原代肝细胞去分化过程中非降解泛素化增加的时间整合组学研究

工程6（2020）1302研究医学工程-文章时间整合组学揭示原代肝细胞去分化过程中非降解泛素化增加Zhengyi Jiang#，Zeyu Sun#，Xiaoxi Ouyang#，Yalei Zhao#，Menghao Zhou，Baohong Wang，Qirui Li，Linxiao Fan，Sainan Zhang，Lanjuan Li浙江大学医学院附属第一医院传染病诊疗协同创新中心国家传染病临床研究中心传染病诊疗国家重点实验室，浙江杭州310003阿提奇莱因福奥文章历史记录：2019年12月29日收到2020年2月7日修订2020年2月20日接受2020年6月8日网上发售关键词：泛素化磷酸化蛋白质组蛋白质组去分化原代肝细胞A B S T R A C T原代肝细胞（primary hepatocyte，PHCs）广泛应用于各个领域，但肝脏特异性特征在体外的进行性退化显著限制了其应用。虽然PHCs的转录调控和全细胞蛋白质组（WCP）已被广泛研究，只有少数研究已经解决了翻译后修饰在这一过程中的作用。为了阐明诱导去分化的潜在机制，我们在体外培养0、6、12、24和48 h后对大鼠PHCs的转录组、WCP、泛素组和磷酸化蛋白质组进行了平行定量。我们的数据构成了一个详细的蛋白质组学分析的去分化PHCs，包括2196个蛋白质，2056个泛素化位点，和4932磷酸化肽。我们揭示了在去分化过程中转录组和WCP之间的低相关性。泛素组与相应的WCP的组合分析表明，PHCs的去分化导致非降解性K27泛素化的增加。对改变的磷蛋白的功能分析表明，在铁凋亡中有显著的富集。总共有404种蛋白质同时具有泛素化和磷酸化，被鉴定为参与关键的代谢事件。此外，Ptbp1，Hnrpd，Hnrnpu和Srrm2被鉴定为枢纽基因。总之，我们的数据提供了新的见解蛋白质组动力学在PHC去分化和潜在的目标，以抑制去分化过程。©2020 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍原代肝细胞（PHCs）被认为是评价药物代谢相互作用[1]、嗜肝性感染性疾病建模[2]和肝细胞移植[3]的理想选择。与其他模型相比，如肝细胞系和干细胞衍生的肝细胞样细胞，它们没有代谢能力，PHCs表现得更好[4]。依赖于来自微环境信号的精确时空调节，终末分化的PHCs在体内是功能稳定的，而分离的PHCs在体外短时间内遭受去分化或上皮-间充质转化（EMT），其特征在于形态学变化、基因表达的显著干扰、蛋白质的选择性变异和细胞周期的改变。*通讯作者。电子邮件地址：ljli@zju.edu.cn（L. Li）。#这些作者对这项工作做出了同样的肝功能下降[5在很大程度上，去差异化过程限制了PHCs的长期效用最近，去分化相关机制已部分阐明，包括蛋白激酶B（Akt）、细胞外 调 节 蛋 白 激 酶 1/2 （ ERK 1/2 ） [6] 、 促 分 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶（MAPK）和核因子κ B（NF-κB）[8]信号通路的参与;肝细胞核因子（HNF），如HNF4a和HNF 1;[10][11][12][13][14][15][16][17][18][19][1已经采用了各种策略来试图通过改变细胞内基因的表达或通过改变来自外部周围环境的化合物来维持体外培养中的肝脏特征HNF 4α的过表达、与肝非实质细胞的共培养以及三维（3D）和动态灌注系统的应用先前已被使用[11最近，Xiang等[16]证明了Forskolin（FSK）的组合;转化生长因子b（TGF-b）超家族类型https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.02.0112095-8099/©2020 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志主页：www.elsevier.com/locate/engZ. Jiang et 其他/工程 沪公网安备1303·×··××·×····×··×××6462I受体激活素受体样激酶4（ALK 4）、ALK 5和ALK 7（SB 43）;N-[N-（3，5-二氟苯乙酰基）-L-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯（ DAPT ） ; Wnt 产 生 抑 制 剂 2 （ IWP 2 ） 和 骨 形 态 发 生 蛋 白（BMP）抑制剂LDN 193189可以通过阻断TGF-β途径帮助维持一些肝功能数周。然而，确切的机制尚不清楚，体外整体肝脏特征的稳定维持仍然具有挑战性。值得注意的是，由于信使核糖核酸（mRNA）和蛋白质表达之间的相关性较低，转录组提供的有限见解是不够的[17]。此外，考虑到肝脏中大量的高丰度蛋白质，使用传统的全细胞蛋白质组（WCP）分析难以找到一些低丰度的关键蛋白质。因此，我们推测翻译后修饰（PTM）可能提供更有价值的信息。泛素是一种由76个氨基酸组成的蛋白质，在泛素活化酶（E1）、泛素转移酶（E2）和泛素连接酶（E3）的协同作用下可以与底物结合。泛素化可通过去泛素化酶（DUB）通过从底物中去除泛素修饰来实现[18]。 泛素可以编码几种不同的信号，包括单个位点（单泛素化）、多个位点（多个单泛素化）和泛素链（多泛素化）。泛素的七个内部赖氨酸（K）残基（包括K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63）以及N-末端甲硫氨酸（M1）中的每一个都可以与泛素结合。作为链延伸的受体位点。作为一个动态的多层面的产品技术模型，链结构是链功能的关键决定因素. K48和K11连接通常与26 S蛋白酶体的蛋白质降解相关，而K63和K27连接链与非降解功能相关[19]。不止一项研究揭示了泛素化在细胞分化或去分化过程中的重要作用，PHCs除外通过此外，人CD4+ T细胞分化为T辅助细胞需要泛素修饰[22]。UPS调节剂UBA 1在从诱导多能干细胞（iPSC）分化为运动神经元后明显上调[23]。Lauschke等人对转录组的功能分析。实验，以验证测量的生物可靠性。我们应用标准配对t检验来确定去分化（6、12、24、48 h）和0 h之间是否存在统计学显著性差异。2.2. 原代大鼠肝细胞分离和细胞培养雄性Sprague Dawley大鼠（250-300 g）获自浙江省实验动物中心。将动物圈养在不锈钢笼中，处于12 h黑暗/光照循环下。通过两步酶灌注法分离PHCs，并进行了一些改进[26] 。具体而言，通过4%（w/v）水合氯醛（0.7mL/100 g）腹腔内麻醉大鼠。 用含11 mol L-1乙二胺四乙酸（Sigma-Aldrich，USA）的无钙介质经门静脉原位灌注肝脏，直至血液完全冲洗。然后，在37 °C下将含有0.08%（w/v）分散酶（Gibco，USA）的灌注液加入到灌注装置中，然后加入含有0.05%（w/v）胶原酶IV（Sigma-Aldrich，USA）的灌注介质。两种灌注液交替灌注，直至大鼠肝脏表面出现微小裂纹。然后将肝脏移至含有冷洗涤缓冲液的烧杯中，并用干净的剪刀轻轻切碎。通过Percoll梯度离心（GE Healthcare，Sweden）纯化消化的细胞。在以下实验中仅使用具有高存活力（> 90%）的肝细胞。将PHCs重悬于Williams E培养基（Sigma-Aldrich，USA）中，并以1 × 10 7个细胞/10 cm培养皿的密度接种到胶原-I-包被的平板（BD Dickinson，USA）上。Williams E培养基补充有10%胎牛血清（FBS）（Gibco，USA）、1胰岛素-转铁蛋白-硒（Life Technologies，USA）、0.1 mmol L-1地塞米松（Life Technologies，USA）、1L-谷氨酰胺（Life Technologies，USA）和1青霉素（100单位mL-1）/链霉素（100μ g mL-1）（Sigma-Aldrich，USA）。3小时后，用无FBS培养基替换培养基。2.3. Super-SILAC样品制备将MAC-RH-777、RH-35、HSC-T6和CRHR-7919细胞在补充有10%透析的FBS、13 C15 N -精氨酸（Arg 10）（50 μ g/500mL）和13 C15 N -赖氨酸（Lys 8）（50 μ g/500 mL）（Sigma）的细胞培养物（SILAC）Dulbecco[10]表明在细胞增殖过程中，肝细胞去分化因此，这些发现为推测泛素化在肝细胞去分化中的重要作用提供了依据。至于PTM之间的普遍共调节[24]，泛素化也与磷酸化通信以实现各种细胞活动[19，25]。本研究采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法系统分析了去分化PHCs在5个时间点的时间泛素组和磷酸化蛋白质组，扩展了以往研究的结果，为进一步研究创造新的策略以更好地2. 材料和方法2.1. 实验设计和统计学原理利用HF-X质谱（MS）分析了来自去分化大鼠PHCs和四种细胞系的可溶性蛋白质的WCP、泛素组和磷酸化蛋白质组。在每个指示点分析四个PHCs的Aldrich，USA）。将细胞培养至少六代，直至他们都是有标签的[27]混合等量的重标记裂解物（1：1：1：1），以生成super-SILAC混合物。2.4. 蛋白质提取和消化0 h时的PHCs称为铺板前新鲜分离的肝细胞。在加入裂解缓冲液（1种蛋白酶抑制剂、1种磷酸酶抑制剂、1种PR-619在8 mol L-1尿素中）之前，使用冷的1磷酸盐缓冲盐水（PBS）将指定时间点的PHCs和4个细胞系洗涤两次。 然后在4°C下以11 304 r min-1离心10min以分离不溶性片段。收集离心管中的上清液，并使用BCA蛋白质测定试剂盒（Invitrogen，USA）测定蛋白质浓度。在每个指定时间点，将10 mg蛋白质与1 mg超级SILAC混合。在30 °C下用5 mmol L-1二硫苏糖醇（DTT）还原混合蛋白30min ， 然 后 在 室 温 （ RT ） 下 在 黑 暗 中 用 15mmol L-1 碘 乙 酰 胺（IAA）进行脲基甲基化30 min然后，将裂解物中的8 mol L-1尿素替换为50 mmol L-1碳酸氢铵（ABC），借助Zeba旋转色谱柱（ThermoFisher Scientific，USA）。将所有样品在37°C下消化过夜，并在24小时后用乙酸乙酯（20mL）消化。1304Z. Jiang et 其他/工程 沪公网安备·≤··×····××胰蛋白酶与底物的比例为1：40（w/w）。消化后，用三氟乙酸（TFA）酸化肽，最终浓度为1%（pH 3）。将酸化的肽在1696 rmin-1离心15 min，并使用预处理的C18 Sep-Pak SPE柱（Waters，USA ） 对 上 清 液 进 行 脱 盐 [28] 。 将 脱 盐 的 肽 在 真 空 冻 干 机（LABCONCO，USA）中冻干48小时。2.5. 抗K-e-GG抗体我们在我们的实验中使用PTMScan®泛素残基基（K-e-GG）试剂盒（CST，USA）和PTMScan®所有珠是重悬在20 mmol L-1亚胺酸二甲酯（DMSO）（Sigma，USA），并在室温下孵育30min，同时轻轻翻转。停止的交联反应，的珠是孵育在2 0 0 mmol·L-1乙醇胺（pH8.0）中，4 °C作用2 h。连接后，用1 mL冷1×PBS洗涤珠粒三次。2.6. 泛素化和磷酸化肽将干燥的肽重悬于1 IAP缓冲液（CST，USA）中，并在4 °C下以9420 r min-1离心10分钟以除去不溶物质。将上清液与洗涤过的交联珠在试管中温育2小时.以94 r·min-1离心30 s收集微珠。用1 mL冷的1×IAP缓冲液洗涤珠子三次，加入50μL 0.15%TFA洗脱泛素化肽。通过真空离心将洗脱液完全干燥，然后用于以下步骤。类似地，根据说明书进行基于PTMScan® Phospho-Enrichment IMAC Fe-NTA2.7. 串联质量标签标记富集后，使用串联质量标签（TMT）试剂盒（TMT10plex）标记修饰的肽。将重复样品1的5个时间点的PHCs标记为126、127 N、127C、128 N和128 C;将重复样品2的5个时间点的PHCs标记为129 N、129 C、130 N、130 C和131。使用另一种TMT10plex试剂盒标记重复样品3和重复样品4。用100 mmol·L-1四乙基溴化铵（TEAB）（pH =8.0）溶解多肽，并与81 LTMT标记试剂混合。在室温下反应1小时后，加入5%羟胺并将反应混合物温育15分钟以淬灭反应。将所有样品在新管中合并在一起，并进行短暂离心以除去不溶性物质。将上清液通过自制的C18级尖端脱盐，然后完全干燥2.8. 强阳离子交换层析将标记的肽重悬于80μ L的15%乙腈（ACN）和0.1%TFA溶液中，并通过手工强阳离子交换（SCX）尖端进行分级。用80μ L ACN、80μL 80% ACN和0.1% TFA、80μ L 15%ACN、500 mmol L-1 NH4C2H3O2和0.1% TFA;和80l L 15%ACN和0.1% TFA。在30 ~ 250 mmol L-1 NH 4C2H3O2的15%乙腈溶液中进行一系列洗脱，得到5个组分.分级分离后，将标记的肽脱盐并完全冻干。2.9. LC–MS/MS将冻干的肽溶解于0.1%甲酸（FA）和2%ACN中。通过UltiMate3000分析肽RSLCnano 系 统 （ Thermo Fisher Scientific ， USA ） 连 接 到 QExactive HF-X（Thermo Fisher Scientific，USA）。我们采用400 nL min-1的恒定流速，120 min线性梯度从3%至80%的0.1% FA溶剂缓冲液用于初始响应。使用120 000分辨率、300-1500 m z-1的质量范围和3E 6的自动增益控制（AGC）目标获得 WCP、泛素组和磷酸化蛋白质组的MS光谱在MS2光谱采集期间，我们应用了30000分辨率和更高能量的碰撞诱导解离（HCD）裂解，碰撞能量约为27%此外，我们使用了一个数据依赖的方法，前20名的MS2与AGC目标，得到2E5。分离窗口为1.0m/z。电荷排除设定为低于2和高于7。动态排除设置为30 s。2.10. 数据库搜索通过使用MaxQuant软件（v.1.6.3.4）检索UniProtKB大鼠数据库（2019年4月发布），对肽进行鉴别和定量[26]。氨甲酰甲基（C）是整个搜索过程中的固定修饰。当搜索泛素化位点时，将氧化（M）、乙酰基（蛋白质N端）和GlyGly（K）_10plex_TMT设置为可变修饰。类似地，在寻找磷酸化肽期间，将GlyGly（K）_10plex_TMT替换为以胰蛋白酶作为酶切的特异性，最大遗漏切割位点为2个。我们在离子耐受性的第一次检索中使用20 ppm，在离子耐受性的主要检索中使用4.5ppm。肽鉴定和蛋白质鉴定均以1%的错误发现率（FDR）过滤。泛素化和磷酸化位点均以> 0.9的定位概率被鉴定。除上述参数外，应用MaxQuant的默认参数。MS 蛋 白 质 组 学 数 据 已 通 过 iProX 合 作 伙 伴 存 储 库 存 放 到ProteomeXchangeConsortium[29]数据集标识符为PXD 015897。2.11. 生物信息学分析通过配对t检验确定显著性差异（P值）。显著不同的蛋白质或位点定义为倍数变化（FC）> 1.5，P0.05 vs 0 h。差异明显的蛋白质或位点定义为FC > 1.5，不受P值的限制。基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路分析基于过度表示分析（ORA）在WebGestalt上进行[4]。 认为P0.05的值显著富集。使用WebLogo3分析氨基酸基序富集[30]。使用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络[31]。使用Cytoscape [32]可视化功能性蛋白质相互作用网络。通过cytoHubba鉴定枢纽蛋白，用于对节点进行排名[33]。使用Perseus进行时间聚类分析[34]。2.12. Western blotting使用12%聚丙烯酰胺凝胶分离总共20μg蛋白质，然后转移到硝酸纤维素滤膜（Bio-Rad，USA）上。然后将膜与抗HNF 1α（Cat#：89670 S; 1：2000; CST，USA）、E-钙粘蛋白（Cat#：76055; 1：1000;Abcam，USA）、N-钙粘蛋白（Cat#：98952; 1：1000; Abcam，USA）或波形蛋白（Cat#：92547; 1：1000; Abcam，USA）在4 °C下过夜。在与相应的二抗孵育之前，使用1 μ l洗涤缓冲液将膜洗涤三次。Z. Jiang et 其他/工程 沪公网安备1305××××2.13. 流式细胞术Percoll纯化后，将5 × 106个 PHCs用二氯甲烷洗涤两次。IPBS，然后用4%多聚甲醛固定15分钟。Triton-100用于辅助透化。根据制造商2.14. 免疫荧光将在盖玻片上培养的PHCs用1 PBS洗涤两次，并在室温下在4%多聚甲醛中固定15分钟。然后将肝细胞在室温下用0.5%Triton X-100透化10分钟，并在5%牛血清白蛋白（BSA）中封闭20分钟。Abcam，USA ）或波形蛋白（Cat#：92547; 1：500; Abcam，USA）在4°C过夜，然后用相应的二抗在RT处理1小时。在 观 察 之前 ， 在 室 温 下 用40，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Abcam，USA）将细胞核染色4分钟。2.15. 实时定量聚合酶链反应（qPCR）分析使用Trizol（Sigma-Aldrich，USA）分离总RNA，并使用cDNA第一链合成试剂盒（Roche Applied Science，Germany）逆转录。使用SYBR Green PCR主混合物（Roche Applied Science，Germany）和QuantStudio5 PCR系统（Thermo Fisher Scientific，USA）进行聚合酶链反应（PCR）。引物列于附录A中。2.16. 微阵列分析我们在每个时间点进行三次重复。样品由上海欧意生物技术有限公司进行，有限公司、使用Agilent大鼠微阵列lncRNA V3（860K，设计ID：084409）。在以下分析中包括不仅在所有五个时间点中检测到，而且在相邻时间点之间具有显著差异（P0.05，FC> 1.5）3. 结果3.1. 在体外培养的PHCs中，去分化相关的标记物持续增加分离和纯化后，通过ALB的高表达（附录A中的图1（a）和图S1）和肝窦内皮细胞（vWF）标志物、枯否细胞标志物（CD 163）和肝星状细胞标志物（结蛋白、CK-43、a-SMA）的相对低表达（附录A中的图S2）证实了PHCs。观察到体外单层培养6小时后E-钙粘蛋白表达的明显丧失和24小时后间充质蛋白标志物（包括N-钙粘蛋白和波形蛋白）的显著诱导，类似于先前的报道（图1A和1B）。 1（b）-（g））[7]。相应的mRNA表现出相同的趋势，如附录A中的图S3所示。此外，PHCs失去了它们的肝脏结构，在移植后被成纤维细胞样的形状所取代。72 h，表明细胞结构重塑出现较晚（附录A中图S4总的来说，我们证明了在指定时间点的大鼠PHCs是研究PHC去分化相关机制的良好模型。3.2. TMT和super-SILAC在组学中的联合应用到目前为止，由于泛素化蛋白质的化学计量比很低，所以与泛素组相关的研究需要使用大量的蛋白质-至少10毫克。考虑到每只大鼠只能从分离的PHCs中获得约5mg的蛋白质，因此难以在每个指定的时间点获得足够的细胞。因此，我们决定执行合并策略，以获得足够的材料用于以下研究。我们从总共40只健康的Sprague Dawley大鼠中分离肝细胞，然后将细胞随机分为四个生物学重复。然后，我们在每个指定的时间点从每只大鼠中收集1 mg蛋白质，并将同一时间点属于同一重复的蛋白质合并到一个试管中（图2）。这一策略最终为进一步的研究提供了足够的蛋白质和充足的重复。考虑到免疫沉淀（IP）过程中肽水平的不同效率可能会导致技术差异，我们使用了超级SILAC来实现准确的定量。用重稳定同位素完全标记四种代表性细胞系，包括RH-35、CHRH-7799、HSC-T7和MAD-25，然后以1：1：1：1（w/w）的比例混合，作为内部加标标准品，称为super-SILAC[27]。在以前的文献中，一直使用等量的超级SILAC和样品，但由于这种实质性的要求，这在泛素组中非常难以实现[27]。因此，我们探索了一种新的方法，以尽量减少超级SILAC的消耗。我们的理由是，在TMT标记的帮助下，我们可以一次检测多达10个样品。这种累积效应可以通过累积每个样本中泛素化位点的数量来检测低丰度位点。因此，使用两组TMT10plex作为分组工具，以区分来自四个重复和五个时间点的样品。我们使用1：10的超级SILAC-样品比。理论上，如果需要后续富集处理，蛋白质水平的定量将比肽水平更精确（图2）。最后，在所有四个超级SILAC重复中定量了63个泛素化位点和270个磷酸化位点。这种方法的一个明显缺点是：减少的超级SILAC量伴随着减少的样品覆盖率。为了解决这个问题，我们在总体水平上校正了我们的MS数据，而不是依赖于在样品和超级SILAC中定量的单个蛋白质，或者建立低丰度蛋白质的正态分布[27，35]。具体而言，我们根据以下所示的公式将图1和图2中0 h时的super-SILAC的平均强度定义为参考：样本组1校正系数= 6 h（或12、24、48 h）时重复样本1（或2）的super-SILAC平均强度/0h时重复样本1的super-SILAC平均强度第2组校正系数= 6 h（或12、24、48 h）时重复3（或4）的super-SILAC平均强度/0h时重复3的super-SILAC平均强度为了使数据集具有可比性和随后的整合分析可靠，我们首先进行WCP分析，然后富集泛素化残基和磷酸化残基。将上述校正标准应用于三个组学。因此，我们首次将TMT和super-SILAC结合用于WCP、泛素组和磷酸化蛋白质3.3. 去分化相关WCP许多 靶向肝细 胞去分化 的报告基 于遗传 水平，例 如基因组 和microRNA或蛋白质;然而，研究很少关注PTM[36为了使我们的工作更加可靠和准确，我们决定首先进行深入的WCP分析，原因如下：① 修改后的站点中的异常更改可能由以下原因引起：1306Z. Jiang et 其他/工程 沪公网安备Fig. 1. PHCs在体外经历去分化。(a)流式细胞术鉴定白蛋白分泌细胞转化为PHCs的比例。FL1为对照组（左）和阳性组（右）与来自第一通道的异硫氰酸荧光素（FITC）标记的二抗孵育与阳性组中与抗ALB抗体孵育的PHCs相比，对照组中的PHCs改为与PBS孵育。FLllg（-99.1）代表对照组中99.1%的PHCs不表达ALB。FL11g（+0.93）代表对照组中0.93%的PHCs表达ALB，代表假阳性率。FLllg（FL 11g（+99.9）代表阳性组中99.9%的PHCs表达ALB。（b）免疫荧光显示在指定时间点EMT标志物的变化，包括E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和波形蛋白0 h代表在单层上铺板之前立即从肝脏分离的肝细胞（比例尺，100μ m）。（c）HNF1a和三种EMT标志物的蛋白质水平的免疫印迹分析甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）是显示为加载控制。（* 、** 和 * 分别代表P0.05、0.01和0.001与0 h;误差条代表平均值±标准差。蛋白质含量的变化，而不是PTM的实际变化。②以往研究与我们的研究在样本采集和工作流程上的差异可能会导致以往的蛋白质组学数据与我们的PTM数据不具有可比性。③随着算法和质谱技术的发展，我们可以检测到更多的蛋白质（位点），这可以更全面地了解这一过程。总共，我们鉴定了2196种蛋白质，其中2188种在至少两次重复中定量，其中1928种在所有重复中定量（图1）。 3（a））。 与CliffRowe在2010年的蛋白质组学数据相比[38]，我们的WCP中新定量了1929种蛋白质（图11）。 3（b））。波形蛋白是EMT的标志物[7]，在所有实验中，根据我们的WCP数据，波形蛋白在48 h时显著上调，这与蛋白质印迹和免疫荧光结果一致（图11）。 3（c））。 经super-SILAC校正后，不同时间点蛋白质丰度的成对比较的相关系数范围为0.87 - 0.99（图11）。 3（d））。一般来说，我们进行了可重复的WCP分析，并定量肝细胞去分化过程中的相对蛋白丰度。在随后的实验中，如果可能，我们使用蛋白质丰度的变化校正PTM变化;否则，将未校正的PTM数据集用于进一步分析。为了确定肝细胞去分化过程中蛋白质丰度的变化我们发现，随着体外培养时间的延长，显著不同的蛋白质（阈值FC> 1.5和P <0.05）的数量变得更大，从6 h的35个蛋白质增加到48 h的110个蛋白质（图1）。 S5（a）和附录A表S2）。 GO分析表明，在24h前差异显著的蛋白质主要分布在线粒体中，48 h后主要分布在细胞膜中，生物过程（BP）分析表明氧化还原作用明显富集。KEGG分析说明了肝脏代谢功能的下调，如脂肪酸降解、脂肪酸代谢和碳代谢（图1）。第5条（b）款）。因此，我们的WCP数据有效地捕获了去分化诱导的蛋白质变化。3.4. 肝细胞去分化众所周知，蛋白质丰度是其产生和降解的综合结果为了确定蛋白质的减少（或增加）是否是由更少（或更多）Z. Jiang et 其他/工程 沪公网安备1307图二.蛋白质纯化、胰蛋白酶消化、抗体富集和生物信息学分析的蛋白质组学分析步骤的实验工作流程。 Ub：泛素化; GG：双甘氨酸肽; P：磷酸化修饰; IP：免疫沉淀。mRNA翻译或更多（或更少）的蛋白质降解，我们进行了对应于WCP指定时间点的转录组分析（GSE 138071）在指定时间点的三次重复之间的Pearson相关系数范围超过0.9，表明具有良好的重现性（图1）。 4（a））。通过转录组的非监督主成分分析（PCA），属于同一时间点的肝细胞被分组在一起，24和48 h的样品彼此接近但远离0 h（图4（b））。这一结果令人鼓舞，因为许多因素，包括个体差异和消化时间的长短，从第一只大鼠到第二只大鼠都是不一样的。最后，虽然它们是影响PHCs状态和最终mRNA表达的重要因素因此，它表明去分化特异性因子主导转录组而不是其他因子。转录组数据覆盖了WCP 中定量的1803种（85.5% ）蛋白质（图11）。 4（c））。此外，我们发现在去分化过程中转录组和相应的蛋白质丰度之间的相关性很差（Pearson相关系数在0.02和0.23之间，图4（d））。与显著调节的mRNA相比，93%以上的蛋白质在每个时间点保持不变，并且一些蛋白质的变化方向与其相关的mRNA相反。1308Z. Jiang et 其他/工程 沪公网安备·××图三.去分化相关WCP。(a)文氏图表示每个重复中定量的蛋白质数量及其重叠。(b)我们的数据和外部数据集之间的比较（c）波形蛋白在我们的WCP数据中显著增加（* 表示P0.05）。（d）在指定时间点四次重复之间的皮尔逊相关系数Rep：重复。mRNA（Fig. 附录A中的S6）。ac 1873、纤维蛋白原b链、酪氨酸氨基转移酶和载脂蛋白C-I等4种蛋白在48 h时，载脂蛋白C-I、肌球蛋白轻链1/3、骨骼肌亚型和载脂蛋白E中观察到相同的趋势。另一种蛋白，热休克蛋白90 ATP酶活性激活剂1，表现出上调的mRNA和下调的蛋白丰度在24小时。因此，我们认为PTMs诱导了转录组和去分化WCP3.5. 原发性肝癌去分化过程中的第一个泛素组为了获得泛素组的严格定量，我们首先使用super-SILAC作为参考，如前所述。我们鉴定了2056个二甘氨酸位点，其中1952个以高置信度（定位概率> 0.9）定量，在去分化期间映射到1028个独特蛋白质（Appendix A中的图S7（a））。在1028种泛素修饰的蛋白质中，437种仅通过其双甘氨酸残基鉴定，而其余591种也通过WCP鉴定，这表明双甘氨酸残基的富集有效地揭示了蛋白质的特定子集，否则这些蛋白质可能在WCP分析中未被检测到（图11）。 S7（b））。具有单个双甘氨酸修饰的泛素化蛋白质为61%（6.31 × 10 4），而39%（3.96 × 10 4）含有多个双甘氨酸位点（图1）。 S7（c））。对于核糖体结合蛋白1，每个蛋白质的最大双甘氨酸位点数为31其他含有10个或更多双甘氨酸残基的蛋白质包括热休克蛋白71 kDa（1kDa = 1000 g mol 在泛素化肽的基序序列分析后，我们发现K残基周围没有保守的基序（图1）。 附录A中的S8）。在肽水平上，每个时间点的四个独立重复的相关系数在0.61和0.96之间，证明了可再现的泛素组工作流程（图1）。 S7（d））。与0 h相比，105（58）、139（40）、143（38）和184（49）肽 分 别 在 6 、 12 、 24 和 48 h 显 著 上 调 （ 下 调 ） （ FC> 1.5 ，P0.05），表明体外培养时间越长，变化的数量越多gedubiquitinated sites（Fig. S7（e）. 显著上调的泛素化蛋白的KEGG途径分析在24 h前通过细胞色素P450在糖酵解/代谢异生物质和代谢异生物质中富集在48 h时，显著下调的泛素化蛋白在铁凋亡中富集（附录A中的图S9）。基因本体（GO）-细胞组分（CC）术语表明，显着减少的泛素化蛋白主要位于细胞膜。如果一个蛋白质只被一个独特的泛素化位点修饰，而这个位点又受到显著的调控，那么这个单一的比率就代表了被修饰的蛋白质。对于每个蛋白质的多个泛素化修饰位点，我们计算了“蛋白质水平”的双甘氨酸残基比率，定义为显著变化的每个独特的双甘氨酸位点的平均比率。据此，我们根据基于欧几里得距离的相对表达将显著变化的泛素化蛋白质分为三个簇（图5（a）和附录A中的表S3）。簇1包含138个双甘氨酸蛋白，其从6至48 h立即上调。GO-CC term分析表明，簇1中的泛素化对于GO-分子功能（MF）术语，簇2富含氧化还原酶活性，而簇3与各种转运蛋白活性相关。聚类3的KEGG途径分析发现，这些蛋白质通过细胞色素P450（CYP 450）富集了外源性物质的代谢（附录A中的图S10）。CYP 450约占内源性和外源性代谢的75%，是各种E3连接酶的重要靶标，尤其是在氧化应激期间（图S10）[37，39]。总之，我们在去分化过程中定量了81个定位于23个CYP 450的泛素化位点，其中与0 h相比，映射到19个CYP 450的55个位点发生了变化（附录A中的图S11），其中16个（69.6%）是多聚泛素化的（图S11）。附录A中的S12）。CYP2e1排名第一，在K159、K194、K237、K243、K249、K275、K324、K420、K428和K94处有多达10个改变的泛素化位点（图S11）。已检测到CYP 2 e1的Lys 324残基，但很少观察到对蛋白质转换的明显影响[40，41];因此，该修饰的真正功能需要进一步研究。接下来，我们比较了泛素化的位点和相应的蛋白质丰度来寻找潜在的调控机制。在我们的WCP和泛素组中总共定量了591种蛋白质（图S7（b））。 随着时间的推移，Z. Jiang et 其他/工程 沪公网安备1309图四、在PHC去分化过程中，WCP和转录组之间的相关性较差（a）在每个指定时间点的重复中转录组的Pearson相关性证明了很高的(b)在每个指定时间点对来自三个重复的转录组进行PCA分析。(c)维恩图显示了WCP和转录组之间的重叠。（d）WCP和转录组之间的相关系数来自591个WPC的大多数蛋白质在FC > 1.5的阈值内保持不变（图5（b））。然而，来自591 WCP的大多数泛素化蛋白质显著上调或下调（图5（c）），表明真正的变化发生在泛素化位点的丰度上，而不是泛素化位点的丰度。蛋白质含量。此外，由于在泛素组谱和相应的蛋白质之间没有观察到反向关系，我们推断蛋白酶体降解可能不是泛素修饰的主要命运，而非降解的泛素修饰可能是由蛋白酶体降解引起的。泛素化可能在脱分化转化中起重要作用。为了验证我们的假设，我们分析了在这个过程中泛素链本身的动态变化。除K33外，其他五个典型的泛素链，包括K6，K11，K29，K48和K63，都在我们的数据集中进行了定量。主要在非降解途径中诱导的K27[42]是去分化过程中唯一显著上调的K27，这与我们的假设一致（附录A中的图5（d）和图S131310Z. Jiang et 其他/工程 沪公网安备--图五.去分化调节的泛素组的动力学。(a)重要调控泛素化蛋白的时间序列聚类分析。(b)591种蛋白质中显著调节的蛋白质数量。(c)受调节的泛素化蛋白质与来自图S7（b）的交叉点的相应蛋白质丰度之间的间隙。(d)K27在脱分化过程中显著增加。* 、** 和 * 分别代表P 0.05、0.01和0.001与0 h;误差条代表平均值±标准差。总之，我们评估了去分化过程中泛素化谱的全面动态变化，并首次阐明了非降解的主导作用3.6. 一个大的去分化调节的定量磷酸化库考虑到磷酸化和泛素化的组合是功能结果的共同决定因素，我们基于Fe-次氮基三乙酸（Fe-NTA）富集策略进一步分析了PHC去分化期间磷酸化谱的动态变化[43，44]。总共，我们鉴定了4932个磷酸化位点，其中4496个在至少两次重复中以高置信度定量（定位概率> 0.9），其映射到2295个磷酸蛋白（图11）。附录A第S14（a）节）。与WCP数据相比，在我们的磷酸化蛋白质组学分析中还定量了705（30.7%）种蛋白质，并且仅在磷酸基团富集策略之后检测到1590种低丰度蛋白质（图S14（b））。此外，我们观察到单磷酸化是主要的修饰类型（超过50%）（图S14（c））。磷酸化肽段的Pearson相关系数大于0.5在super-SILAC校正后每个指定时间点的四次重复中，表明可接受的重现性（图 S14（d））。每个蛋白质磷酸化位点的最大数量是来自Ser/Arg重复基质2的 40个，而在PHC去分化期间的指定时间点没有显著调节（附录A中的表S4我们观察到大多数磷酸化位点（4319个或87.57%）位于Ser残基上，而Thr和Tyr残基的磷酸化位点仅占555个（11.25%）和58（1.18%）（图）。 S14（e））。除Tyr磷酸化外，我们观察到定量磷酸化残基周 围高度富集的基序，包括 Ser （xxSPxx）和Thy（xxTPxx）的基序（图S14（f））。与0 h相比，6 h时有29个磷酸化位点显著调节，12、24和48 h时分别增加至31、45和58个位点（图S14（g）和附录A表S5），表明肝细胞去分化过程中不稳定的磷酸化状态增加。在所有显著不同的磷酸化位点中，在所有指定的时间点中仅同时鉴定了髓鞘表达因子2的S422和肌球蛋白调节轻链（RLC）-A1的T19，表明不同的时间点具有独特的磷酸化谱（图6（a））。一个有趣的观察结果是，两种蛋白质同时含有上调和下调的磷酸化位点，包括血影蛋白β链在24h时的T2133（上，log 2 FC = 1.00）和S2111（下，log 2 FC = 1.02）位点，以及紧密连接蛋白2在24 h时的T905（上，log 2 FC = 0.76）和T958（下，log 2 FC = 0.80）位点（图1B）。 6（b）. 在根据欧几里得距离对9