图7A）。总体而言，与三种抑制剂复合的TMPRSS 2的RMSD值显示TMPRSS 2与三种抑制剂复合的TMPRSS 2相比更稳定。不含抑制剂的TMPRSS2 （图 7 A）。所有三个复杂的描述Sr.号TMPRSS 2的活性位点残基与卡莫司他甲磺酸盐之间的相互作用距离（单位：mm）模拟运行期间的稳定行为（图 7 A-B）。1天冬氨酸345 OD 2----配体1.AH：1.92441系列HG -韧带。1.AO：1.942 Ser 441 HN - Lig. 1.AO：2.2134 Tyr 337 OH - Lig. 1.AH：3.075 Gly391 O - Lig. 1.AC：3.733.7. 在抑制剂图8和表3中分别示出了两个结构域的RMSD分析，其中丝氨酸结构域（255的 整个模拟 期间 为 所有 三 因为在复杂的-Sr.号TMPRSS 2的活性位点残基与萘莫司他之间的相互作用。距离（单位：mm）抑制剂与TMPRSS2的相互作用，与不含TMPRSS2的TMPRSS2相比1 Gln 438 O - Lig. 1.AH：1.792 Gln 317 O - Lig. 1.AH：2.173 Gln 438 OE1 - Lig. 1.AH：3.12抑制剂（Fig. 8 A）。对于TMPRSS 2-卡莫司他，有和没有抑制剂的TMPRSS 2的丝氨酸结构域的RMSD值的差异为0.09 nm对于TMPRSS 2-萘莫司他和0.Sr.号1TMPRSS 2活性位点残基与盐酸溴己新之间的相互作用。距离（单位：mm）对于TMPRSS 2-盐酸溴己新复合物（表3）。半胱氨酸结构域RMSD的分析显示了类似类型的情况。Thr 393 OG - Lig. 1.AH：2.262 Thr 393 OG - Lig. 1.AH：2.513天冬氨酸440 OD 2-配体1.AC：3.35B）。全TMPRSS2模型（图7A）和特定结构域（图8A和B）之间的RMSD值的差异可能是由于两个结构域即半胱氨酸结构域和催化丝氨酸结构域之间存在环（图5）。TMPRSS 2的RMSF分析显示半胱氨酸结构域和环区的氨基酸的更多波动，与TMPRSS 2中丝氨酸结构域的0.120 nm相比，平均RMSF为0.158 nm（图8C）。然而，RMSF图中0.46 nm的大峰代表环区的波动，而催化三联体残基His296、Asp435和Ser441（包括TMPRSS2的其他二级结构）显示波动较小（图8C）。使用GROMACS的DSSP工具对TMPRSS 2的二级结构分析显示与螺旋相比更多数量的β-折叠。总体而言，TMPRSS2的这种3D结构通过二级结构元件以及五个二硫键来稳定。该分子动力学模拟的TMPRSS 2稳定的三维模型，然后进一步用于分子对接程序。3.6. 与已知抑制剂使用GROMACS 2018.2对TMPRSS 2与三种抑制剂（例如TMPRSS 2-甲磺酸卡莫司他、TMPRSS 2-萘莫司他和TMPRSS 2-盐酸溴己新）的低能对接复合物进行MD模拟，每次高达500 nsTMPRSS 2的稳定性通过考虑骨架RMSD、RMSF和Rg值，对与这些抑制剂复合的化合物进行了评价（图 7和8，表3）。所有三种复合物即TMPRSS 2-甲磺酸卡莫司他、TMPRSS 2-萘莫司他和TMPRSS 2-盐酸溴己新在整个模拟时间内显示稳定的RMSD。发现与卡莫司他甲磺酸盐复合的TMPRSS 2的平均骨架RMSD值为0.41 nm。获得TMPRSS 2-萘莫司他的RMSD值为0.44 nm（图7A，表3），在最后50 ns内有轻微偏差，为0.74nm，而TMPRSS 2-盐酸溴己新复合物的RMSD值为0.35 nm。复合物TMPRSS 2-萘莫司他也显示稳定的RMSD，已经发现，与具有三种抑制剂的对接复合物相比，没有抑制剂的TMPRSS2模型的RMSD更大（图1B）。 8 B）。还计算了不含抑制剂的TMPRSS 2的RMSF分析，并与所有三种复合物进行比较（图8C）。RMSF分析的结果显示，与单独的TMPRSS 2的丝氨酸结构域以及与所有三种抑制剂的复合物相比，来自TMPRSS 2的半胱氨酸结构域的残基流动更多（图8C）。没有抑制剂和存在甲磺酸卡莫司他、萘莫司他、BHH的TMPRS2模型的丝氨酸结构域的RMSF值分别为0.12 nm、0.16 nm、0.19 nm和0.16 nm（图 8C，表3）。类似地，TMPRSS 2-萘莫司他复合物的半胱氨酸结构域中的残基显示出更多的RMSF0.37与TMPRSS 2-Camostat甲磺酸盐和TMPRSS 2-溴己新的RMSF分别为0.22 nm和0.26 nm的所有复合物相比，RMSF图中的四个RMFS值约为0.46 nm的峰对应于TMPRSS 2的环，在催化残基His 296、Asp 345和Ser441中观察到较少的波动（图11）。 8 C）。所有三个复合物的紧凑性和结构变化进行了评价的基础上的回转半径（Rg）。与甲磺酸卡莫司他、萘莫司他和盐酸溴己新复合的TMPRSS2的Rg的平均值分别为2.26、2.28和2.29。 2.28 分别 （图7B）。所有三种抑制剂与TMPRSS2的结合显示出与TMPRSS2的apo形式相比类似类型的结构变化。因此，为了获得进一步的见解，我们计算了TMPRSS 2以及抑制剂的RMSD和Rg值。与单独的TMPRSS 2相比，具有和不具有抑制剂的TMPRSS 2的二级结构分析显示螺旋和β-折叠含量相对于卷曲和转角的减少而增加，而其他二级结构即β-桥、弯曲元件受到轻微影响（表4）。3.8. 甲磺酸卡莫司他、萘莫司他和溴己新抑制TMPRSS 2对TMPRSS2复合物的分子动力学轨迹进行聚类，提取最顶端簇的代表性结构，然后用于分析TMPRSS2与抑制剂之间的分子相互作用Sr名称CID参与相互作用的结合能（Kcal/mol）Ki不氢键1甲磺酸卡莫司他5284360Val 280、Ala 295、His 296、Glu 299、Tyr 337、Lys342、Asp345、Gly391、Lys392、-6.2326.985K.D. Sonawane等人医学信息学解锁24（2021）1005978见图7。TMPRSS 2和TMPRSS 2对接复合物的MD模拟。(A)模拟过程中的均方根偏差（RMSD）。(B)回转半径（Rg）：在模拟期间，不含抑制剂的TMPRSS 2（黑色）、复合物TMPRSS 2-卡莫司他甲磺酸盐中的TMPRSS 2（品红色）、TMPRSS 2-萘莫司他（绿色）和TMPRSS 2-溴己新复合物（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的Web版本MD轨迹的分析揭示，卡莫司他甲磺酸盐在TMPRSS 2的口袋内轻微移动高达50 ns，并且进一步稳定地与TMPRSS 2相互作用（图1A和1B）。7A和9A）。在轨迹分析之后，来自顶部簇的代表性结构显示卡莫司他甲磺酸盐通过疏水以及氢键相互作用与TMPRSS2催化位点相互作用。氨基酸残基Ile 381、His 296和His 279参与疏水相互作用，而Asn 398、Gly282、His 296和Cys 281提供范德华相互作用，His 279、Lys 392、Trp384与卡莫司他甲磺酸盐的苯环通过Pi-烷基相互作用相互作用（图9A）。TMPRSS 2的Glu389侧链上的氧与Camostat甲磺酸胍基氮通过氢键相互作用，Ala386、Ser441和Gly442的骨架酰胺氮形成氢键与甲磺酸卡莫司他和那法莫司他相比显示较少的相互作用。残基Ala 386的主链氮原子与BHH的溴形成氢键相互作用。 类似地，BHH的另一个溴参与与Ile 381、Val 434的π-烷基相互作用，以及残基Asn 398、Ala386、Ala 400、Val 434、Ser 441的范德华力和疏水相互作用（图9C，表5）。所有三种复合物的分析显示，与其它活性位点残基一起，已经发现来自催化三联体的至少一个残基与TMPRSS 2的催化口袋内的卡莫司他甲磺酸盐、萘莫司他和盐酸溴己新相互作用，这可能阻碍其底物在活性位点中的结合。3.9. 分子动力学模拟中的氢键相互作用与 的 羰基 氧氧 的 甲磺酸卡莫司他。 同样，周在TMPRSS 2的His279、Gly385和Gly439残基与卡莫司他甲磺酸酯的羰基氧之间也观察到氢键，这进一步加强了相互作用（图9A和表5）。萘莫司他结合在TMPRSS2的催化位点，涉及总共五个氢键相互作用。在第一个100 ns模拟中观察到Gln438的酰胺氮与萘莫司他的胍基之间存在氢键，在Ser441的羟基与萘莫司他的苯环之间观察到另一个氢键。在Gly391的主链羰基氧与萘莫司他的苯环之间也观察到类似类型的氢键。萘莫司他的胍基参与与Glu 389和Thr 393的骨架羰基的氧原子形成氢键相互作用，为复合物提供了额外的稳定性（图11）。 9 B）。残基Leu273、Val 280、Cys 281、Ile 314、Leu315和Ala 386是主要涉及范德华力和疏水相互作用，这进一步通过使用MM-PBSA的结合能计算得到证实（图1）。 9 B;表5）。TMPRS2-溴己新复合物的分析（图1B）。 9 C）所有三种复合物的氢键分析显示，卡莫他甲磺酸盐在MD模拟期间形成三种氢键相互作用（图1A和1B）。 图9A和10 A），类似于我们的对接结果（图6 A）。在TMPRSS 2-萘莫司他复合物中的Gln 438和Ser 441残基之间观察到两种最稳定的氢键模式，而一种稳定的氢键涉及盐酸溴己新与TMPRSS 2的结合以用于其抑制（图9早期的研究已经报道，氢键是分子相互作用的重要贡献，以便将抑制剂结合到TMPRSS 2上，其在活性位点结合时用水取代TMPRSS 2的天然氢键[58]。这种氢键罚分可以被评估用于估算抑制剂与蛋白质受体的结合效率。 没有抑制剂的TMPRSS 2可以与水形成平均717个氢键，在结合卡莫司他甲磺酸盐和盐酸溴己新后，氢键数量分别减少至694和708，而观察到与萘莫司他复合的TMPRSS与水的氢键732略微增加。这个替换 的 氢 粘结 图案 是 更 强烈地K.D. Sonawane等人医学信息学解锁24（2021）1005979见图8。（A）模拟丝氨酸结构域期间的均方根偏差（RMSD）和（B）半胱氨酸结构域（C）模拟具有丝氨酸结构域、环区和半胱氨酸结构域两者以及催化残基的TMPRSS 2期间的均方根波动（RMSF）RMSF指示红色。不存在抑制剂的TMPRSS 2（黑色），复合物TMPRSS 2-甲磺酸卡莫司他中的TMPRSS 2（洋红色），TMPRSS 2-萘莫司他（绿色）和TMPRSS 2-溴己新复合物（紫色）。(For在该图例中对颜色的引用的解释，读者可以参考本文的Web版本表3TMPRSS 2与500 ns抑制剂的RMSD、RMSF、Rg和氢键相互作用的MD轨迹分析。表4复合物中TMPRSS2和所有三种抑制剂的二级结构元件的百分比Sr.号MDTMPRSS 2的特性TMPRSS 2TMPRSS 2-甲磺酸卡莫司他TMPRSS 2-萘莫司他TMPRSS 2-盐酸溴己新二级结构元件TMPRSS 2 TMPRSS 2-甲磺酸卡莫司他TMPRSS 2-萘莫司他TMPRSS 2-盐酸溴己新1均方根偏差（RMSD）（nm）0.455±0.030.410±0.050.447±0.070.352 ±0.09线圈34 29 28 28β-片层27 31 31 30β-桥3 2 2 2弯15 16 17 17转15 13 13 112均方根波动（RMSF）（nm）0.132±0.060.180±0.090.243±0.120.195 ±0.09Alpha HeliX3-HeliX2 5 6 64 4 3 53回转半径2.264±0.022.268±0.022.280±0.022.280 ±0.02因此，这些残基的几何形状对于催化反应至关重要。因此，为了了解抑制剂结合对细胞（Rg）4与 水 的 氢键710 694 732 708为了确定催化三联体的几何形状，我们研究了催化三联体中存在的H
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