宫颈癌中的沉默型和生产型HPV整合

文章宫颈癌中沉默型和生产型HPV整合图形摘要亮点d宫颈癌中的HPV整合显示沉默或生产性整合状态d生产性HPV整合正在筛选中，可能有助于CC病理生理学d有效的HPV整合与肿瘤侵袭性和免疫逃避作者范俊鹏，俞福，彭文举，...，陈刚、丁马、孙朝阳通信cqzl_zdl@163.com（D.Z.），xiabairong@ustc.edu.cn（B.X.），songkun2001226@sdu.edu.cn（K.S.），tjchengang@hust.edu.cn（G.C.），dingma424@126.com（D.M.），suncydoctor@gmail.com（C.S.）简言之使用多组学和单细胞数据，Fan等人全面证明了大规模宫颈癌队列中沉默和生产性HPV整合的特征。他们揭示了生产性HPV整合正在选择中，并与增强的肿瘤侵袭性，免疫逃避和肿瘤进展相关。多维综合分析加深了我们对HPV整合的了解，并有可能为患者管理提供信息。Fan等人，2023，细胞基因组学3，1002112023年1月11日- 2022年作者https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100211会会开放获取文章宫颈癌中沉默型和生产型HPV整合的多组学特征Junpeng Fan，1，13Yu Fu，1，13Wenju Peng，1，13Xiong Li，2，13Yuanming Shen，3，13Ensong Guo，1Funian Lu，1Shengtao Zhou，4Si Liu，1Bin Yang，1Xu Qin，1Dianxing Hu，1Rourou Xiao，1Xi Li，1Siqi Yang，3CunzhongYuan，5，6，7Yao Shu，5，6，7He Huang，8Ting Wan，8Yanan Pi，9Shuxiang Wang，9Wenjuan Chen，10HaixiaWang，10Lin Zhong，10Li Yuan，10Baogang Wen，10Beihua Kong，5，6，7Gordon B.米尔斯，11，12邹东玲，10，*夏百荣，9，* 宋昆，5，6，7，*陈刚，1，*丁马，1，*和朝阳太阳1，14，*1华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科，湖北武汉4300002华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院妇产科，湖北3浙江大学医学院附属妇产医院妇科肿瘤科6山东大学齐鲁医院妇科肿瘤重点实验室，济南250000 7山东大学齐鲁医院妇科肿瘤科，济南250000 8中山大学附属肿瘤医院妇科肿瘤科，广州5100009中国科学技术大学第一附属医院妇科，中国科学技术大学生命科学与医学部，合肥23000010重庆市肿瘤转移转化研究与个体化治疗重点实验室，重庆大学附属肿瘤医院，重庆40410011细胞、发育和癌症生物学系，俄勒冈健康与科学大学，波特兰，OR 97201，美国12Knight Cancer Institute，Portland，OR 97201，USA13、作者贡献相等14引线触点* 通信：cqzl_zdl@163.com（D.Z.），xiabairong@ustc.edu.cn（B.X.），songkun2001226@sdu.edu.cn（K.S.），tjchengang@hust.edu.cn（G.C.），dingma424@126.com（D.M.），suncydoctor@gmail.com（C.S.）https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100211总结由高危型人乳头瘤病毒（HPV）引起的宫颈癌（CC）仍然是全球范围内的重大公共卫生问题。HPV整合位点可以是沉默的或主动转录的，导致病毒-宿主融合转录物的产生在此，我们证明，只有生产性HPV整合位点在病毒和宿主基因组中非随机分布，这表明生产性整合位点正在选择中，可能有助于CC病理生理学。此外，使用大规模多组学（临床、基因组、转录、蛋白质组、磷酸蛋白质组和单细胞）数据，我们证明了具有生产性HPV整合的肿瘤与更高的E6/E7蛋白以及增强的肿瘤侵袭性和免疫逃避相关重要的是，从原位癌到晚期疾病，生产性HPV整合增加。这项研究提高了我们对HPV融合转录物对HPV驱动的CC的生物学和病理生理学的功能后果的理解，表明生产性HPV整合应作为进展为侵袭性癌症的高风险指标进行评估介绍宫颈癌（CC）是由高危型人乳头瘤病毒（HPV）引起的女性生殖系统第二大常见1虽然随着预防性疫苗接种和第一次筛查策略的成功实施，在世界各国，2CC仍然是一个重大的公共卫生问题，特别是在获得高质量医疗保健机会有限的低收入国家。3HPV整合到宿主基因组中是宫颈癌发生和发展的关键病因学事件。据报道，4、5型HPV[6]然而，关于非随机积分在以下方面的潜在作用，存在相互矛盾的结果：CellGenomics 3，100211，January 11，2023？2022作者。1这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。会开放获取文章2Cell Genomics3，100211，2023图1.HPV在基因组和转录水平上的整合特征(A)98例宫颈癌中HPV基因组和转录整合在人类基因组中的分布外圈代表人类基因组，染色体标记为1中间和内圈代表基因组（DNA）和转录（RNA）HPV整合在整个人类基因组中的分布将人类基因组分成500 kb箱，并对每个箱中具有整合位点的样品的数量进行计数，并将其着色为红色（DNA）或蓝色（RNA）。标记最接近整合位点的重复性蛋白质编码基因（B和C）生产性（B）和沉默型（C）HPV整合的代表性图（上）HPV基因组区域由基因着色（中间）HPV基因组的读取深度图中的碱基是支持HPV DNA整合位点的嵌合序列，并按来源着色（HPV为红色，人为蓝色）。（底部）来源于RNA测序（RNA-seq）的HPV-人融合转录物的读取深度。HPV的读取深度为红色，人类的读取深度为蓝色。HPV和人的基因组整合位点的基因座由红线连接人类基因组上基因组和转录整合位点之间的间隙是橙色的。(D)样本内RNA融合位点与其邻近DNA断裂点之间间隙的累积分布图（E和F）在沉默和生产性HPV整合中，HPV 16基因组（E）和人基因组（F）的各个区域中观察到的和预期的断裂点百分比的比较通过随机选择HPV基因组中的断点计算指定HPV区域的预期值通过双侧卡方检验计算p值。CFS，共同脆性位点; Alu，Alu元件; ERV 1，内源性逆转录病毒序列1; rRNA，核糖体RNA。(G) 来自生产性或沉默型HPV整合位点的PCR的支持性读数的密度图。(H) 样本内DNA和RNA HPV整合事件的比较。HPV整合事件是通过将每个样品中500 kb内的整合位点分组而形成的整合位点簇。根据每例患者的积分事件数量对条进行着色。转录活性区域或靠近癌症相关基因。这些矛盾的结果至少部分归因于基因组测序（全基因组测序、HPV捕获测序）、RNA测序（RNA-seq）和分子（基于PCR的MassARRAY测定）方法的不一致结果。此外，HPV整合和融合转录物的产生（生产性整合）是否与CC进展期间的选择性生长优势相关仍不清楚。通过评估106例CC患者中HPV基因组整合的后果，我们证明了HPV整合导致融合转录物表达与CC进展相关。此外，多维综合分析（临床、病理、基因组、转录、蛋白质组学和磷酸蛋白质组学数据）表明，沉默型和生产型HPV整合之间的差异有可能为患者管理提供信息。单细胞RNA-seq（scRNA-seq）显示Cell Genomics3，100211，2023年1月11日3会开放获取文章图2.不同HPV整合对局部转录组和HPV癌蛋白的影响(A) 体细胞拷贝数改变的累积分布曲线对接近生产性或沉默HPV整合位点的基因进行排序(B) 接近生产性或沉默HPV整合位点的基因的体细胞拷贝数的倍数变化。(C) mRNA丰度的累积分布曲线为接近生产性或沉默HPV整合位点的基因排序。(D) 接近生产性或沉默HPV整合位点的基因的mRNA表达的倍数变化。(E) 基于个体患者中最高表达的融合转录物的DNA和RNA断裂点的五种DNA-RNA整合模型的频率。DNA断裂点用红色标记，RNA断裂点用橙色标记。相同颜色的方框代表同一基因的外显子，不同颜色的方框代表不同的基因。(F) 患者MOCC-0015中TP 63基因区HPV整合的d型DNA-RNA整合模型的实例（上）从HPV剪接至TP 63的第14外显子的HPV-人融合转录物的读取深度，其来源于RNA-seq数据。（中）从HPV数据推断的HPV DNA整合模式（底部）患者MOCC-0015中TP 63基因区域的转录读取深度和其他患者中的平均读取深度。(G) 病毒-宿主融合转录物在宿主基因组中断裂点周围的共有基序包括位于断点±12bp内的碱基用于分析。(H) 根据整合位点相对于基因的位置（外显子、内含子或附近），生产性HPV整合位点附近基因mRNA表达的倍数变化（图例接下页）4Cell Genomics3，100211，2023会开放获取文章HPV整合对肿瘤细胞中转录重编程和细胞免疫相互作用的影响的异质性增加了我们对沉默和增殖性HPV整合对CC病理生理学影响的理解。结果沉默和生产性HPV整合与不同的功能后果为了研究HPV整合对CC进展的影响，我们进行了多组学分析，包括高通量HPV捕获测序、全外显子组测序、转录组测序、蛋白质组学和来自98个CC的配对肿瘤和正常邻近组织中的磷酸化蛋白酶。通过scRNA-seq分析另外8个CC肿瘤，以检查HPV整合状态的异质性和对转录重编程的功能影响。在98例CC中，HPV16阳性72例，HPV18阳性6例，HPV阴性2例，其余包括其他病毒株，如HPV58和HPV31。对每名患者进行的详细临床参数和分子测定显示在图S1A和S1B以及表S1中。使用我们的病毒捕获测序（RTN）4技术检测基因组HPV整合，该技术8总共在98个CC中的90个中发现了762个病毒-宿主DNA融合断裂点（表S1）。6例HPV（+）肿瘤未显示HPV整合，2例CC为HPV阴性。基于HPV序列与宿主基因组融合的方向，将基因组HPV整合进一步细分为人-HPV或HPV-人（参见STAR方法和图S1C）。为了研究HPV整合位点在人类基因组中的分布，我们将基因组分成500 kb的箱，并对每个箱中具有整合位点的样品进行计数。由于我们的研究仅在XX名女性中进行，我们发现基因组HPV整合断点广泛分布在除Y染色体之外的所有染色体上（图1A），并且在两个或更多个CC中仅鉴定出21个复发整合区域，包括靠近FHIT（90名患者中的3名）、TP63（90名患者中的2名）和KLF5（90名患者中的2名）的基因组区域，这与我们先前的研究4一致（图1A）。相比之下，RNA-seq数据中融合转录物的评估仅显示388个病毒-宿主RNA融合断裂点，表明并非所有基因组HPV整合位点都被转录。我们随后评估了HPV DNA和RNA整合位点之间的关系。由于RNA剪接，在DNA整合位点和它们的RNA融合断裂点之间存在间隙（图1B和1C）。我们首先评估了RNA整合位点与其最近的整合位点基因组整合位点。有趣的是，大多数RNA整合位点在近端DNA断裂点的40 kb内（图1D），而379个（97.7%）RNA整合位点距其相关基因组位点小于100 kb。因此，如果在同一肿瘤中具有相同整合类型的人基因组中存在距离其相关位点100 kb的RNA整合位点，则DNA整合位点被定义为是有生产性的（参见STAR方法）。总体而言，142个（18.6%）基因组整合位点被定义为生产性DNA整合位点（图S1D）。此外，我们发现，最高度表达的融合转录物（图51E）起始于病毒上游调控区（URR）中的启动子，其产生包括E6/E7基因的融合转录物，其中E1和E2基因通常被破坏（图1B），表明融合转录主要由病毒基因组内的URR驱动我们随后探索了区分生产性和沉默HPV整合位点的基因组特征。首先，沉默断裂点随机分布在病毒基因组中（图1E，右）.相反，生产性整合是非随机的，HPV的E1区的断点有统计学显著增加，E2区有增加的趋势（图1E，左）。这与位于L2区和LCR-E6-E7病毒区的断点的统计学显著降低相关（图1E ，左）。其次，沉默整合位点类似地随机分布在整个人类基因组中（图1F，右）。相比之下，内含子、共同脆性位点（CFS）和Alu区域内的生产性整合断点有统计学显著增加，外显子区域有增加的趋势（图1F，左）。这与位于基因间区域的断裂点的统计学显著减少有关（图1F，左）.沉默整合和生产性整合的随机性的差异可能导致先前与HPV整合的随机性相关的不一致报告。7，9，10此外，生产性整合位点的非随机性与生产性整合位点处于选择性压力下并可能有助于CC病理生理学的论点一致。第三，生产性整合位点比沉默整合位点具有更多的支持DNA整合的读段（图1G）。值得注意的是，总CC群体中的生产性整合位点和沉默 整 合 位 点 的 特 征 性 特 征 在 HPV 16 阳 性 肿 瘤 中 重 现 （ 图S1F）。由于DNA中的病毒序列扩增和RNA中的选择性剪接，因此，我们将相同样品中彼此靠近的HPV整合位点（基于先前的研究相隔500 kb）分组为DNA或RNA“整合事件”有趣的是，虽然近一半的肿瘤有两个或两个以上的DNA整合事件，只有一个HPV RNA整合，(I) 蛋白质丰度的累积分布曲线为接近生产性或沉默HPV整合位点的基因排序。(J) HPV 16阳性患者中HPV 16癌蛋白和指定宿主蛋白的Western印迹（左）和相对定量（右）NAT，正常邻近组织。在（A）、（C）和（I）中，HPV整合位点（40 kb）附近的基因的等级是通过将含有整合位点的样品中的每个基因的相应值与缺乏整合位点的所有其他样品进行排序来确定的使用双侧Kolmogorov-Smirnov检验，通过将曲线与500个随机采样部位（灰色）的曲线进行比较，计算p值，并显示为500次重复的中位数在（B）、（D）和（G）中，通过比较含有整合位点的样品中的基因的相应值与缺乏整合位点的所有其他样品中的相同基因来计算基因（距离整合位点40 kb）的倍数变化如果未指定，则通过双侧Wilcoxon秩和检验计算p值。Cell Genomics3，100211，2023年1月11日5会开放获取文章（图例见下页）6Cell Genomics3，100211，2023会开放获取文章在大多数患者中发现了该事件（图1H），进一步支持了具有生产性整合的宿主细胞的选择此外，有许多样品具有观察到的DNA整合事件，但没有RNA整合事件，支持沉默HPV整合的存在（图1H）。不同HPV整合对局部转录组的影响我们接下来确定了生产性或沉默整合位点是否与焦点基因组结构和基因转录的变化相关。与先前的研究一致，12个DNA拷贝数变异（CNV）增加与HPV整合位点共定位（图2A和2B）。然而，与沉默整合位点相比，产生性整合位点在统计学上更可能与局灶性CNV扩增相关（图2A和2B）。引人注目的是，使用40 kb区域，生产性而非沉默的HPV整合与宿主基因表达的增加相关（图2C和2D）。多聚腺苷酸化对于mRNA稳定性和翻译效率是重要的。E1或E2区的破坏（图1E）使得病毒早期多聚腺苷酸化信号（PAS）不能用于病毒E6/E7双顺反子转录物的多聚腺苷酸化，因此，E6/E7转录物的表达依赖于紧邻插入位点的宿主PAS如图1B和1C所示，融合基因的表达受病毒URR的控制，14并且病毒和宿主之间的可变剪接通过劫持宿主30剪接位点和宿主RNAPAS而有助于病毒-宿主融合转录物的形成（图1B和1C）。因此，我们探索了每个样品中用于生产性表达的DNA和RNA中最高度表达的断裂点的位置，并发现融合RNA的表达可以基于DNA和RNA断裂点是外显子、内含子还是基因间而分为五种模型（图2E）。大多数生产性整合位点在基因间区域中具有DNA和RNA断裂点当RNA断裂点在外显子中时（d型，图2E），外显子中的剪接位点和相应基因的多腺苷酸化位点令人惊讶的是，在基因间区域具有DNA和RNA断裂点的更常见的融合转录物（c型，图2E和2F）表明，功能性多聚腺苷酸-多聚腺苷酸。基因间区域中存在被病毒-宿主融合转录物使用的去甲基化位点（图2E、S2A和S2 B）。我们还发现剪接基序位于病毒-宿主融合转录物的宿主基因组中断点的±12bp内，与编码基因的典型选择性剪接位点相同（图2G）。15引人注目的是，只有RNA断裂点位于外显子区域而不是内含子或位于基因上游或下游40 kb（近）内的情况下，才显示转录水平增加（图2H）。然而，即使对于在外显子区域具有RNA断裂点的融合转录物，所得转录物也不可能产生内源性宿主蛋白（图2F）。例如，对于患者MOCC-0015，DNA整合位点位于TP 63的第13内含子中，相应的RNA融合整合位点位于第14外显子中，基于可变剪接位点（图2F，中间）.因此，病毒-宿主融合转录物经历与基因TP 63的第14外显子的选择性RNA剪接（图2F，顶部）。重要的是，与在相同基因组区域中没有HPV整合的样品相比，只有包括第14外显子的融合转录物显著增加，而在DNA整合位点上游的第13外显子的转录中没有可检测到的增加（图2F，底部）.此外，在具有c型整合的肿瘤中，生产性HPV整合诱导异常的病毒-宿主融合转录物（图S2A和S2 B）。值得注意的是，这些基因间区域在缺乏整合断点的所有其他肿瘤中通常是转录沉默的（图S2A和S2B，底部）。此外，通过分析质谱蛋白质组学数据，与在相同基因组区域中没有HPV整合的肿瘤相比，在具有生产性整合的病例中没有发现宿主蛋白质（距离整合位点40 kb）水平的显著变化（图2I和S2C）。总之，似乎生产性整合导致不产生内源性人蛋白的异常病毒-宿主融合转录物。这与先前的研究一致，表明病毒整合通常不会导致正常宿主转录物的产生，因此不会导致来自整合位点或附近基因的蛋白质的产生16HPV癌蛋白表达与不同整合模式的关系如上所述，CC肿瘤可分为三种类型：非整合型（未检测到整合位点）、生产性整合型（至少一种生产性DNA或RNA整合图3.多组学表征显示HPV整合和非整合宫颈癌之间的差异(A) 转录组和蛋白质组数据中富集项的标准化富集评分（NES）散点图。红点代表显著富集（|NES|> 1.5，p <0.05），转录组和蛋白质组中GO生物学过程（GOBP）术语。针对Benjamini-Hochberg程序调整p值(B) 转录组（顶部）和蛋白质组数据（底部）中来自分子特征数据库（MSigDB）的显著富集术语的富集图。针对Benjamini-Hochberg程序调整p值。(C) xCell推断的免疫细胞图条表示标准偏差（SD），黑点表示平均值。通过双侧Wilcoxon秩和检验得出p值*p 0.05，**p 0.01。(D) 所示蛋白质途径评分的箱形图方框表示SD，粗水平线表示平均值。通过双侧Wilcoxon秩和检验得出p值(E) HPV整合和非整合CC之间显著差异表达分子特征的热图。注释到途径的分子特征显示在右侧。(F) HPV整合和非整合的CC之间在mRNA（y轴）和蛋白质水平（x轴）上差异表达基因的散点图红点代表来自转录组和蛋白质组的显著差异表达的基因蓝线表示交叉组学相关性的线性拟合通过Spearman相关性计算rCell Genomics3，100211，2023年1月11日7会开放获取文章图4.多组学表征显示了生产性和沉默性整合型宫颈癌之间的差异(A) 在不同临床阶段的宫颈癌中，沉默或生产性HPV整合状态的百分比（左）。森林图描绘了通过多元线性回归分析的临床特征和HPV整合状态红点和绿点分别表示有利于生产性或沉默型HPV整合的临床特征（右）。（图例接下页）8Cell Genomics3，100211，2023会开放获取文章位 点 ） 和 沉 默 整 合 （ 无 RNA 整 合 位 点 的 DNA 整 合 ） （ 图S2D）。值得注意的是，HPV A7进化枝更可能与生产性HPV整合相关，证实了先前的观察结果，即HPV 18与融合转录物的产生强烈相关（图S2D）。[12]有趣的是，与非整合或沉默的肿瘤相比，生产性整合的肿瘤具有较低水平的E1、E2、E4和E5转录物出乎意料的是，E6和E7转录物在整合类型中相似（图S2E）。E6/E7转录物可以来源于非整合的HPV或整合的HPV融合转录物。与所报道的病毒-细胞嵌合转录物的稳定性高于来自病毒DNA的转录物相一致，16我们发现，如蛋白质印迹法所检测到的，E6，尤其是E7蛋白在增殖性整合肿瘤中显著高于沉默整合或非整合肿瘤（图2J）。p53和RB蛋白，E6和E7的目标，分别是较低的生产整合CC。此外，E6剪接的百分比在生产性整合肿瘤中明显高于沉默整合或非整合肿瘤（图S2F）。多组学表征表明HPV整合和非整合CC之间的差异HPV整合到宿主DNA中被认为是重要的，但不是CC发展的先决条件。5，17与这一概念一致，我们在队列中发现了8个非整合性CC。为了确定HPV整合和非整合CC是否具有不同的分子特征，我们使用转录组学和蛋白质组学数据进行了基因集富集分析（GSEA）。使用mRNA和蛋白质组数据的GSEA结果具有良好的相关性（92%的显著富集项目匹配）。使用蛋白质和转录组数据进行的功能推断都集中在与整合型肿瘤相比的非整合型肿瘤中细胞外基质（ECM）（细胞粘附、细胞发育和形态发生术语）和上皮-间质转化（EMT）的生物网络上（图3A、3B和S3与非整合性肿瘤相比，整合性肿瘤中可被HPVE6和E7失调的增殖相关过程（细胞周期、DNA复制、E2 F1信号传导）升高（图3A、3B和S3与未整合的肿瘤相比，HPV整合的肿瘤还具有显著的免疫应答相关过程（T和B细胞介导的免疫和干扰素相关途径）（图3A、3B和S3这得到了转录数据的xCell18细胞类型特异性去卷积的支持，其证明了具有较低免疫评分、T细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞（pDC）细胞的非整合肿瘤，表明非整合肿瘤更可能是免疫与这些观察结果一致，蛋白质途径评分分析19表明Hippo/YAP 1和Wnt/b-连环蛋白途径活性与抗病毒免疫缺陷相关，20在未整合的CC中升高（图3D）。值得注意的是，整合和非整合肿瘤中的差异途径数据在个体基因水平得到证实，这在转录组学、蛋白质组学和磷酸蛋白质组学数据中也高度一致（图3E和3F）。它们之间的差异也可以在HPV 16阳性肿瘤中重现（图S4总的来说，非整合型CC显示出不同的转录和蛋白质组表达谱和模式，支持了整合型和非整合型HPV肿瘤发生的机制不同的论点。多组学表征表明生产性和沉默整合CC之间的差异为了阐明沉默和生产性整合CC的意义，我们首先将HPV整合状态与临床特征相关联，这表明生产性整合与晚期临床阶段相关（图4A和S5A）。考虑到临床分期是CC的重要预后指标，这进一步支持了生产性整合与更具侵袭性疾病相关的概念。转录组数据的GSEA表明，EMT、增殖（E2 F1信号传导、DNA复制和细胞周期）和ECM相关途径在生产性整合肿瘤中富集，而沉默整合肿瘤表现出免疫相关项（T细胞活化、淋巴细胞分化、B细胞活化）的富集（图4B尽管非整合的和生产性整合的肿瘤都富集了ECM途径特征（图2C和2D），但在生产性整合的肿瘤中上调的ECM基因富集了ECM降解（例如，SERPINH1、MELTF、LAMC2和LAMA 3）、胶原修饰和整联蛋白蛋白（例如，PLOD 1、PLOD 2、ITGA 3、ITGA 6）（图4E），活化改变细胞迁移并促进侵袭。相比之下，非整合肿瘤中的ECM基因特征富集介导细胞粘附和形态发生的蛋白质LAMC 1、AGRN、MCAM、PARVA和NRP2）（图3F）。蛋白质途径评分分析显示，细胞周期、ECM分解和胶原蛋白形成倾向于升高，而BCR和TCR信号传导在生产性整合的肿瘤中比在沉默整合的病例中更低（图S5D），类似于转录组分析。使用转录组学、蛋白质组学和磷酸蛋白质组学为生产性整合肿瘤构建的网络模型指出了与免疫逃避相关的肿瘤内在（EMT，增殖）和肿瘤外在（ECM，胶原）特征，(B) 转录组和蛋白质组数据中富集项的NES散点图 红点代表显著富集（|NES|> 1.5，p <0.05），转录组和蛋白质组数据中的GO BP项。针对Benjamini-Hochberg程序调整p值。(C) 转录组（顶部）和蛋白质组数据（底部）中来自MSigDB的显著富集术语的富集图。针对Benjamini-Hochberg程序调整p值。(D) 生产性和沉默整合肿瘤之间显著差异表达分子特征的热图。注释到途径的分子特征显示在右侧。EMT，上皮间质转化。(E) 在mRNA（y轴）和蛋白质丰度（x轴）水平上，生产性和沉默整合肿瘤之间差异表达基因的散点图红点代表转录组和蛋白质组中显著差异表达的基因。蓝线显示了交叉组学相关性的线性拟合。通过Spearman相关性计算r和p值Cell Genomics3，100211，2023年1月11日9会开放获取文章（图例见下页）10Cell Genomics3，100211，2023会开放获取文章更具侵袭性的肿瘤（图4A和S5E）。重要的是，TCGA数据中样品的生产性和沉默整合基因标签的分析显示，具有生产性整合标签的肿瘤与不良预后相关（图S5F）。此外，肿瘤内在和外在特征在HPV 16阳性肿瘤中重现（图S6scRNA-seq揭示了HPV阴性和沉默以及生产性整合HPV的差异效应为了阐明单细胞分辨率下CC细胞中HPV整合状态和转录特性的肿瘤内异质性质量过滤后（图S7A），保留了多达82，704个细胞（图5A）。注释了九个不同的聚类（参见STAR方法和图5B和S7B），其在所有患者中代表（图5C和5D）。有趣的是，在10，033/20，672（48.5%）上皮细胞中容易检测到HPV转录物（参见STAR方法）其他细胞类型中极低的HPV RNA阳性率可能是由于感染细胞的吞噬作用或Genomics处理步骤期间的污染（图5E、5F和S7C）。我们随后将上皮细胞分成五个细胞簇（图S7D），并使用肌细胞作为正常细胞通过CopyKAT计算每个细胞的CNV。结果揭示了在CC中常见的患者独特的CNV（图5G、S7E和S7 F），其将簇0、2、3和4定义为恶性细胞（图5H和5I）。通过检测HPV转录物和HPV整合融合转录物（参见STAR方法），我们将恶性细胞指定为HPV（-）和沉默和生产性HPV（+）整合细胞（图5J、5 K和S7G）。值得注意的是，在具有配对的批量和scRNA-seq数据的五名患者中，我们在批量和scRNA-seq 数 据 中 发 现 了 一 致 的 HPV RNA 整 合 事 件 （ 图S5H）。有趣的是，5名患者中有4名在scRNA-seq和批量数据中仅检测到一次整合事件，支持克隆扩增可能是由于肿瘤进展期间的阳性选择。仅患者CC 05在scRNA-seq中检测到5个整合事件，在批量数据中检测到2个整合事件，在批量数据中观察到的频繁事件在scRNA-seq数据中容易检测到（图S7H）。接下来，我们研究了不同的HPV状态是否对肿瘤内在特征产生影响。通过使用ssGSEA计算肿瘤内在特征的活性，我们发现EMT、E2F、G2M检查点和DNA修复的富集分数其是HPV癌蛋白驱动的途径，显示出表达水平的连续变化，从HPV（-）肿瘤细胞中的低水平，到沉默HPV（+）细胞中的中等水平，再到生产性HPV（+）整合细胞中的高表达（图5L和S8A）。通过SCENIC27进行的转录因子（TF）分析显示，TFDP2、E2F和TWIST 1（涉及增殖和EMT的TF）在生产性HPV（+）整合细胞中被激活，进一步支持了大量RNA和蛋白质分析的观察结果（图S8B）。干扰素和免疫应答途径在沉默HPV（+）整合细胞中下调，但在生产性HPV（+）整合细胞中增加（图5L）。为了进一步验证从HPV（-）到沉默然后是生产性HPV（+）CC细胞的转录重编程，我们计算了差异基因表达并使用GO功能项进行了GSEA从HPV非整合到沉默和生产性HPV整合的转变与会聚到细胞增殖（mRNA加工、核糖体生物发生、DNA修复、细胞周期）-、EMT-、病毒基因表达-和ECM-相关途径的基因的上调相关（图5M和S8C）。I类和II类人类白细胞抗原（HLA）在HPV阳性细胞中均显著降低，其中I类HLA在生产性HPV （+）整合细胞中最低（图S8D ） 。免 疫 检查 点 配 体（ 包 括CD 276 （B7-H3 ） 和PVR（TIGIT的配体））的表达在沉默和生产性HPV（+）整合细胞中均升高。此外，LGALS 9（TIM-3的配体）、TNFRSF 14（BTLA的配体）和TNFSF 9显示从HPV（-）到沉默然后生产性HPV（+）CC细胞的进行性上调（图S8E）。总体而言，这些结果表明HPV状态调节肿瘤细胞的转录重编程，这可能有助于免疫逃避。HPV状态与宫颈肿瘤细胞-免疫相互作用相关为了检查免疫环境并揭示细胞-细胞相互作用，我们重新聚集免疫细胞以分别鉴定T细胞、自然杀伤（NK）细胞、B细胞和骨髓细胞。这鉴定了七个T细胞亚群、两个NK细胞亚群、四个B细胞亚群（图6A在基质区室中，我们鉴定了三个成纤维细胞亚群，其与公开的基因特征一致（图S9图5.scRNA-seq揭示了HPV阴性和沉默和生产性整合HPV的差异效应(A) 按细胞类型着色的细胞的均匀流形近似和投影（UMAP）图(B) 通过所选典型标志物的表达着色的细胞的UMAP图(C) 按患者着色的细胞的UMAP图。(D) 每种细胞类型在八种生产性HPV整合的宫颈癌中的比例(E) 所有细胞类型中HPV阳性细胞的UMAP图。(F) HPV阳性细胞在所有细胞类型中的比例。(G) 通过核型着色的细胞的UMAP图用复制KAT法推断细胞的核型(H) 子宫颈上皮细胞的UMAP图，用核型染色。(I) 子宫颈上皮细胞中患者的恶性和非恶性细胞的UMAP图（左）和比例（右）。(J) 通过HPV表达着色的恶性细胞的UMAP图。(K) 通过HPV整合着色的恶性细胞的UMAP图。(L) 不同HPV整合状态下恶性细胞中选定标志性途径的单细胞GSEA富集评分热图通过双侧Wilcoxon秩和检验计算p值(M) HPV（+）与HPV（-）以及整合（+）与非整合（-）之间计算的显著富集途径的饼图分布。Cell Genomics3，100211，2023年1月11日11会开放获取文章图6.HPV状态与宫颈肿瘤细胞-免疫相互作用相关(A) 按细胞类型着色的淋巴细胞的UMAP图。(B) 每个肿瘤中淋巴样细胞的细胞类型比例(C) 淋巴样细胞的细胞类型中选定标记基因的表达。(D) 按细胞类型着色的髓样细胞的UMAP图。(E) 每个肿瘤中髓样细胞的细胞类型比例。(F) 选择的标记基因在骨髓细胞的细胞类型中的表达。（图例接下页）12Cell Genomics3，100211，2023会开放获取文章S9F）。所有非上皮细胞类型可以在每个CC肿瘤中以不同的频率被鉴定（图6B和6E）。然后，我们使用CellChat28进行细胞通信分析，以探索恶性肿瘤细胞群和免疫细胞与HPV（-）恶性细胞相比，预测HPV（+）恶性细胞与多个脱落和功能失调的T细胞亚群（CD 4-CXCL13、CD 4-F0 XP 3、CD 8-PDCD 1、CD 8-MKI 67）之间的PVR通讯信号传导增加（图6G和6 H）。PVR在HPV（+）恶性细胞中过表达（图S8E），并且其受体TIGIT主要在⑶ 4-CXCL 13、⑶ 4-F0 XP 3、⑶ 8-PDCD 1和⑶ 8-MKI67 T细胞中表达（图S9G）。已经提出PVR-TIGIT相互作用代表限制适应性和先天免疫的免疫抑制性检查点信号传导。因此，HPV（+）恶性细胞和T细胞之间的PVR-TIGIT信号传导此外，HPV（+）恶性细胞显示出与各种基质细胞的排他性相互作用，包括经由基于腱生蛋白C（TNC）-ITGA 8/ITGB 1和TNC-ITGA 9/ITGB 1轴的TENASCIN途径与CAF-TGFB、成纤维细胞样、肌细胞-ACTA 2和肌细胞-RGS 5簇的通信（图6I、6 J和S9TNC在肿瘤新生血管形成、EMT和转移中起重要作用。29-31此外，癌细胞衍生的TNC可以通过与基质细胞相互作用或直接抑制T细胞活化、增殖和细胞因子产生来协调免疫抑制微环境。29，31此外，胶原活化加速细胞增殖，促进侵袭和转移，抑制免疫应答。因此，增强的TNC和胶原蛋白相互作用可能在CC进展和免疫逃逸中发挥重要作用。宫颈癌前病变HPV基因组整合特征更清楚地了解从癌前病变到晚期CC的分子变化，可以提供更准确的生物标志物，以改进预防和治疗策略。只有一部分HPV整合的早期癌前病变（宫颈上皮内瘤变）会进展为CC。然而，哪些癌前病变进展，哪些不进展仍不清楚。如上所述，与晚期临床CC阶段密切相关的生产性HPV整合是非随机的内含子、CFS、Alu区和外显子区）（图1E-1G）。因此，我们开发了最小绝对收缩和选择算子（Lasso）回归模型，以基于晚期肿瘤中HPV整合的基因组特征来预测生产性HPV整合位点（表S6）。令人印象深刻的是，当计算具有5倍交叉验证的ROC曲线的曲线下面积（AUC）时，模型显示出相当大的准确性（>85%）（图7A）。然后，我们使用来自213个额外的宫颈癌前病变的宫颈阴道样本的巴氏涂片，分析HPV整合状态与HPV数据213例癌前病变中仅26例（12.2%）HPV整合阳性，远低于CC。有趣的是，在26例HPV整合阳性病例中，预测12例（46.2%）病例具有生产性HPV整合，其显著低于不同临床阶段的CC（图7B）。考虑到与生产性HPV整合相关的侵袭性特征，这些具有生产性HPV整合的癌前病变可能具有更高的进展为浸润性癌的风险。讨论在这里，通过比较一组CC中的DNA和RNA整合状态此外，多组学数据显示，具有生产性HPV整合的肿瘤与更高的E6/E7蛋白水平以及增强的肿瘤侵袭性和组织和单细胞水平的免疫增强相关（图7C）。我们的研究提高了对HPV融合转录物对HPV驱动的CC的生物学和病理生理学的功能后果的理解，并支持将生产性HPV整合用作CC进展高风险的指征的潜力。HPV整合是CC癌变过程中的常见事件我们的研究支持，有三种HPV整合模式与不同程度的侵略性和临床阶段，从而，预后相关的CC。最初，病毒基因组以附加体形式存在已经提出抗病毒免疫应答以增强HPV清除，具有对具有HPV整合的细胞的潜在选择初始HPV整合倾向于随机分布在染色体上，其中大多数可能是死端沉默整合，无法产生足够的E6/E7癌蛋白来驱动克隆扩增。偶尔，整合发生在细胞剪接受体和PAS附近，产生具有完整E6/E7和我们归类为生产性的宿主PAS生产性整合不仅通过产生更稳定的病毒-宿主嵌合体，而且通过破坏E2基因和减轻E2介导的E6和E7转录抑制来增强病毒癌基因表达。具有生产性HPV整合的细胞似乎获得选择性优势并驱动肿瘤进展，如整合位点的选择所示。(G) PVR信号通路的细胞间通讯网络概述。显示了细胞间相互作用（左），每个配体-受体对的相对贡献（中），以及基于四个网络中心性测量的每个细胞组的相对重要性（右）(H) 显示PVR-TIGIT信号传导途径的通信网络的分层图。(I) Tenascin信号通路的细胞间通讯网络概述。显示了细胞间相互作用（左）和基于四个网络中心性测量的每个细胞组的相对重要性（右）。(J) 显示TNC-（ITGA 8 + ITGB 1）信号通路的通信网络的分层图。Cell Genomics3，100211，2023年1月11日13会开放获取文章（图例见下页）14Cell Genomics3，100211，2023会开放获取文章与先前的研究一致，证明整合不是宫颈癌发生的基本事件，17我们发现8个肿瘤是非整合的。高E6/E7表达是CC中致癌转化和表型维持所必需的，并且理论上，病毒癌基因E6和E7的附加型表达受到严格调控。6然而，携带纯游离型HPV的非整合样本中的E6和E7mRNA表达水平与整合型HPV的病例相当（图S2D