层流生物电化学系统中阳极生物膜的分层及流式细胞术分析

环境科学与生态技术4（2020）100062原创研究生物电化学层流反应器中阳极生物膜分层的流式细胞术Yuting Guo，Luis F. M.Rosa，Susann Müller，Falk Harnisch*德国莱比锡Permoserstrasse 15，04318亥姆霍兹环境研究中心环境微生物学系我的天啊N F O文章历史记录：接收日期：2020年7月22日接收日期：2020年2020年9月26日接受保留字：微生物电化学技术流式细胞术层流微生物群落电活性微生物A B S T R A C T设计了一个层流生物电化学系统（BES），并以微生物阳极为基准。反应堆架构基于模拟的能量场，产生的结构是3D打印的，并用于BES制造。反应器通道内底物可用性的分层导致生物量分布不均匀，最大生物量主要在初始/中间通道中发现。针对不同的水力停留时间评估阳极性能，同时库仑效率高达100%（还包括来 自 电 解 质的 氢再循环）。阴极），在阳极表面积与体积比为1770 cm 2L-1时，35天后电流密度达到75 mAcm-2这种低电流密度可以清楚地归因于非均质的生物量的分布和微生物群落结构的分层。此外，表明使用流式细胞术对每个通道的反应器微生物组进行时间和空间分辨分析是可行的。©2020作者（S）。出版社：Elsevier B.V.代表中国环境科学学会这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍微生物电化学技术（MET）在环境和工业生物技术中具有巨大的潜力[1]。在设想的应用中，MET用于废水（WW）处理和稳定[2，3]。在初级MET中，微生物阳极允许高度多样化的底物氧化，这些底物可以作为碳源和电子供体。这些底物被电化学活性微生物（EAM）氧化，并且电子通过细胞外电子转移[4，5]（EET）转移到阳极因此，固有EAM的微生物组的代谢允许将废物流转化为电能。用于初级MET（也称为生物电化学系统（BES））的许多不同的反应器类型确实存在[6]。然而，用于WW治疗的BES离全面应用还很远。其中，这可以归因于缺乏标准和可比较的反应器系统，因此对膜或电极材料和结构等组件的基准测试不足[7，8]。因此，不可能完全比较不同研究之间的性能指标，即使是同一类型的过程，*通讯作者。电子邮件 地址：falk. ufz.de（F. Harnisch）。也阻碍了知识驱动的组件和工艺工程开发[9]。所有BES处理WW的核心元件是微生物阳极。在阳极，电极材料和结构以及固有EAM的微生物群落的相互作用是成功的WW处理和电子收获的关键。这种相互作用被证明是高度复杂的，并且取决于非生物参数如底物组成和浓度、反应器和电极设计以及微生物组之间的关系[10e12]。这种复杂的相互作用需要被揭示，以允许未来的知识驱动的BES工程[13，14]。很少有BES允许对反应堆微生物组进行分析，包括反应堆内时间或空间上的生物膜群落[12，15]。通常，在绝大多数研究中，BES性能主要在物理化学水平上进行评估，例如，电流或气体产生、pH、温度和化学需氧量（COD）去除。微生物活性、动态生物膜形成和时间以及局部组成一直是选择性表征的主题[16，17]，而不是主动监测。原位成像无疑提供了一种有前途的选择，但仅限于非侵入性技术，如共焦拉曼显微镜[18]和光学相干断层扫描[19]，或者仅提供有限的微生物识别信息。然而，这一识别对于以下方面至关重要：https://doi.org/10.1016/j.ese.2020.1000622666-4984/©2020作者。由Elsevier B.V.代表中国环境科学学会、哈尔滨工业大学、中国环境科学研究院出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表环境科学与生态技术期刊主页：www.journals.elsevier.com/environmental-science-and-www.example.comY. 郭，L.F.M.Rosa，S.Müller等人环境科学与生态技术4（2020）1000622þ××¼¼¼¼长期操作，特别是对于化学复杂的底物和当底物在反应器系统内的分布不相等时这是大多数放大BES的情况，其中由于电活性生物膜上的高剪切应力，无法实现用于保持反应器中的体基质均匀的必要混合功率[ 20e22]。因此，我们在这里介绍一种电化学层流反应器，其灵感来自用于非生物电化学的反应器[23]，用于培养生物膜电极，该生物膜电极价格低廉，并且可以很容易地定制以允许对微生物群落进行空间分析层流反应器使用有限元建模和随后的3D打印创建。它接种了富集的电化学活性生物膜，并使用乙酸盐作为唯一的碳源进行操作，因为这种方法经常用于研究，例如，开发电极材料或反应器[24e 26]。应用可变流速以设定系统中的营养物梯度，并确定生物膜的乙酸盐去除能力和当前生产效率。用流式细胞仪动态监测微生物群落。它已被证明是一种快速，可靠和可比的工具，并具有与16S rRNA基因分析相似的分辨率[27e31]。在北京谱仪中，应用流式细胞术对微生物组进行表征、定量和评价已被引入，并越来越多地使用[32e35]。除了在生物反应器中的应用外，该技术还应用于大型污水处理厂（WWTP），用于动态群落组装的长期研究，以发现群落控制的扰动相关症状[36]，或用于自动在线监测，其中获得的群落数据用作早期预警工具，以反映/控制饮用水工艺操作[37，38]。本研究旨在分析微生物群落的分层以及微生物与基质之间的相互作用该研究应作为更复杂条件下后续研究这将允许在面对需要创建微生物食物网的复杂基质及其梯度2. 材料和方法2.1. 反应堆设计和制造使用COMSOL Multip hysics（ComsolMultip hysics GmbH，Göttinggen，Germa ny）的CAD界面设计反应器（ SI 图S1A和B ）。使用Ultimaker CURA 程 序 （ Ultimaker 2 ， Geldermalsen ， TheNetherlands）导出并切片CAD几何形状，以使用2.75 mm的聚乳酸（PLA）薄膜（Innofil PLA，BASF 3D Printing Solutions BV，Emmen，The Netherlands）以最高质量设置和100%填充进行3D打印。将 石 墨 板 （ CP-2200® ， CP Handels-GmbH Wachtberg ，Germany）切成200 × 135 2 mm的片并用作电极。为了制备阳极室和阴极室，首先用环氧树脂粘合剂（目录号：886598- 62，ConradElectronic SE，Hirschau，Germany）覆盖每个石墨板的一个表面，以实现气密和液密绝缘。将板的相对表面小心地胶合到3D打印的微流通道组件之一，从而在石墨板的表面处产生连续的微流通道组，其具有通过16个通道分布的170cm2的有效几何电极表面积。带有最终建造的溢流槽反应堆尺寸比例尺的图片可参见SI图S1。将具有5 mm直径和100mm长度的参比电极（Ag/AgCl sat.KCl，SE 11，Xylem Analytics，Meinsberg，Germany）置于通道9（C9）内，使用硅树脂进行绝缘。阳极电位保持在200mV，的参考电极。阳极室和阴极室都通过涂覆阳离子交换膜（FKE-50，批号：M21471301，FuMA-Tech，Ingbert，Germany）小心地组装。用环氧树脂胶（ LoctiteHysol 3430，Henkel，Düsseldorf，Germany）将膜胶合到两侧。 每个腔室具有使用聚乙烯管的入口和出口（ 内 径 ： 1.6mm ， 壁 厚 ： 0.8mm ， Cat. 编 号 ： 9205536 ，Th.Geyer，Renningen，Ger-many）.为了在组装后进行质量控制，对每个反应器进行了测试，以确认阳极室和阴极室之间没有液体连通，并在接种前进行了液密性测试。为了在板上提供均匀的电势分布，每个板使用四个连接件连接，这四个连接件沿着两个长边等距地间隔开。组装过程和反应器如SI图S2所示。2.2.实验装置和操作研究了三个独立的反应器，并在不同的时间终止。反应器在几乎厌氧的条件下运行，因此难以在线采样微生物，因此我们的策略是牺牲反应器的微生物。采样详情如下。所有实验均在35℃下进行。使用两种反应器操作模式：初始7天分批模式，随后是28天连续模式。为了制备接种物，从恒电位控制的生物电化学补料分批反应器中收获稳态阳极生物膜，其中可再现的最大电流密度为600m A cm-2，以苔蛾属植物为主。[32]. (as其他地方[39]。生物膜悬浮在人造废物中-补充有乙酸钠作为唯一碳源（10 mM）的水以及维生素和痕量金属溶液[40]。将光密度调节至OD 6000.02（Ultrospec 1100 pro，Amer-shamBiosciences，Buckinghamshire，UK）。该混合物用作接种物溶液，并在泵入每个反应器的阳极室（每个反应器96 mL）之前用氮气进一步吹扫30 min。此时，固定一份接种物样品（见下文）并储存，以供通过流式细胞仪进行进一步测量[41]。为了开始7天批次，所有三个反应器的阳极室均填充有接种物溶液，阴极室填充有不含碳源和微生物的相同培养基使用气密塞封闭入口 管 和 出 口 使 用 多 通 道 恒 电 位 仪 （ MPG-2 ， Bio-Logic SAS ，Claix，France）控制反应器电化学参数如工作电极（即阳极）和对电极（即阴极）的电势、电流和总电荷以10分钟的间隔记录。在三个反应器在分批培养内实现电流生产的可再现平台后，开始连续模式。在此期间，发生了电活性生物膜的生长，其中Geophyllaspp占主导地位。可以进一步预测[10，32]。据报道，Geophysicspp.范围为6小时至24小时，取决于不同的施加电位[42]或电子受体[43]。因此，在本研究中，首先从第8天和第15天开始应用 24 h的初始水力停留时间（HRT）随后，HRT从第16- 20天（HRT为17h）、第21- 28天（HRT为14 h）和第29- 35天（HRT为12 h）开始降低在第20天，停止反应器1以收获生物膜：小心地将阳极室与阴极室分离，并将每个通道中形成的生物膜小心地刮入单个Eppendorf管中，并重新悬浮于2 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS，组成见SI表S1）中。通过再悬浮后的OD600测量来估计每个通道中的生物质产量（SI图S3所有样品（16个生物膜样品，每个1个出口样品）Y. 郭，L.F.M.Rosa，S.Müller等人环境科学与生态技术4（2020）1000623-××¼×¼×-¼¼反应器）固定并储存在20°C下，直至流式细胞术测量。在第28天，停止反应器2和在第35天，使用上述程序停止反应器3以收获生物膜。在连续操作模式期间，每天测量出口溶液的乙酸盐浓度和pH值 通过HPLC使用HierarchH-柱300 7.7 mm（Agilent Technologies，Inc.CA， USA ） 与 SecurityGuard Cartridge Carbo-H 4 3.0 mm 预 柱（Phenomenex，USA ）和折射率检测器（RID-10A，ShimadzuEuropa GmbH，Duisburg，Germany）。在等度下30 min获得色谱图，其中流动相为0.01 N硫酸，流速为100 mL/min。为0.5 mL min-1。柱温箱温度设定为50℃。在HPLC分析前，将样品在微量离心机（MiniSpin，Eppendorf AG，Wesseling-Berzdorf，Germany）中在室温（RT）下以8000× g离心5min，随后用0.2mm尼龙过滤器过滤。使用便携式pH计（LAQUAtwinpH计，HORIBA Europe GmbH，Oberursel，Germany）测量pH。2.3.计算通过将记录的电流除以阳极几何表面积来计算电流密度[44]：j^i=S（1）而j是电流密度[A m-2]，i是电流[A]，S是每个反应器的阳极几何表面积[m2]，即170 cm2。库仑效率通过比较产生的电子总量（总电荷，Qp）/理论最大电子数（Qth）来确定，理论最大电子数（Q th）由一定时间间隔内的乙酸盐消耗量计算[39]，假设理论最大产率为8 mol电子/mol乙酸盐[45]。CEQP一百（二）QTHQTHF×z×c×Vi（3）MCE是库仑效率，Qp是产生的电子量，Qth是根据乙酸盐消耗计算的理论电子量，F是法拉第2.4.流式细胞术测量和数据分析2.4.1.细胞因子将样品离心（3200g，10 min，4℃）。然后将细胞沉淀物在室温下重悬于4mL的2%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液中30分钟并离心（如前所述）。后除去上清液，将细胞沉淀重悬于4 mL 70%乙醇的Milli-Q水溶液，并在20℃下储存直至染色[30]。PFA和PBS组成和Milli-Q的详细信息水在SI表S1中给出。2.4.2.细胞染色将固定的样品稀释到ImL PBS中并超声处理（超声浴，MerckEurolab，Darmstadt，Germany，35kHz，室温）5分钟，然后离心（如前所述）。然后将细胞沉淀重悬于ImL PBS中，再次超声处理10分钟，并在离心前在ImL PBS中调节至OD7000.035（如前）。最后，将细胞沉淀物重悬于0.5 mL储备液A（透化缓冲液，20 min，RT），离心（如前所述），然后重悬于1 mL储备液B（DAPI染色溶液，过夜，黑暗，RT）中，直至流式细胞术测量[30]。浆料A和浆料B的组成示于SI表S1中。2.4.3.流式细胞术测量染色的样品用CyFlow-Space（Parteec，Görlitz，German y）的原型测量，其配备有355nm激光器（50 mW，Genesis CX 355 -150-STM-OPSLASER-Diode Syst em，Coherent，CA，USA）。激光用于诱导前向散射（FSC，带通滤波器355 nm±5 nm）和侧向散射（SSC，带通滤波器355 nm± 5 nm，触发）信号，并激发DAPI荧光（带通 滤波器455 nm C）。鞘缓冲液为0.22 m过滤Milli-Q水。使用UV微珠[0.5和1.0m m，两种AgrobriteBB羧酸盐微球，（360/407），批号：552744和659681，PolyScience，Niles，Illinois，USA]进行对数标度的仪器校准，并添加至各样品中进行每日稳定性测量。生物标准品[大肠杆菌K12，生长曲线的稳定期（LB培养基中培养16 h），按照所述之前]作为样品测量之前和之后的生物调节进行测量。根据DAPI荧光度（DNA含量）和FSC（细胞大小相关）信息，通过细胞计数法测量DAPI染色样本，作为几何比例的2D点图。对于每个2D点图，在主门内测量250，000个细胞，其排除仪器噪声和0.5mLs-1的微流率下的珠，事件速度低于1000个事件s-1。详细的仪器操作见参考文件[36].2.4.4.统计数据分析使用FlowJo V10（FlowJo，LLC，Oregon，USA）进行细胞计数数据分析和门控模板创建（SI图S4）总体而言，门模板包括20个门，覆盖出现在52个样本中的所有子社区。所有52个细胞计数2D图可在FlowRepository（https：//www.example.comowrepository.org/experiments/2790 ） 上 访问，Repository ID为FR-FCM-Z2 N6。通过使用所有样品的门控信息，使用流式细胞仪群落动态可视化的方法是使用流式细胞仪CyBar工具[31]（ https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytowCyBar.html）。2.5.有限元法2.5.1.几何形状和网格有 限 单 元 法 （ FEM ） 数 值 求 解 程 序 COM SOLMultip hysics（ComsolMultip hysics GmbH，Göttingg en，Germany）用于顺序求解Navier-Stokes （ NS ） 和 稀 释 物 质 传 输 （ TDS ） 偏 微 分 方 程（PDE），以分别估计反应器通道内的速度场以及底物乙酸盐的对流、扩散和反应。对于一个电化学半电池，设置的几何形状表示在SI图S5中。使用默认的“精细“设置完成几何体的基础网格化。这为所选物理NS创建了具有足够大小和数量的静态多面体网格。修改反应表面（通道底部，生物膜生长的地方）附近的网格，使得构建16个平面边界层，其中每个层的高度尺寸的拉伸因子为1.2。网格由910658个元素组成，平均元素质量为0.7404，最小元素质量为0.04372。在SI图S5 B中可以看到补片的可视示例。2.5.2.建模和边界条件NS湍流方程的建模假设液相Y. 郭，L.F.M.Rosa，S.Müller等人环境科学与生态技术4（2020）1000624¼ ¼¼×¼ ×¼¼¼¼以水为介质（r1000 kg m-3，m0.001 Pa s，T293.15 K）。所有的壁和内表面（通道壁、电极板和膜）归因于边界条件其假设液体的牛顿行为和这些表面处的液体速度为0 m s-1。系统中的液体湍流被建模为具有入口（通道1的侧“入口”壁），具有层流的边界条件，设置为体积层流速率，该体积层流速率是在破坏性取样之前实验上用于每个反应器的最大层流速率，以及出口，通道16之后的“出口”侧壁，具有压力驱动的流出层流的边界条件，以及对回流的抑制。 为了简化计算任务，计算了第一个稳态研究，用于单独求解每个流速的NS流速。随后使用反应器内的所得速度场（SI图S5 A是反应器2的示例）计算阳极室内乙酸盐的稳态溶质对流、扩散和反应。醋酸盐的扩散系数为1.08910-9 m2 s-1 [46]和初始条件，假设浓度为10 mM乙酸盐。乙酸盐消耗模拟仅发生在通道的底部表面，使用Geetron sulfurreducens的Monod型动力学[47]，Ks为0.03 10 - 3 mol L-1，mmax为0.15 h-1。这里进行了两种类型的模拟：第一种方法，其中总生物量（x）被认为均匀分布在每个反应器的每个通道的表面（SI图S5），和第二种方法（SI图S6），其中应用来自每个反应器的实验测定的OD600的每个通道的生物质（SI图S7）。为了预测这里观察到的不均匀的生物量分布，需要一个超出所应用的Monod型动力学的复杂模型，这是不可用的。3. 结果讨论3.1. 反应堆的物理化学基准进行了初步建模，以预测生长和乙酸盐的消耗。在层流的北京谱仪里。预期该微生物在电极表面占主导地位，并消耗沿着反应器通道的乙酸盐，由于底物耗尽而使更下游的通道生长由此产生的从头算模型证实了这些预期，结果见SI图S5 B。从SI图S5 B可以清楚地看出，在假设的条件下（见上文），通道从入口通道到出口通道逐渐减小乙酸盐几乎被完全消耗，在出口中平均留下残留的ImM乙酸盐。此外，在每个通道内从顶部到底部形成浓度梯度。这是由于乙酸盐在反应器底部（即在阳极处）被均相生物膜消耗。每个反应器内生物质的定量（SI图S7）显示生物膜分布不均匀。在通道2至10中发现最大生物质浓度（取决于反应器停止的时刻）。这可以归因于几个原因：i）反应器意外地暴露于入口和出口附近的大气氧气（由于胶合的意外故障），抑制了EAM的生长，ii）营养物梯度依赖性分层导致异质微生物分布，其中最稳健和丰富的微生物主导初始/中间通道，（3）流速可能选择性地截留某些微生物群落，导致微生物群落分布的异质性。因此，使用实验获得的OD600数据作为输入参数来模拟稳态乙酸盐消耗。这使得能够获得采样时反应器内的乙酸盐浓度曲线（SI图S6）。此外，该生物质取样表明，并非所有可用的阳极区域都覆盖有EAM生物膜，这解释了观察到的低电流密度（见下一节）。3.2.电化学性能接种三个层流BES并以相同方式操作，首先在分批条件下进行7天。在此期间，电流逐渐增加并达到平台（图1），表明阳极上形成生物膜。然后，由于电子供体乙酸盐的耗尽，电流降低。在电流达到零之前，启动连续模式。三个反应器以增加的流速运行（从第8和15天HRT为24小时，从第16和20天HRT为17小时，均以浅绿色标记）。的电流密度达到稳态之间41和57 mAcm-2，乙酸盐去除率平均为94.4± 9.6%。然后停止反应器1并取样用于生物膜收集。反应器2和3进一步以更高的流速（用中间绿色标记，HRT 14 h）操作。电流密度的急剧下降是由于在阳极的进料介质中缺乏微量元素溶液的偶然误差。Fig. 1. 三个反应器随时间推移的电化学性能，其中绿色表示递减的HRT：从第8-15天的HRT 14 24 h和从第16-20天的HRT 14 17 h（浅绿色），从第21-28天的HRT14 14 h（中间绿色），从第29-35天的HRT14 12 h（深绿色）。第一行显示了电流密度（红色曲线，主轴）、乙酸盐去除效率（灰点，副轴）和库仑效率CE（蓝色条，副轴）pH值显示在第二行中，红点是阳极中的pH值，蓝点是阴极中的pH值。Y. 郭，L.F.M.Rosa，S.Müller等人环境科学与生态技术4（2020）1000625¼在用微量元素替换介质后，电流立即恢复并保持在的范围乙酸根去除率达80e100%。随后，停止反应器2并取样用于生物膜收集。反应器3以最高的水力停留时间（HRT）进料（用深绿色标记，最低HRT为12小时）。电流密度一直增加到75 mAcm-2。在第35天停止反应器3以收集生物膜。此时，乙酸盐几乎完全降解（去除有效率为90%）。总的来说，在乙酸盐浓度为10 mM的情况下，电流密度范围在41和75mA cm-2之间，这取决于可变的HRT。在文献中已经报道了更高的电流密度，通过在介质中使用相同浓度的乙酸盐，石墨处的峰值电流密度分别高达250m A cm-2 [39]和600m A cm-2 [32]电流密度值的主要差异可归因于i）ca.在我们的系统中，表面积与体积比（1770 cm2 L-1）比报道的（64.5 cm2 L-1）高27倍[32]，ii）与均匀覆盖生物膜的石墨棒如上所述，在通道2至10中发现最大生物量，并且可用阳极区域的其他通道仅被较少的生物量覆盖，因此也被较少的EAM覆盖。一般来说，CE甚至在大多数时间超过100%，这表明可能存在来自反电极室的氢气气流扩散[48]。阳极室的pH值始终稳定在5.6e 6.5，阴极室的pH值始终稳定在7.7e 10.33.3.微生物群落由于反应器的结构限制，无法对每个通道进行每日生物膜采样。在不同操作点对三个反应器进行间歇取样，对微生物群落的活性随时间和流速/营养梯度变化的反应提供了补充性理解。对获得的样品进行细胞计数分析。每个样品的虚拟细胞聚集在不同的图二、生物膜的细胞计数群落结构的变化通过使用BiowCybar工具（https：//bioconductor.org/packages/release/bioc/html/BiowCyBar. html）。每个通道（y轴）每个门（x轴）的细胞丰度由颜色梯度表示，其中深蓝色对应于每个门的低细胞丰度，红色对应于每个门的高细胞丰度（参见颜色键）。细胞数量在相似方向上变化的门被聚类，并且可以被可视化为A组（G5< $G19< $G11< $G10< $G18< $G4< $G6< $G14< $G1< $G9< $G7< $G13<$G3）和B组（G2< $G8< $G12< $G15< $G16< $G17< $G20）。每个门的相对细胞丰度显示在SI图S8中。Y. 郭，L.F.M.Rosa，S.Müller等人环境科学与生态技术4（2020）1000626þ þþþþ þ þ þ þþþ þ þ þ þ þþþ þ þ þþ×¼根据其固有的光散射和DNA含量的细胞信息来区分亚群落[49]。每当一个新的亚群落出现时，就设置一个门（每个门（G）一个亚群落）.创建具有20个门的最终门模板（SI图S4）并应用于每个样品，以反映群落结构变化并提取每个门的单个细胞丰度[27]。基于每个门和样品提取的细胞丰度，图2给出了群落结构的时空变化的条形码。每个门的细胞丰度变化由颜色梯度指示，其中深蓝色对应于每个门的低细胞丰度，红色对应于每个门的高细胞丰度。根据热图中计算的相似性，使用通过方法“mean“（使用图2中的WowCybar工具）标准化的值，对在相似方向上变化的门进行排序，并且可以可视化为两组：A组（G5 G19 G11 G10 G18G4G6G14G1G9G7G13B组（G2、G8、G12、G15、G16、G17、G20）。总体而言，接种了Geophyllaspp.[32]. 如条形码第一行所示，占主导地位的文化（图 2），产生了一个分类的两个动态的和不同的群体，形成的反应堆内的时间BES操作。平均值超过阈值的20个门中有6个门被认为是优势亚群落（SI图S8），其中2个门来自A组[G4（5.6± 4.4%）G1（9.7± 7.5%）]，4个门来自B组[G2（27.2±7.7%）G8（13.0± 5.1%）G12（9.0± 3.7%）G15(5.9±2.8%）]。通过测定所有样品中所有门控的平均细胞丰度，阈值为4.7%与B组细胞相比，A组的大多数细胞的细胞大小相对较小，DNA含量较低（SI图S4）。它们还显示出较低的细胞丰度，在所有样品中平均为34.3± 17.9% 它们主要生长在入口和出口附近（图）。3），其中反应堆意外暴露于大气中的氧气。在中间通道中，A组的这些细胞被B组的细胞竞争，B组的细胞在这些位置占优势。因此，A组细胞可能对意外暴露于氧气更耐受，当B组细胞下降时，它们生长活跃。B组的整个亚群落几乎在所有通道中都占主导地位（图11）。 3，包括接种物和出口样品），具有平均65.7 ± 17.9%的高细胞丰度，而不管取决于反应器操作的流速是低还是高。因此，B组作为一个健壮和充满活力的亚群落组，可以在广泛的乙酸盐可用性和流速范围内生存，并且肯定对生物量值贡献最大（SI图S7）。可以推断，B组中的那些门极有可能含有地老虎属[35]这是一种在植物中占主导地位的植物。 2和SI图S9）。已知它们可降解浓度高达10 mM的乙酸盐[50]，有效的EAM 地老虎属据报道，它们也能在低氧的地下环境中生存，并能迅速利用缺氧条件的发展[51]。这可以解释在入口和出口的细胞丰度较低，但在中间通道的优势。当观察每个反应器中的绝对生物质产量时（SI图S7），分别在较高的乙酸盐可用性下，在较高的流速下发现总共更多的生物质但生物量的分布是不均匀的，大部分生物量形成于初始/中间通道（例如：C2-10）。这伴随着沿渠道的乙酸盐分层，在开始时具有较高的乙酸盐可用性入口附近的初始通道具有稍微较低的生物质形成，因为其可能已被氧气暴露抑制低得多的生物量被发现附近的出口，由于乙酸消耗以及意外的氧气暴露。A组和B组源自阳极表面上形成的生物膜。为了揭示与当前生产最相关的微生物组，进行了相关性分析。因此，反应器的总装料（x轴）与组的相对生物量（y轴）相关。在表1中，示出了每个反应器中A组和B组的总生物量这两个子集在生物量和总电荷之间表现出良好的一致性（图4），证实了这些基团的生物量与电活性存在内在联系。B组的斜率最高，为1.410-3 OD 600C-1（R 20.95），这表明微生物细胞这个群体是最有效的。当然，必须谨慎对待这种相关性，因为只有三个反应堆被包括在内，需要建立在更广泛的基础上此外，B组作为最丰富的亚群落占主导地位，并在所有渠道的高生物量的贡献4. 结论使用3D打印建立了用于研究BES的层流电化学反应器。反应器使用原型EAM Geophysicspp进行基准测试。结果表明：表1每个反应器中A组和B组的每个反应器的生物量（由悬浮在ImL PBS中的OD600表示），以及每个反应器的产生的电荷（Qp反应器生物量Qp（C）A组1（0至20天）1.66585.22（0至28天）2.19736.83（0至35天）6.118354.1B组1（0至20天）5.86585.22（0至28天）6.49736.83（0至35天）21.018354.1图3.第三章。三 个 反 应 器 中 A 组 和 B 组 的 相对细胞丰度分布。每组的细胞丰度通过对每组中所有亚群落的细胞丰度求和而获得A组和B组分别用灰色和红色标记每个通道的绝对生物量中的细胞丰度分布可见于SI图S7。Y. 郭，L.F.M.Rosa，S.Müller等人环境科学与生态技术4（2020）1000627见图4。（a）。A群生物量与产生电荷（Qp）之间的相关性（b）。B组产生电荷（Qp）与生物量的相关性数据来自表1。i) 使用Monod型动力学模拟的底物分布和消耗表明，在顺流方向以及通道高度中发现的底物乙酸盐的浓度梯度可以与用顺流细胞术有效测量的实验生物量异质性相关联。ii) 在库仑效率高达100%的情况下达到的75mA cm-2的最大电流密度可归因于高得多的阳极表面积与体积比（这里为1770 cm2 L-1），以及阳极表面积的异质生物质覆盖。iii) 电活性微生物群落结构的分层和生物量的不均匀分布不仅受到基质梯度的影响，而且还受到偶然氧气暴露的影响。最强大和丰富的电活性生物体占主导地位的所有渠道，并主要贡献了目前的生产，但生物量主要是在初始/中间通道。在这项研究中的应用，流式细胞术测量提供了更好的洞察微生物群落组成和结构的变化内的层流反应器。使用已建立的生物信息学工具来获得和评估群落数据，揭示了微生物如何在反应器通道中分层。这些信息为旨在提高运行效率的反应堆的新设计提供了指导。在后续研究中，可以使用不同的通道布置，其中仅反应器基座的初始/中间部分需要容纳集电器电极，而其他部分（例如，在入口和出口附近）可以用塑料代替，以降低成本并将电活性物质的生长限制在“最佳点“区域，在该在这种情况下，膜面积和阴极室也因此，与当前生产相关的低生物量区域将被最小化，并且所得的简单通道将更适合于发酵生物体。此外，了解使用更复杂底物的微生物分层，例如我们目前对乳制品行业的WW所做的[35]，将提供选择和观察更广泛的电化学活性和相关微生物以降解复杂有机物的可能性，并允许工程BES。此外，层流反应器可以是微生物电合成的有希望的选择，因为它们将允许进行级联反应，如已经进行的酶促电合成那样在线耦合几个合成步骤[52]。申报相竞利益作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，可能会影响本文报告的工作。确认该研究由德国联邦教育和研究部（BMBF）在ElektroPapier项目下资助（资助编号：03XP0041G）。内容的责任在于作者。这项工作得到了亥姆霍兹协会可再生能源研究计划的附录A. 补充数据本文的补充数据可以在https://doi.org/10.1016/j.ese.2020.100062上找到。引用[1] 联合Schroder ，F. 哈尼施微生物电化学和技术：术语和分类，能源环境。Sci. 8（2015）513 e 519，https://doi.org/10.1039/C4EE03359K。[2] B.E. 洛 根 ， K 。 Rabaey ， Conversion of wastes into bioelectricity andchemicals by using microbial electrochemical technologies ， Science 337（2012）686e 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