自闭症谱系障碍的神经元蛋白质相互作用网络研究

0文章0蛋白质相互作用研究表明人类诱导神经元中存在导致自闭症谱系障碍的共同生物学机制0图解摘要0亮点0d  人类神经元中13个自闭症基因的蛋白质相互作用网络0d  该网络包含了新报道的、可重复的、与大脑相关的相互作用0d  该网络富集了与自闭症相关的遗传和转录信号0d  个体和共同相互作用均可揭示导致自闭症的机制0作者0Greta Pintacuda, Yu-Han H. Hsu,Kalliopi Tsafou, ..., Nadine Fornelos,Kevin C. Eggan, Kasper Lage0通讯 kevin.eggan@bmrn.com (K.C.E.),lage.kasper@mgh.harvard.edu (K.L.)0简而言之0Pintacuda等人在人类诱导多能干细胞衍生的诱导神经元中生成了一个包含13个自闭症相关基因的蛋白质相互作用网络，并显示该网络包含许多新报道的、可重复的相互作用，这些相互作用可能指向导致自闭症的大脑特异性机制。他们的发现突显了利用特定细胞类型的蛋白质相互作用组来理解神经精神障碍的潜力。0Pintacuda等人，2023年，Cell Genomics 3，100250，2023年3月8日，ª2023年作者。https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100250 ll0文章蛋白质相互作用研究表明人类诱导神经元中存在导致自闭症谱系障碍的共同生物学机制0Greta Pintacuda，1,2,3,8 Yu-Han H. Hsu，1,2,4,8 Kalliopi Tsafou，1,4 Ka Wan Li，5 Jacqueline M. Martı´n，1,3 Jackson Riseman，1,3 Julia C.Biagini，1,2 Joshua K.T. Ching，1,2 Daya Mena，1,2 Miguel A. Gonzalez-Lozano，5 Shawn B. Egri，6 Jake Jaffe，6 August B. Smit，5 NadineFornelos，1,2,4 Kevin C. Eggan，1,3，*和Kasper Lage 1,2,4,7,9，* 1麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所精神病研究中心，剑桥，MA 02142，美国2麻省理工学院和哈佛大学Novo Nordisk基金会疾病基因机制中心，剑桥，MA 02142，美国 3哈佛大学干细胞研究所和干细胞与再生生物学系，剑桥，MA02138，美国 4麻省总医院外科系，波士顿，MA 02114，美国 5阿姆斯特丹自由大学分子与细胞神经生物学系，1081 HV阿姆斯特丹，荷兰6麻省理工学院和哈佛大学蛋白质组平台，剑桥，MA 02142，美国 7哥本哈根精神健康中心生物精神病学研究所，Mental Health ServicesCopenhagen，4000 Roskilde，丹麦 8这些作者贡献相同 9主要联系人*通讯：kevin.eggan@bmrn.com（K.C.E.），lage.kasper@mgh.harvard.edu（K.L.）https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.1002500总结0自闭症谱系障碍（ASD）已与在大脑中富集表达的基因相关联，但目前尚不清楚这些基因如何汇聚成特定细胞类型的网络。我们在从诱导多能干细胞（iPSCs）中衍生的人类兴奋性神经元中构建了13个与ASD相关基因的蛋白质相互作用网络。该网络包含了新报道的相互作用，并富集了在ASD患者中观察到的遗传和转录紊乱。我们利用网络数据展示了与ANK2的ASD相关脑特异性异构体相互作用的重要性，并表征了影响神经生长的PTEN-AKAP8L相互作用。IGF2BP1-3复合物在网络中成为一个汇聚点，可能调节与ASD相关基因的转录回路。我们的发现展示了特定细胞类型的相互作用组作为一个框架，以补充遗传和转录组数据，并说明个体和汇聚相互作用如何导致对ASD的生物学见解。0介绍0自闭症谱系障碍（ASD）包括一组与社交互动、认知和行为挑战相关的遗传性神经发育状况。最近的进展表明，ASD中的多样表型反映了来自常见和罕见遗传变异的多基因贡献。尽管常见变异占据了大部分ASD遗传性，罕见变异往往具有更大的效应大小，影响蛋白编码基因，因此更容易进行功能研究。然而，即使一些ASD相关基因的罕见变异影响了特定的生理过程，如突触形态发生，大多数情况下并不能单独指出ASD生物学的机制基础。更广泛地说，ASD相关基因在神经发育过程中如何整合到高阶途径和网络中仍有待确定。0遗传和生化数据的整合显示，与复杂疾病相关的基因通常汇聚成蛋白质-蛋白质相互作用网络。0蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。在ASD的背景下，早期关于  de novo突变和结构变异的研究也将ASD相关变异映射到相互连接的PPI网络上。然而，这些研究大多依赖于来自公共数据库的PPI数据，因此可能缺乏细胞类型特异性。事实上，高度增殖的细胞类型（例如癌细胞系）的实验在这些数据库中被极度过度代表。相比之下，遗传和转录组数据的整合显示，ASD相关基因在大脑中特定的神经元和非神经元细胞群中表达富集，兴奋性神经元显示出其中一个最强的信号。ASD个体的死后大脑组织中的转录组谱分析也确定了皮层兴奋性神经元作为ASD中关键的失调细胞类型。因此，类似皮层兴奋性神经元的诱导多能干细胞（iPSC）-衍生神经元（iNs）提供了一个与研究ASD相关的关键相关的  in vitro神经元细胞模型。0细胞基因组学3，100250，2023年3月8日，2023年作者。1这是一篇在CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）下的开放获取文章。0ll0开放获取ucts,28weassessedexpressionoftheindexproteinsusing immunoblotting. We were unable to obtain antibodiesto detect seven of the index proteins (Figure 1D; Table S1).Four proteins were successfully detected by immunoblotting(Figure S1D) but lacked IP-competent antibodies. The remain-ing 13 proteins (Figure 1D) were detected by immunoblottingin the form of at least one isoform at week 3 of differentiation(Figure 1E) and were amenable to IP. Many of these proteinsshowed distinct isoform patterns across species, neuronaldifferentiation time points, or cell types (Figure 1E). Theseobservations highlight the importance of using human iNs tocapture cell-type-specific biochemical interactions of relevanceto ASDs.29,30ll0在这里，我们使用iPSC衍生的兴奋性iNs，相互作用蛋白质组学和计算方法来构建与ASD相关基因的大脑细胞类型特异性PPI网络。具体地，我们结合了iNs中13个ASD相关蛋白质的26个免疫沉淀（IP）实验的数据，生成了一个PPI网络，其中>90%的相互作用在文献中未报告。PPI数据在iNs中是可重复的（在westernblot中的>91%复制率），并且与复杂的脑组织中识别的相互作用显著重叠。该网络富集了ASD个体的2/3皮层神经元中转录异常的基因，与将这种细胞类型与ASD发展联系起来的证据一致。为了举例说明如何扰乱网络中特定PPI提供ASD相关细胞表型的机械洞察，我们去除了ANK2的脑特异性外显子，以调节其与突触蛋白的相互作用，并破坏了新发现的PTEN-AKAP8L相互作用影响神经元生长。此外，我们观察到网络中的汇聚信号也可以指向与ASD相关的途径。这由mRNA结合复合物IGF2BP1-3来说明，它连接到网络中多个ASD相关蛋白质，并结合到许多ASD相关基因的转录本。最后，该网络富集了与ASD相关的罕见变异关联，表明它可以补充大规模遗传研究，以优先考虑进一步研究的基因。0结果0ASD相关基因和蛋白质在诱导神经元中表达 一项结合了  de novo和病例-对照稀有变异数据的全外显子测序研究 5鉴定出24个高置信度的ASD相关基因，其在全外显子水平上的显著性（ Q  %  1.35  3 10 � 4）。我们使用这24个基因作为我们工作流程的起点，在iNs中生成了一个ASDPPI网络（图1A），并在此之后将它们及其编码的蛋白质称为指数基因和指数蛋白质。就我们实验的细胞模型而言，我们采用并优化了一个结合了神经发生因子Neurogenin 2（ NGN2）的编程和发育定向的协议25，将iPSC分化为iNs。我们使用了一个iPSC系列（iPS3，STAR方法），其中NGN2  在基因组中在te-tON启动子下被整合，以实现快速和受控的强霉素诱导表达，从而产生高度均一的iN群体250通过RNA测序（RNA-seq）在神经元分化的0、3和6周期间测量ASD相关指数基因的表达（图1C）。这些基因的表达模式随时间变化，但大多数在分化3周后表达，包括具有先前报道的神经元特性的基因。0重要的是，iNs中在第3周就观察到的基因表达（图1C）与人类皮层兴奋性神经元群体中的相同转录本的存在是一致的240（图S1B和S1C），支持这种细胞模型作为大脑细胞类型的代理。接下来，鉴于RNA-seq数据只能捕获稳态下转录本的总数，而不能考虑编码蛋白质产物的翻译速率和降解速率，我们评估了使用免疫印迹来评估指数蛋白的表达。我们无法获得检测七个指数蛋白的抗体（图1D；表S1）。四种蛋白质通过免疫印迹成功检测到（图S1D），但缺乏IP能力的抗体。其余的13种蛋白质（图1D）在分化的第3周以至少一种异构体的形式被免疫印迹检测到（图1E），并且适合进行IP。这些蛋白质中的许多显示出跨物种、神经元分化时间点或细胞类型的不同异构体模式（图1E）。这些观察结果突显了使用人类iNs捕获与ASD相关的细胞类型特异性生化相互作用的重要性。0在诱导神经元中ASD指数蛋白的相互作用蛋白质组学对于具有IP能力的抗体的13个指数蛋白，我们在分化的第4周执行了IP，然后进行了质谱分析（IP-MS）（图2A、2B和S2；表S2）。每个实验都是在每个重复中使用约1500万个细胞进行的。使用标记或无标记液相色谱和串联质谱（LC-MS/MS）定量IP样品中的蛋白质丰度。总共进行了37次IP-MS实验，为每个指数蛋白生成了两到五个实验数据集。对于每个IP-MS实验，我们使用Genoppi进行质量控制（QC）和数据分析。具体来说，我们计算了与对照IP相比在指数蛋白IP中鉴定的每个蛋白质的log2倍数变化（FC）及其相应的统计学显著性（表S2）。有11个数据集未能通过QC阈值（即，重复之间的log2FC相关性为0.6或指数蛋白在误差发现率[FDR]为0.1时未富集），因此我们得到了26个高质量的数据集。我们将log2 FC >0且FDR为0.1的蛋白质定义为指数蛋白的显著相互作用蛋白质；其他检测到的蛋白质被定义为非相互作用蛋白质（表S3）。我们还将每个数据集与来自InWeb数据库的指数蛋白已知相互作用蛋白质相交，该数据库汇总了来自>40,000篇出版物的人类PPI数据（表S3）。这使我们能够评估已报道的相互作用。我们的分析工作流程以SHANK3的IP为例进行了说明。通过免疫印迹确认了IP中SHANK3的富集（图2A，左）并通过IP-MS定量（log2 FC = 1.2和FDR = 0.012；图2B）。IP-MS重复log2FC相关性为0.79（图2A，右）。在这里鉴定的104个显著相互作用蛋白质中只有两个被报道过（图2B）。总的来说，SHANK3在免疫印迹和质谱结果中的富集，加上重复之间的相关性，支持了我们数据的可重复性和稳健性。先前鉴定的SHANK3相互作用蛋白质的数量较少可能反映了我们的实验设计（数据S1），并支持使用神经元特异性蛋白质组学来发现新的基因关系。由于IP-MS数据集是在不同的MS设施中生成的，我们比较了设施之间和相同指数蛋白的IP之间的数据以评估它们的一致性（数据S2；图S3；表S4）。虽然我们观察到了差异02 细胞基因组  3 , 100250, 2023年3月8日0文章0开放获取ADECBll0数据结构和检测到的蛋白质在各实验设施中具有类似的质量和生物学相关性，表明这些数据是互补的。此外，我们没有观察到在同一IP中仅鉴定一个相互作用蛋白与在同一指标蛋白的多个IP中鉴定的相互作用蛋白之间有系统性差异（数据S2），或者在不同FC范围内检测到的相互作用蛋白之间有系统性差异（数据S3）。因此，我们在下游分析中包括了所有鉴定的相互作用蛋白。0蛋白质相互作用网络包括汇聚、新颖和可重复的相互作用。我们合并了26个高质量的IP-MS数据集，生成了一个组合的蛋白质相互作用网络（图2C；表S3）。该网络包括13个指标蛋白的1,021个相互作用蛋白，其中>20%的蛋白与多个指标蛋白相关联（图2D和S4A）。尽管几个指标蛋白的相互作用蛋白与已报告的InWeb相互作用蛋白有显著重叠（表S3），但网络中所有相互作用的>90%尚未0图1. ASD指标基因和蛋白在人类iNs中的表达（A）在人类iNs中为高可信度ASD相关基因生成和分析蛋白质相互作用网络的工作流程。（B）用于从人类iPSCs中生成神经前体细胞（NPCs）和兴奋性iNs的谷氨酸模式化方案25的关键步骤。 （C）源自RNA-seq数据的神经元成熟过程中ASD指标基因表达的热图。CPM，两个重复样本的均值标准化每百万计数；最大log 2（CPM）被限制在9以进行可视化。 （D）指标蛋白过滤的流程图。 （E）通过免疫印迹检测不同iatingiPSCs、小鼠皮层和HEK293细胞中13个指标蛋白的表达。针对ANK2的抗体识别人类特异表位，SYNGAP1在HEK293细胞中不表达。B-actin（B-ACT）用作加载对照。分子量（kDa）标在每个印迹的左侧。0细胞基因组  3 , 100250, 2023年3月8日 30文章0开放获取ADEFGHCB0图2. 在iNs中生成13个ASD指标蛋白的组合PPI网络的生成（A）IP-MS实验示例。左：SHANK3IP的免疫印迹，其主要亚型由方框和星号标记；L，梯度；IN，输入；FT，流经；IP，免疫沉淀；IgG，IgG对照；H + LIgG，重链和轻链IgG。分子量以千道尔顿为单位。右：IP-MS重复之间的log 2  fold change（FC）相关性。 （B）SHANK3IP-MS实验的火山图，显示SHANK3为红色，其显著的相互作用蛋白（log 2  FC > 0和FDR  %0.1）为绿色，非相互作用蛋白为蓝色；在实验中鉴定为相互作用蛋白或非相互作用蛋白的已知InWeb相互作用蛋白分别用黄色或白色突出显示。统计数据来自两个重复使用双侧单样本修正t检验。（C）从26个IP-MS实验中得到的PPInetwork。节点代表指标蛋白（红色）及其相互作用蛋白（紫色）；颜色强度和相互作用蛋白节点的大小与相互作用频率（即，与多个指标蛋白相关联的数量）成比例。边表示观察到的相互作用，已知的InWeb相互作用用蓝色突出显示。 （D）网络中相互作用频率的分布。 （E）网络中InWeb与新报道的相互作用的分布。（F）在进行前向或反向IP后进行western blotting（IP-WB）的相互作用的复制率。（G）iN与脑IP中SCN2A、SHANK3和SYNGAP1相互作用蛋白的重叠。重叠富集p值是使用单尾超几何测试计算的，该测试仅考虑在两种样本类型中都检测到的蛋白。（H）指标基因与它们的相互作用蛋白（Int）、非相互作用蛋白（NonInt）、已知InWeb相互作用蛋白（InWeb）和所有蛋白编码基因（All）之间的成对共表达  Z分数，来自人类背外侧前额叶皮层的空间转录组数据集。31小提琴图中的箱线图和晶须表示四分位距（IQR）和1.5x IQR，双星号表示p <0.05/6（根据六个成对比较进行调整），由双侧Wilcoxon秩和检验计算。每种基因类型包括的基因对数在底部标出。04细胞基因组 3，100250，2023年3月8日0文章0ll0开放获取0然而，在进行本研究时，尚未报道这些相互作用的数量（图2E）。鉴于文献中神经元PPI数据集的数量有限（数据S1），这并不出乎意料，并且表明了与这些相互作用相关的生物学发现的机会。为了支持MS检测到的相互作用的稳健性，我们通过免疫印迹验证了独特的（即只与一个指标蛋白相互作用）和共享的（即与多个指标蛋白相互作用）相互作用蛋白在独立IP中的技术重复性（图S4B–S4D;表S5）。总体而言，我们验证了71个相互作用中的65个（91.5%的复制率;图2F，左），根据详细标准0STAR方法。在使用一系列相互作用蛋白作为诱饵进行反向IP时，我们在23个IP中的19个中检测到了原始的指标蛋白（82.6%的复制率;图2F，右，图S5和S6;表S5）。这些结果符合预期的复制率>90%（从用于定义相互作用蛋白的FDR % 0.1阈值），并且与类似实验设计中先前报道的复制率相一致。180PPI网络重现了发生在人脑中的相互作用为了将我们的数据与人脑中的PPI进行比较，我们对已知神经元功能的蛋白质进行了遗体脑匀浆中的IP-MS实验，由于材料有限，我们只对一部分指标蛋白进行了实验（表S2）。平均而言，与iN数据相比，脑IP-MS数据集在复制品之间的log2FC相关性较低（脑和iNIP的平均相关性分别为0.63和0.72）。较低的可重复性可能反映了噪音和人为因素。经过质控后，我们认为SCN2A、SHANK3和SYNGAP1脑IP是高质量的，并将它们与类似的iNIP进行了比较。考虑到脑样本包含多种细胞，而iNs是高度均匀的，我们观察到在两种样本类型中都检测到的蛋白质的log2FC相关性一致（脑与iN IP之间的中位相关性为0.517，而iNIP之间的中位相关性为0.628;图S7A）。此外，42%的脑相互作用蛋白也被确定为iNs中的相互作用蛋白（p = 2.6  3  10 �13;图2G、S7B和S7C）。在整个脑发育过程中（www.brainspan.org），脑和iN衍生的相互作用蛋白在皮层中的基因表达较随机基因更高；在两种样本类型中确定的相互作用蛋白的表达谱与通过外显子测序确定的ASD相关基因相当（图S8A和S8B）。我们还对iN衍生的PPI网络中相互作用蛋白的共表达模式进行了表征，这些数据来自人脑或小鼠脑的四个独立数据集，包括空间转录组学、单细胞RNA测序24（scRNA-seq）或大块RNA测序（www.brainspan.org）（图2H和S8C）。一般来说，指标蛋白与其相互作用蛋白相比，与iNs中IP-MS检测到的非相互作用蛋白、InWeb相互作用蛋白（主要来自非神经元环境）和所有蛋白编码基因相比，具有更高的共表达。因此，脑匀浆中的IP-MS数据和脑共表达分析都表明，我们捕获了在人脑中复杂组织中发现的基因关系。0PPI网络暗示了ASD中的2/3皮层兴奋性神经元我们通过计算PPI网络与GTEx组织特异性基因34的重叠富集来评估PPI网络的组织特异性0与基因组的其余部分相比。该网络显示出在中枢神经系统（CNS）和其他几个组织类别中（图3A和表S6）显著富集（p<0.05/53，调整为53种组织）。相比之下，类似的In-Web网络在中枢神经系统（图S8D）中显示出的富集较不明显。当使用特定脑区基因重复时，该网络在额叶皮层（图3B;表S6）中富集最多（p<0.05/13，调整为13个脑区）。此外，我们进行了SynGO35基因集分析，确认该网络富集了参与突触生物学过程的基因（图S8E;表S6）。为了将网络与ASD中涉及的特定细胞类型联系起来，我们将我们的数据与一项scRNA-seq研究24相结合，该研究测量了ASD患者与对照组的遗体皮层中的基因表达，并确定了17种注释的细胞类型中组织差异表达的基因（DEGs）。首先，为了测试网络是否富集了每种细胞类型中常表达的基因（即在>50%的细胞中表达），我们进行了全局分析，将网络基因与基因组中的其他基因进行比较，以及条件分析，将网络基因与其他iN表达的基因进行比较（即在IP-MS中检测到的非相互作用蛋白）。在这两种分析中，网络在几种神经元细胞类型中显示出显著富集（p<0.05/17，调整为17种细胞类型），包括兴奋性神经元和抑制性内源性神经元（图3C和S9A;表S6）。接下来，我们测试了网络在其与ASD患者相比的细胞类型特异性DEGs方面的富集。在全局分析中，网络在几种细胞类型中显示出富集，包括兴奋性神经元、抑制性内源性神经元、星形胶质细胞和微胶质细胞（图S9B;0表S6）。在更保守的条件分析中，第2/3层兴奋性神经元成为唯一显著的细胞类型（p <0.05/17；图3D；表S6）。这种富集信号主要受到在ASD患者中上调的DEGs的驱动（图S9C和S9D；表S6）。综上所述，这些结果表明PPI网络捕获了ASD相关组织和细胞类型中的生化扰动和途径，并特别指出第2/3层兴奋性神经元是ASD的关键细胞类型。0解剖成熟神经元中巨型ANK2和PTEN的细胞特异性PPIs为了说明我们网络中许多PPIs反映了ASD指标蛋白的神经元特异性功能，我们进一步解剖了ANK2和PTEN的观察到的相互作用。巨型ANK2是ANK2的神经元特异性可变剪接变体。29，36该亚型由于包含外显子37（巨型外显子）而与规范ANK2有所区别，该外显子编码9,240个氨基酸，包含了在患有自闭症的个体中鉴定的大多数ANK2突变（图4A）。虽然我们在技术上验证了许多已鉴定的ANK2相互作用蛋白（图4B和S10A；表S5），但它们可能是所有ANK2亚型的相互作用蛋白的混合。因此，为了专门关注0细胞基因组学 3，100250，2023年3月8日50文章0ll0开放获取DC0与ASD相关的巨型ANK2亚型，我们建立了一种选择性丧失巨型ANK2的体外模型，使用CRISPR-Cas9基因编辑（图4C）。我们编辑了一个iPSC系列（iPS3，STAR方法），排除了外显子37的保留，这将巨型ANK2与规范（短）ANK2亚型区分开来（图4D，顶部）。经过充分表征的巨型ANK2敲除（KO）iPSCs（图4D，底部）是可行的，但在神经元分化过程中显示出形态缺陷、ANK2分布缺陷和高细胞死亡。由于高细胞死亡，我们无法收集到足够的巨型ANK2 KOiNs进行IP-MS。尽管如此，我们进行了免疫印迹0在KOiNs中进行分析，以测试ANK2与相应的WT神经元中IP-MS鉴定的ANK2相互作用蛋白的存在。KOiNs仍然表达对神经生理和突触功能至关重要的蛋白质，包括钙通道亚单位CACNA2D1 37和补体蛋白C338，但这些蛋白质不再与ANK2相关联（图4E），这表明它们的定位可能依赖于巨型ANK2依赖的细胞骨架结构。我们还在等位基因的WT和巨型ANK2KO神经前体细胞（NPCs）中进行了ANK2的IP-MS实验（图S10B；表S2）。仅在0A0B0图3.ASD蛋白相互作用网络的组织和细胞类型富集（A–D）网络与GTEx组织特异基因34（[A]；每种组织2,408个基因）、GTEx脑区特异基因34（[B]；每种组织2,408个基因）、在后期皮层中>50%细胞中表达的基因24（[C]；括号内为基因计数）以及ASD患者与对照组中每种细胞类型中的DEGs24（[D]；括号内为基因计数）的重叠富集。P值来自单尾超几何检验；对于（A）和（B），全局背景（即GTEx数据中的所有基因）用作检验中的总体；对于（C）和（D），使用条件神经元背景（即IP-MS检测到的iN表达基因）。左右垂直虚线分别表示p < 0.05和p <0.05/组织或细胞类型数量；在（B）-（D）中，通过这些阈值的结果标有重叠基因的数量。AST-FB和AST-PP，纤维状和原浆质星形胶质细胞；OPC，成髓细胞前体细胞；IN-PV、IN-SST、IN-SV2C和IN-VIP，帕尔瓦尔布明、生长抑素、SV2C和VIP抑制性神经元；L2/3和L4，第2/3层和第4层兴奋性神经元；L5/6和L5/6-CC，第5/6层皮质通向投射和皮质间投射神经元；Neu-mat，成熟神经元；Neu-NRGN-I和Neu-NRGN-II，NRGN表达神经元。06 Cell Genomics  3 , 100250, March 8, 20230文章0ll0开放获取0WT细胞（表达经典和巨型ANK2亚型）在基因本体（GO）分析中最丰富的是‘‘谷氨酸能突触’’。相反，KO细胞（缺乏巨型ANK2）特异的相互作用蛋白富集于‘‘微管’’（表S7）。这表明巨型ANK2亚型可能在定位蛋白以形成成熟NPC的细胞突起和引导神经元形态方面发挥作用。因此，对于WT特异ANK2相互作用蛋白之一的ARPC5L（对于成熟神经元的结构和功能成熟至关重要）（图S10B）。我们接下来研究了PTEN和A激酶锚定蛋白AKAP8L之间的强大相互作用，这一相互作用通过免疫印迹和反向IP得到了一致的验证（图5A，5B和S10 C）。AKAP8L被认为参与哺乳动物0雷帕霉素(mTOR)通路，42但在先前的生化研究中尚未与PTEN联系起来（这些研究大多在癌细胞模型中进行）。因此，我们在iNs中的发现表明PTEN存在一个神经元特异的mTOR电路，通过AKAP8L发挥作用。为了验证这一假设，我们通过CRISPR-Cas9基因编辑获得了AKAP8L KOiPSC细胞系（图5C）。我们获得了具有杂合和纯合突变的同源细胞系，纯合KO细胞系中AKAP8L完全丧失（图5D）。有趣的是，与同源WT和杂合细胞系相比，AKAP8L纯合KO细胞系在NPC阶段显示出生长速率增加（p = 0.0287和0.0162，分别；图5E）。尽管AKAP8LKO并未导致iNs中PTEN水平的变化（通过免疫印迹测量），但我们观察到磷酸化核糖体蛋白S6的水平略微增加。0A0D E0C B0图4. 巨型ANK2负责神经元特异性PPIs (A)描绘了ANK2基因，其中包含与自闭症相关的突变，导致剪接缺陷或早期降解。巨型ANK2包括外显子37，该外显子经剪接产生短ANK2。本研究使用的ANK2抗体识别的表位用星号标记。(B) iNs中ANK2的IP-MS实验的火山图，显示ANK2为红色，显著的相互作用蛋白（log2 FC > 0 and FDR %0.1）为绿色，非相互作用蛋白为蓝色；已知的InWeb相互作用蛋白被识别为相互作用蛋白或非相互作用蛋白分别用黄色或白色突出显示；通过免疫印迹验证的相互作用蛋白用橙色突出显示。统计数据来自两次重复实验，使用双侧一样本修正的t检验进行分析。(C) 鉴定巨型ANK2特异性PPIs的实验工作流程。(D)上图：通过CRISPR-Cas9编辑策略生成仅表达短ANK2亚型的细胞系，通过删除巨型ANK2外显子剪接受体获得。下图：验证巨型ANK2 KO细胞系。通过基因组DNAPCR验证了缺失位点（左图），通过免疫印迹（右图）显示在纯合KO iNs（�/�）中巨型ANK2亚型的缺失，与WT（+/+）和杂合KO（�/�）细胞相比。巨型和经典ANK2亚型用星号标记。(E)WT和巨型ANK2 KO iNs中ANK2IP上的C3和CACNA2D1免疫印迹。FC是IP和IN泳道中检测到的带强度比的计算结果。L，梯度；IN，输入；IP，免疫沉淀。分子量以千道尔顿为单位。IN泳道中加载了50微克总裂解物，IP泳道中加载了总免疫沉淀物的10%。0Cell Genomics  3 , 100250, March 8, 2023 70文章0ll0开放获取ADEFCBll0检测到磷酸化核糖体蛋白S6水平的增加（图5F）。这是mTOR通路过度活化的标志，表明PTEN信号级联中AKAP8L介导的缺陷在ASD中。此外，我们检测到WT与KO细胞中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT的水平相似，这表明AKAP8L作用于mTORC1而不是mTORC2通路。这些结果支持了神经元PTEN-mTOR电路，其中包括AKAP8L，并且暗示PTEN-AKAP8L相互作用影响下游mTORC1信号传导和细胞增殖，而不直接影响PTEN蛋白水平（图S10C和S10D）。我们对巨型ANK2和PTEN相互作用的研究展示了利用细胞类型特异性PPIs来获得ASD相关分子级联的机械性见解的潜力。0网络融合涉及IGF2BP1-3复合物在与ASD相关的调控回路中的作用。由于蛋白相互作用网络包含与多个指标蛋白相关的相互作用物（图2C和2D；表S3），我们假设网络中的汇聚信号可能指向与ASD相关的生物主题。通过根据它们与指标蛋白相互作用的数量对相互作用物进行降序排列（表S3），三种类胰岛素生长因子2mRNA结合蛋白，IGF2BP1、IGF2BP3和IGF2BP2，在顶级相互作用物中脱颖而出。这些蛋白共同形成N6-甲基腺苷（m6A）阅读复合物，广泛参与转录后调控，影响mRNA稳定性和翻译。因此，我们测试了该复合物是否参与了将ASD相关基因的转录与我们确定的蛋白网络连接起来的调控回路。我们发现，在HEK细胞中，IGF2BP1-3的RNA靶向物显著富集了通过外显子测序鉴定的ASD相关基因（p = 3.9  3  10 �10；图6A；表S8），包括本研究中的九个指标基因。使用ASD全基因组关联研究（GWAS）数据45和MAGMA46进行的遗传富集分析还发现IGF2BP1-3的靶向物富集了与ASD相关的常见变异（p = 1.4  3  10 �3；图6B；表S8）。接下来，我们进行了条件富集分析，以测试我们的综合网络和指标蛋白特异亚网络中的基因是否与IGF2BP1-3的靶向物相比非相互作用物富集（图6C；表S8）。在Bonferroni校正的显著性阈值下（p < 0.05/56，调整了14个网络和四个IGF2BP靶向物列表），综合和DYRK1A网络都显示出显著富集（p =1.7  3  10 � 17和7.6  3  10 �9，分别）。DYRK1A是由位于21号染色体唐氏综合征关键区域的基因编码的广泛表达的蛋白激酶，与唐氏综合征和ASD患者的学习障碍相关。它还被认为参与了与大脑发育和功能有关的细胞过程的转录后调控。鉴于我们观察到的IGF2BP1-3靶向物与DYRK1A网络之间的富集重叠，我们假设DYRK1A可能是与ASD相关的反馈回路的一部分，作用于IGF2BP1-3复合物的上游。因此，我们验证了这些相互作用0物是涉及调节ASD相关基因的转录的0图5. 神经元PTEN-AKAP8L相互作用调节细胞增殖（A）iNs中PTEN的IP-MS实验的火山图，显示PTEN为红色，显著的相互作用物（log 2  FC > 0和FDR  %0.1）为绿色，非相互作用物为蓝色；AKAP8L标记为橙色。统计数据来自使用双侧单样本修正的t检验的两次重复。 （B）PTENIP上的AKAP8L免疫印迹。AKAP8L用星号标记，IgG重链标记在右侧；L，梯度；IN，输入；FT，流过；IP，免疫沉淀；IgG，IgG对照。分子量以千道尔顿为单位。（C）CRISPR-Cas9编辑策略的示意图，用于生成AKAP8L KO iPSC系。 （D）使用（C）中的策略生成的AKAP8L杂合（+/ � ）和纯合（ � / �）KO系的免疫印迹验证。B-actin用作加载对照。分子量（kDa）标在每个印迹的侧面。 （E）在相同密度下播种细胞后4天，WT（+/+）、AKAP8L杂合KO（+/ � ）和AKAP8L纯合KO（� / � ）神经前体细胞的生长。误差条表示三个生物学重复的平均标准偏差。星号表示使用双侧t检验计算的p < 0.05。 （F）WT和AKAP8L纯合KOiNs中PTEN、磷酸化S6（P-S6）、S6和AKT的免疫印迹分析。分子量（kDa）标在每个印迹的侧面，B-actin用作加载对照。FC被计算为在AKAP8L KO（ � / �）与WT（+/+）通道中检测到的条带强度的比率。08细胞基因组学3，100250，2023年3月8日0文章0开放获取ADEFCBll0图6.IGF2BP1-3复合物与ASD相关转录本和蛋白质相互作用（A）使用单尾超几何测试计算IGF2BP1-3的RNA靶基因和ASD相关基因的重叠富集（括号中为靶基因计数），并使用外显子测序数据中FDR  %  0.1。IGF2BP1-3表示联合靶基因列表。垂直虚线表示p < 0.05/4（调整为四个靶基因列表）。重叠中的基因数显示在每个条形图的右侧。（B）使用ASDGWAS数据45和MAGMA推导的IGF2BP1-3靶基因的常见变异富集。垂直虚线表示p <0.05/4。富集系数显示在每个条形图的右侧。（C）使用单尾超几何测试计算IGF2BP1-3靶基因与ASD蛋白质相互作用网络或指数蛋白质特异子网络的重叠富集（与非相互作用蛋白质相比）。在热图中，与p < 0.05（*）或p <0.05/4（**）的重叠中的基因数标记在上面。任何包含IGF2BPs的网络在x轴上用蓝色突出显示。（D）iNs中DYRK1A的IP-MS实验的火山图，红色表示DYRK1A，绿色表示显著的相互作用蛋白（log 2  FC > 0且FDR  %  0.1），蓝色表示非相互作用蛋白；IGF2BP1-3通过westernblot技术复制，用橙色标记。统计数据来自两次重复使用双尾一样本修正的t检验。（E）DYRK1A IP上的免疫印迹，添加25U苯甲酸酶和不添加的对比。星号标记了每个蛋白的预期带（右侧命名）。L，梯子；IN，输入；IP，免疫沉淀；IgG，IgG对照。分子量以千道尔顿为单位。（F）在iPSCs中DYRK1AsiRNA介导的敲低48小时后显示的蛋白水平。B-actin用作加载对照。FC是在三个生物学重复中计算的DYRK1A敲低（KD）与WT通道中检测到的带的强度比率。0细胞基因组学 3，100250，2023年3月8日90文章0开放获取ll0通过IP-MS鉴定的DYRK1A和IGF2BP1-3之间的相互作用不是通过核酸介导的（图6E），表明存在直接的调节关系。我们还观察到，在iPSCs中对DYRK1A进行30%的siRNA部分敲低就足以触发IGF2BP1-3的表达增加（图6F）。总的来说，我们的结果表明IGF2BP1-3复合物调节了与ASD相关的转录回路，并且DYRK1A和该复合物之间的相互作用可能是调节多个与ASD相关基因表达的关键。0该网络富集了与ASD和发育障碍相关的稀有变异，为了评估联合PPI网络和指数蛋白质特异子网络是否富集了与ASD相关的基因0与ASD相关的稀有变异关联统计学数据来自外显子测序。在全局分析中，我们测试了网络基因是否与ASD更显著地相关，与基因组中其他蛋白编码基因相比；在条件分析中，我们将网络基因与iNs中检测到的非相互作用蛋白进行了比较。五个网络在全局分析中达到了显著性（p <0.05/14，调整为14个网络）（图S11A），只有联合网络在条件分析中显著（p = 1.1  3  10 � 5；图7A；表S9）。值得注意的是，即使在我们从联合网络中删除了已知的InWeb相互作用蛋白后，条件富集仍然很强（p = 5.5  3  10 � 5；图S11B），这表明这个信号不是由iNs中的背景蛋白组或先前的蛋白质组所驱动的。0A0B0图7.