基底刚度与纳米形貌对细胞行为的生物物理调控

工程3（2017）36研究组织工程细胞行为的生物物理调控--基底刚度与纳米形貌的交互杨勇a，*，王凯a，顾晓松b，金伟。Leongc，*a化学和生物医学工程系，西弗吉尼亚大学，Morgantown，WV 26506，USAb江苏省教育部神经再生重点实验室，南通大学神经再生联合创新中心江苏省南通市226001c美国纽约哥伦比亚大学生物医学工程系，NY 10027ARt i clEINf oA b s tRAC t文章历史记录：2017年1月11日收到2017年1月24日修订2017年1月25日接受2017年2月21日在线发布关键词：细胞外基质刚度纳米形貌粘附配体细胞行为细胞外基质（ECM）的硬度和纳米形貌特征影响体内许多发育、生理和病理过程。因此，这些生物物理线索已被应用于调节细胞行为的几乎所有方面，从细胞粘附和扩散到增殖和分化。描述细胞行为的生物物理调节对于新生物材料、植入物和医疗器械的合理设计至关重要。刚度和地形线索对细胞行为的影响以前已经分别进行了审查，然而，交织的刚度和nanotopographic线索对细胞行为的影响还没有得到很好的描述，尽管相似的表型表现。在此，我们首先回顾了基底刚度和纳米形貌对细胞行为的影响，然后集中在细胞内的生物物理信号从整合素到细胞核的传输。人们试图将细胞行为的细胞外调节与生物物理学线索联系起来。然后，我们讨论了解剖细胞行为的生物物理调节和翻译这些线索的机械理解组织工程和再生医学的挑战。© 2017 The Bottoms.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版这是CC BY-NC-ND下的开放获取文章许可证（http：//creati v ecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍越来越多的文献表明，细胞命运可以由细胞外基质（ECM）的硬度和地形特征ECM由多种纳米级生物大分子（包括胶原蛋白、弹性蛋白和纤连蛋白[1]）构成，通常显示纳米级形貌，如图1（a）[2-8]所示例如，直径为几微米的胶原纤维由直径为10-300 nm的胶原原纤维分层结构化肺间质基质显示出纳米级纤维胶原蛋白和弹性蛋白的相互关联的框架[8，11]。根据ECM的组成以及间质液[12]，ECM表现出不同程度的硬度，如图 所 示。1 （b）[13-15]。生物物理学（硬度和纳米地形学）线索与时空排列的生物化学和生物力学线索相一致，调节细胞表型和功能。ECM的硬度和纳米形貌特征影响体内许多发育、生理和病理过程[16例如，组织硬度可以被疾病状态改变。乳腺组织的硬度从正常状态下的约1 kPa增加到乳腺癌期间的约4 kPa[21]。肺气肿的肺硬度较低[22]，但纤维化组织的肺硬度高于正常情况[23，24]。此外，成纤维细胞对基质硬度的增加作出反应，促进增殖和胶原蛋白合成;诱导的ECM硬化可以通过正反馈回路进一步促进、放大和延续纤维化[24，25]。* 通讯作者。电邮地址：yong. mail.wvu.edu;kam. columbia.eduhttp://dx.doi.org/10.1016/J.ENG.2017.01.0142095-8099/© 2017 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。 这是CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http：//creati v ecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect工程杂志主页：www.elsevier.com/locate/engY. Yang等/ Engineering 3（2017）36-5437图1.一、人体组织的生物物理特性。（a）各种组织中显示的纳米级结构箭头指示各种纳米结构。（转载请注明出处）[6]用于骨骼、神经和皮肤的图解说明和扫描电子显微镜（SEM）显微照片肺泡上皮细胞的图解和SEM显微照片复制自参考文献。[7]和[8]分别）（b）人体组织的硬度纤维化组织变得比正常情况下更硬（转载请注明出处。[15]）因此，生物物理线索已被应用于调节细胞行为的几乎所有方面[26]。自1997年的第一份报告[27]以来，新出现的令人信服的证据表明，基质硬度在细胞调节和许多生物学过程中起着重要作用[27例如，C2C12小鼠成肌细胞仅在聚丙烯酰胺（PAAm）凝胶上表现出明显的肌动球蛋白条纹，其硬度是正常肌肉的典型硬度，但在较软的凝胶或较硬的玻璃基质上则没有[33]。此外，PAAm凝胶可以促进人间充质干细胞（hMSC）的神经源性、肌源性和成骨分化，其硬度分别与脑、肌肉和胶原骨的硬度相匹配[28]。同时，大量文献强调了细胞反应对纳米形貌高度敏感的现象[34除了对细胞形态学具有显著影响外，纳米形貌线索还可以调节细胞增殖并促进干细胞分化为某些谱系，如神经元[35，40，41]、肌肉[42]和骨[36，37]。许多优秀的评论文章讨论了细胞对亚细胞的[14]或[15]或然而，尽管表型表现相似，但刚度和纳米形貌线索对细胞行为的交织影响尚未得到很好的描述[51]。在此，我们首先回顾了基底刚度和纳米形貌对细胞行为的影响，然后集中在细胞内的生物物理信号从整合素到细胞核的传输。人们试图将细胞行为的细胞外调节与生物物理学线索联系起来。然后，我们讨论了解剖细胞行为的生物物理调节和将这些线索的机械理解转化为组织工程和再生医学的挑战。2. 细胞表型和功能的生物物理调节2.1. 刚度线索广泛的材料已被用作细胞研究的底物/基质。这些材料的范围从非常硬的金属如氧化钛（TiO2;杨氏如聚苯乙烯（PS; 2.3 GPa）[54]和聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA;PLGA 50/50为1.31 GPa）[55]，弹性体聚合物如聚二甲基硅氧烷（PDMS; 3.4 MPa）[56]，以及软水凝胶（从几帕斯卡到几千帕斯卡），如图2（a）所示。在文献中，不同的术语，如弹性，刚度，刚度和剪切模量已被用来表征基板的机械性能。弹性是材料的一种强度属性，而刚度是一种扩展属性，取决于材料和形状以及边界条件。在本综述中，除非另有说明，否则括号中的值表示基材的杨氏2.1.1. 刚度效应随着基质硬度的增加，细胞通常表现出增强的细胞粘附[57例如，当hMSC粘附到I型胶原修饰的PAAm凝胶上时，桩蛋白标记的粘附从软凝胶（1 kPa）上不可检测的弥漫性局灶性复合物变为中等硬度凝胶（11 kPa）上的点状粘附，再变为最硬凝胶（34 kPa）上的长、薄且更稳定的局灶性粘附[28]。随着凝胶硬度从20 kPa增加到110kPa，藻酸盐凝胶上MC 3 T3-E1成骨细胞中粘着斑蛋白黏着斑蛋白的表达增加1.5倍[57]。还表明，与仅剩余约30%的细胞的较软凝胶（2.68 kPa）相比，在较硬的胶原蛋白I涂覆的PAAm凝胶（7.69kPa）上的NIH 3T3成纤维细胞更分散并且具有更好的附着，在离心测定后剩余> 80%的细胞[58]。虽然许多研究表明细胞的单调依赖性还观察到了细胞粘附[73]、迁移[59，74一方面，当原代成人真皮成纤维细胞在聚乙二醇（PEG）水凝胶上生长时，平均细胞迁移速度从软凝胶（95 Pa）上的0.81 μm·min-1显著降低至硬凝胶（4.3 kPa）上的此外，当PAAm凝胶的杨氏模量从4.7 kPa增加到14 kPa时38岁。Yang等人/工程3（2017）36图二、 基质硬度影响细胞分化。（a）具有各种硬度的细胞培养基质（b）干细胞分化与基质硬度之间的关系;每个符号代表一种细胞类型。PEG：聚乙二醇; PCL：聚己内酯; rMSC：大鼠间充质干细胞; ESC：胚胎干细胞; SMC：平滑肌细胞; NSC：神经干细胞; rNSC：大鼠神经干细胞。在24小时和48小时后分别显示出约2倍和约4倍的细胞增殖[61]。另一方面，MC 3 T3-E1细胞在胶原I包被的PAAm凝胶上的迁移速度随着低胶原密度下刚度的增加而单调增加，而在较高胶原密度下，细胞表现出迁移速度对基底刚度的双相依赖性，并在基质刚度下达到最大值。21.6 kPa凝胶[59]。对于在PEG基质（10 Pa-10 kPa）上培养的大鼠神经干细胞，在中等硬度此外，海藻酸盐水凝胶上的小鼠干细胞增殖对凝胶硬度没有任何依赖性[72]。干细胞分化也受到基质硬度的深刻影响。如前所述，hMSC在PAAm凝胶上表现出神经源性、肌源性和成骨生物标志物的上调表达，其硬度分别与脑（0.1-1 kPa）、肌肉（8-17 kPa）和胶原骨（25-40 kPa）的硬度相匹配成体神经干细胞还在具有近似脑组织硬度的基底上表现出神经源性生物标志物β此外，较软的PAAm凝胶（100-由于细胞来源、基质制备和分化方案的变化，不同研究中的最佳基质硬度并不相同例如，另一项研究表明，在硬度分别为25 kPa和80 kPa的PAAm凝胶上的成肌分化峰和成骨分化峰[67]与之前的报告[28]略有不同。尽管如此，已经观察到了一般趋势，即神经分化倾向于软基质，而骨生成倾向于硬基质，而肌生成属于中间范围（图2（b）;每个数据点的参考文献见补充信息）。大量涉及不同细胞来源的研究的显著一致性突出了机械传感在干/祖细胞分化中的重要作用。刚度相关的细胞行为已经看到更多的应用。基质硬度影响纳米颗粒的细胞摄取：与较硬的凝胶（3.81 kPa和5.71 kPa）相比，软PAAm凝胶（1.61 kPa）降低了细胞膜张力，有利于牛主动脉内皮细胞摄取PS纳米颗粒[80]。更有趣的是，最近的研究表明，细胞可以保留来自过去培养环境的硬度信息，并且先前的机械历史或机械给药影响未来的细胞命运决定[32，81例如，骨骼肌干细胞在硬塑料培养皿上迅速失去其体内再生潜力，但在生理相关硬度的软水凝胶上保持其自我更新和再生能力[32]。进一步证明Y. Yang等/ Engineering 3（2017）36-5439hMSC在硬PS上长期培养后向成骨方向的分化越来越多，但仍保持可塑性，并且可以向成脂和成骨谱系分化，而无需在硬PS表面上预先进行机械给药[82]。2.1.2. 刚度法规细胞对底物硬度线索的反应并不总是一致的，有时是矛盾的。其中一个重要原因是，调整水凝胶（刚度研究中广泛使用的材料）的刚度可能会影响凝胶的表面化学、骨架柔性和粘合剂配体的结合特性，以及其整体刚度和孔隙率[85已经表明，hMSC对PAAm凝胶的硬度变化有反应，但对PDMS的硬度变化无反应;因此，推测是凝胶上附着的胶原蛋白I的锚定点的改变，而不是基质硬度本身，调节细胞行为[85]。进一步表明hMSC分化受纤连蛋白菌株调节，其不受光滑PDMS的刚度变化的影响，但受水凝胶的影响[88]。相反，最近的一项研究表明，hMSC分化不受高达50倍的蛋白质-底物连接体密度的影响;因此，认为底物硬度独立于蛋白质束缚和孔隙度调节干细胞分化[89]。另一个重要的问题是，细胞可以感觉到下面的水凝胶的硬度，甚至当凝胶较薄时，可以感觉到支撑基质的硬度[90据估计，细胞可以在大约5 μm的深度感知“隐藏”的总的来说，水凝胶结构在横向和垂直维度上的复杂性使得剖析基质刚度在细胞调节中的作用具有挑战性。模型系统中的刚度线索可以独立于其他环境变量进行调查是非常可取的。2.2. 纳米地形学线索细胞可以感知表面形貌上几纳米的变化，并积极响应纳米形貌[38]。细胞在各种各样的纳米形貌上表现出不同的行为。尽管纳米级在物理领域中被定义为1-100 nm的长度尺度2.2.1. 纳米形貌效应形状（例如，柱、坑和光栅）、尺寸（特征尺寸、间隔和高度）和纳米尺度特征的排列都对细胞行为具有显著的影响，从细胞粘附和扩散到增殖和分化，这是细胞类型特异性的。间充质干细胞（MSC）在直径为15-100 nm的 TiO2纳米管上显示出与平坦TiO 2表面不同的细胞粘附、增殖和分化在直径约30 nm的TiO2纳米管上，hMSCs的粘附力增强.一与平坦对照相比，在较大（70-100 nm）纳米管上发生约10倍的细胞伸长增加除了特征尺寸，纳米形貌高度可以有效地调节细胞行为[97]。在通过分层产生的随机分布的纳米岛上，与平坦对照表面相比，各种细胞类型在浅（11-13 nm高）纳米岛上表现出更明显的局灶性粘附和肌动蛋白应力纤维、高度分散的形态和更大的细胞面积当高度增加时到~90 nm，一些细胞-如人胎儿成骨细胞[98]，人骨髓细胞[102]和人成纤维细胞[103]-显示出减少的细胞铺展形态，具有弥散的肌动蛋白和更少的应力纤维。相比之下，人内皮细胞显示更大的层，并且在95nm纳米岛上具有增加的应力纤维数量[100]。在其他系统中也观察到对纳米形貌的细胞类型特异性反应[104，105]。例如，人胚胎干细胞（hESC）在光滑表面上表现出增强的增殖和长期自我更新，但在纳米粗糙玻璃表面上往往不同，而与光滑表面相比，纳米粗糙表面促进NIH 3T3成纤维细胞的粘附[105]。与各向同性纳米形貌相反，各向异性纳米形貌（如纳米光栅）可能导致细胞尺寸更小，增殖率更低-甚至细胞凋亡-同时促进细胞排列、伸长和迁移[35，101，106与光滑对照上的随机分布相比，人角膜上皮细胞的粘着斑和应力纤维沿着脊宽为70-1900 nm、间距为400-4000 nm、深度为150 nm和600 nm的硅纳米光栅焦点粘附尺寸随着脊宽度增加到400 nm，并且对于大于650 nm的脊宽度保持恒定。与光滑对照表面相比，细胞在所有纳米光栅上显示出较小的平均细胞面积，但在所有600 nm深的光栅上显示出显著伸长的形态[112]。纳米光栅诱导的细胞面积减少导致较低的增殖率。在宽度为350 nm、间距为700 nm、深度为350 nm的PDMS纳米光栅上，hMSCs显示出沿纳米光栅方向伸长的细胞骨架和细胞核，细胞增殖率为（26.9 ±3.1）%，显著低于光滑表面上的（35.7 ± 7.6）%[35]。除了观察到与光滑表面相比，各种人类细胞类型在纳米形貌上表现出增强的运动性[113-这表明定向细胞迁移可以通过微管组织中心的极化来调节[109]，并且迁移速度取决于底层纳米光栅的宽度[48]和深度[119]。请注意，单向细胞迁移可通过使用纳米/微观形貌梯度（如锯齿几何形状）实现，其尺度小于单个细胞，但与胶原纤维相当[120]。各向异性纳米形貌对神经元生长至关重要，[2019 - 04 - 22][2019 - 04 - 22][2019 - 04 - 22]背根神经节神经元的神经突伸长，并且在对齐的纳米纤维上几乎没有分支;然而，它们在随机纳米纤维上具有明显更多的分支，这对神经再生是有害的。此外，神经突表现出平行于直径为500 nm的纳米纤维的双极延伸，与体内神经突生长的组织方式相同[122]。有趣的是，神经干细胞伸长，它们的神经突与对齐的纤维一起生长，与它们的直径无关;然而，与微纤维（1.25 μm）相比，直径为250 nm的纳米纤维促进细胞分化[123]。纳米光栅对神经元分化的影响是显着的。在上述350 nmPDMS纳米光栅上，与微光栅和平面对照相比，hMSC表现出神经元标记物如β-微管蛋白III和微管相关蛋白2（MAP 2）尽管纳米形貌线索与生物化学线索（如视黄酸（RA））的组合进一步增强了神经元标志物的上调，但在光滑表面上，纳米光栅显示出比单独的RA更强的作用[35]。即使在不存在RA的情况下，hESC也生长在宽度为350nm和宽度为500 nm的等间隔光栅上。在高度上分化成神经元谱系，但不分化成胶质细胞[40]。有趣的是，各向异性地形显示，40岁。Yang等人/工程3（2017）36图三. 在（a）光滑的氧化硅基底和（b-f）纳米光栅上培养的人角膜上皮细胞的SEM显微照片。在宽度为70纳米的纳米光栅上，间距为400 nm，深度为600 nm（b-d），细胞粘附到纳米光栅的顶部（b），并沿着纳米光栅方向（c）排列，其中丝状伪足沿着纳米光栅的顶部（b）延伸。脊的顶部和槽的底部（d）。相比之下，电池沿着宽度为1900 nm、节距为4000 nm、深度为600 nm的纳米光栅（e）伸长，具有层状椭圆形。直径达到凹槽的底部（f）。（转载请注明出处。[112]）增强神经元分化，而在相同条件下各向同性地形增强神经胶质分化[41]。虽然细胞极性对细胞调节和器官发育至关重要，并且细胞极性的丧失与许多人类疾病相关[124，125]，但各向异性纳米形貌提供了建立和维持细胞极性的强大工具。有趣的发现表明，纳米级特征的排列可以对细胞表型和功能产生深远的影响在三种不同排列-正方形、六边形和近正方形（即，方形图案，±50 nm无序）-原代人成骨细胞在近正方形纳米孔上显示出约11 μm的平均纤维粘附长度，其显著大于六边形和正方形纳米孔（~6.6 μm）和平坦对照（~7.2 μm）[126]。此外，单独的近方形纳米孔以与由成骨补充剂诱导的分化相似的水平刺激hMSC的成骨分化，而高度有序或完全随机定位的纳米孔和平坦对照仅诱导有限的成骨分化[36]。另一方面，高度有序的方形纳米孔允许hMSC的多能性保留长达8周[39]。作为细胞行为的一种强有力的调节剂，拓扑结构可以改变细胞与基质的相互作用，从而加强或削弱细胞的粘附，从而影响细胞的过程。因此，纳米形貌已被用于各种应用中，从捕获循环肿瘤细胞（CTC）[127-受纳米结构表面的启发（例如，通过增强肿瘤细胞-纳米形貌相互作用[135]，各种纳米形貌如纳米线[127，128]、纳米管[129]和纳米粗糙表面[130]已经被用于肿瘤细胞[134]的纳米结构（如微绒毛、微脊和纤毛）[135]。制造，以提高CTC捕获的灵敏度和效率。与各向同性离散纳米柱相比，纳米光栅显示出有利于肿瘤细胞粘附，从而导致更有效的肿瘤细胞捕获[131]。 另一方面，nanocrater间距旨在破坏成熟局灶性粘连的形成，从而有利于NIH 3T3成纤维细胞向高间距区域迁移[136]。由于细胞-基质相互作用减弱，纳米柱上的牛角膜内皮细胞单层显示出比平坦对照更高的微绒毛密度，以及与天然角膜内皮相似的增强的形成和功能[137]。2.2.2. 纳米形貌的细胞传感文献中的不一致性混淆了目前对细胞行为的纳米形貌调控的理解。例如，一个研究组显示纳米光栅显著增加hMSC的成骨标志物的表达[138，139]。相反，另一个研究小组报告说，纳米光栅不会强烈影响hMSC的成骨表型[140]。此外，一些研究小组得出结论，与纳米形貌相比，生化线索对细胞行为产生更大的影响[107，141，142]。例如，在孔径梯度范围为19 nm至920 nm和正交环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp或RGD）配体梯度的硅基底上，大鼠MSC对纳米形貌和生物化学线索均产生反应;然而，它们对RGD密度变化的反应比孔径变化更强烈[141]。它还表明，MC 3 T3-E1细胞主要沿纳米光栅（100 nm的宽度，间距和深度），均匀地涂有纤连蛋白对齐。然而，当纳米光栅与10 μm宽且由非粘性泳道分隔的纤连蛋白泳道正交接触印刷时，细胞沿着纤连蛋白泳道而不是沿着纳米光栅伸长[107]。目前尚不清楚上述差异是否Y. Yang等/ Engineering 3（2017）36-5441这是由纳米光栅本身的差异或由纳米光栅改变的配体呈现引起的。通常认为纳米形貌可以增加表面积，从而增强细胞粘附。然而，细胞可以感知的表观表面是由纳米尺度特征的形状和尺寸决定的。细胞膜是否会桥接在纳米特征的顶部或底部取决于细胞膜在纳米尺度下的刚度[143]。在高度为500 nm的等间距纳米光栅上，显示新生大鼠心室肌细胞向400 nm宽的光栅底部延伸，但未到达光栅底部;该作用伴随着有限的细胞-基质粘附。相比之下，细胞可以完全填充800nm宽的光栅，并显示出增加的细胞-基质粘附[144]。当纳米形貌减少细胞可以感知的表观表面积时，纳米形貌限制了粘着斑，从而削弱了细胞粘附并促进细胞迁移[102]。在直径为700nm且柱间距离为1.2 -5.6 μm的纳米柱上，hMSC被拉伸并有利于在柱间距离较长（5.6 μm）的纳米柱上的骨生成，但在距离较短（1.2μm）的纳米柱上是圆形的细胞扩散和间隔之间的关系可以是双相的。例如，在直径范围为10 nm至200 nm且间距为20 nm至200 nm的纳米点阵列上，成心肌细胞在50 nm纳米点阵列上表现出最大表面积和增殖[146]。此外，在直径为150 nm、400 nm和600 nm的纳米点阵列中，hMSC的成骨分化在400 nm点阵列上达到峰值[147]。因此，据推测，有效的纳米形貌细胞调制，第一，由纳米形貌是否增加细胞可以感知的基板表面积，第二，由表观表面积的增加有多显著确定。小间距可以限制表观表面积，而大间距可以缓解表观表面积的增加。因此，建议纳米形貌的高度与间距的纵横比提供比单一尺寸参数更全面的纳米形貌表征[41，50，148研究表明，在宽度和间距为1-10 μm、高度为0.35-10 μm的光栅上虽然纳米形貌提供了一种有效的细胞生长调节剂和分化[153，154]，但其内在机制尚不清楚。当纳米形貌不影响粘附配体的呈现时，纳米形貌是否会通过接触引导影响细胞行为？当纳米形貌影响细胞对基底表面或粘附配体的感知时，纳米形貌会影响细胞行为吗？2.3. 交织基底纳米形貌和刚度线索细胞不断对ECM施加力，重塑ECM，并影响生理和病理过程[155当使用平坦的柔韧基底时，细胞可以检测基底刚度的差异并对刚度提示做出响应[158]。此外，当在细胞不能变形的刚性基底上制造形貌时，细胞将仅对形貌线索做出响应，而如果细胞可以使形貌变形，则细胞将对形貌和刚度线索两者进行感测和响应。注意，基板刚度感测也是细胞类型特定的。例如，牛肺动脉平滑肌细胞在宽度、间距和深度均为350 nm的聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA）和PDMS纳米光栅上表现相似[109]。然而，观察到hMSC使PDMS纳米光栅变形，但不使PS纳米光栅变形，PS纳米光栅具有与PMMA纳米光栅相似的刚度（PS和PMMA的E分别为2.3 GPa和3.7GPa）[54]，如图4（a，b）[159]所示。此外，在PS基底上，与平坦对照相比，当附着到350 nm光栅时，hMSC表现出较低的机械另一方面，无论形貌如何，在PDMS基质上培养的hMSC显示出比PS基质上更低的机械性能[160]。显然，当用于形貌的构建材料足够软以使细胞使基底变形时，形貌和刚度线索交织在一起以对细胞表型和功能施加影响[161]。值得一提的是，热塑性聚合物的表面，通常在小于100nm的长度尺度下，具有与本体不同的性质[162由于纳米特征构成了表面积的重要部分，因此提供了不同的机械性能，因此纳米形貌可以为细胞提供除了纳米形貌线索之外的刚度。最近开发的微尺度PDMS柱阵列提供了一种新的技术，关于细胞对组合的拓扑和刚度线索的反应的证据[166，168支柱的弹簧常数与直径的四次方成正比，与高度的立方成反比[166]。支柱的尺寸设计为产生约1 kPa至1.2 MPa的刚度，从而影响粘着斑、细胞形态、收缩性和分化[174，176]。例如，hMSC在不同硬度的微柱阵列上表现出不同的细胞扩散，如图4（使用各向异性微柱阵列的细胞研究在具有椭圆形横截面的各向异性PDMS微阵列上（长轴/短轴：0.95 μm/0.55 μm，导致支柱沿其长轴的硬度约为沿其短轴的三倍），上皮细胞优先沿长轴方向或最硬方向排列和迁移[173]。粘着斑和肌动蛋白应力纤维、细胞迁移和组织生长沿此类基质最硬方向的优先取向与集中在细胞组装体边缘的较大牵引力相关[44]。相比之下，在圆柱形柱阵列上没有观察到细胞排列或组装的优先取向[170]。此外，在宽度、间距和深度为800 nm且杨氏模量从1.8 MPa至1.1 GPa的聚氨酯纳米光栅上虽然基底硬度和纳米形貌线索的作用在细胞调节中，生物物理线索的交织使复杂性升级。为了促进对生物物理调节的机械理解，我们接下来讨论细胞调节方面的生物物理信号的细胞内和细胞外转导中的一些常见元件。3. 生物物理信号生物物理信号可以从整合素通过粘着斑和肌动蛋白细胞骨架传递到细胞核，并调节细胞表型和功能。因此，我们专注于如何生物物理线索影响局灶性粘连，细胞骨架和细胞核。在讨论生物物理信号如何影响细胞之前，我们先描述细胞如何感知和响应底物。细胞对基质反应的第一步是通过整合素结合和聚集到基质上的粘附配体上形成粘着斑。如图5所示，含有一个α亚基和一个β亚基的异二聚体整联蛋白受体结合至图5的RGD肽。42岁。Yang等人/工程3（2017）36图四、 交织基底形貌和刚度对细胞的影响。（a，b）hMSC在（a）刚性PS和（b）柔顺PDMS纳米光栅上的SEM显微照片（在高度为0.97 μm的微柱上，hMSC在（c）中充分散布，但在（e）中它们显示出圆形形态，在12.9 μm柱上具有突出的微绒毛（f）在具有不同硬度的纳米光栅上生长的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的免疫荧光图像对细胞的肌动蛋白（红色）、黏着斑蛋白（绿色）和核物质（蓝色）进行免疫染色（部分（a）和（b）是转载的许可，从参考。[159]，部分（c[166]，（f）部分是复制的许可，从参考。[167]）ECM蛋白与它们的细胞外结构域连接，并与它们的细胞质尾连接到细胞骨架衔接蛋白，随后重新形成将整联蛋白连接到肌动蛋白细胞骨架的支架蛋白[177]。整合素介导的接触的最早形式是焦点复合物。这些小（~500 nm）但高度动态的焦点复合物位于板状伪足和膜突起的前缘[178]。当板状伪足缩回或停止突出时，病灶接触被病灶粘连所取代，细胞质锚定蛋白（包括桩蛋白、粘着斑蛋白和talin）被募集到粘连部位[179]。新生病灶复合物成熟为稳定的条纹样病灶粘连和纤维状粘连是由肌动蛋白和肌球蛋白丝（肌动球蛋白）的交叉桥接相互作用驱动的细胞骨架张力诱导的[180]。局灶性粘连的高度各向异性生长是在细胞骨架施加的力的方向上[181]。随后发生小GTP酶的Rho家族中的蛋白质的下游信号传导[43，182]，调节纳米级传感（Cdc42 ）、应力纤维形成（ RhoA ）和细胞铺展（ Rac）[183]。这些过程然后通过蛋白质如肌球蛋白控制丝状肌动蛋白纤维的伸长和收缩[184]。RhoA活性增加降低Cdc42和Rac的活性，驱动粘着斑和肌动蛋白应力纤维的形成[178]。基质硬度和纳米形貌线索可以介导粘着斑的大小和分布，随后介导细胞骨架组织和张力，从而调节细胞形态，并最终调节细胞功能。最近的一项研究表明，最小尺寸为0.19 μm2的新生焦点复合物[185]对机械传感至关重要[186]。与焦点复合物一致，发现稳定的整合素-纤连蛋白簇在面积阈值（0.11 μm2）以上组装;低于阈值，没有稳定的整合素-纤连蛋白簇组装或产生明显的粘附力[187]。粘着斑的大小并不能预测在粘着处施加的局部张力。研究表明，在粘着斑处施加的力继续增加，而细长的粘着斑蛋白桩蛋白保持在细胞周边的8 μm范围内，而没有进一步的尺寸变化[188]。作为粘着斑信号传导的主要调节剂，粘着斑激酶（FAK）调节细胞增殖[189]和分化[190，191]，并且其活化在机械应变时增加[192]。通过FAK和Src介导的桩蛋白磷酸化，黏着斑蛋白可以被募集到粘着斑，Y. Yang等/ Engineering 3（2017）36-5443图五. 生物物理信号从整合素通过粘着斑和细胞骨架传递到细胞核。ARP：肌动蛋白相关蛋白; FAK：粘着斑激酶;- 你好Rho相关蛋白激酶; TAZ：具有PDZ结合基序的转录共激活因子; VASP：血管舒张剂刺激的磷蛋白; YAP：yes相关蛋白。通过肌球蛋白依赖性张力，并将进一步稳定粘连[193]。事实上，FAK的酪氨酸磷酸化和脱磷酸化在细胞对底物硬度[194]和纳米形貌线索[160]的反应中起关键作用。在顺应性ECM上，FAK信号传导受到抑制，细胞内张力降低[195]。随着底物硬度的增加，成熟粘着斑蛋白zyxin的表达上调[56]。还观察到FAK磷酸化在宽度为250nm[196]和500 nm[160]的等间距纳米光栅上磷酸化FAK（pFAK）的表达增加促进了hMSC的神经元分化，表明FAK的磷酸化可能作为整合素和细胞骨架之间的信号转导子，以便通过细胞内收缩将纳米形貌刺激传递到细胞核[196]。此外，zyxin在350 nm纳米光栅上的表达下调，与更小（（3.2 ± 0.26）μ m2 vs（5.3 ± 0.55）μm2）和更动态的局灶性粘连相关，表明纳米光栅上局灶性粘连的牵引力降低。结果显示，hMSCs沿纳米光栅方向的迁移速度为15.6 μm·h8.3μm·h粘着斑的组装取决于通过肌动蛋白细胞骨架的细胞内张力，并且可以通过细胞内张力调节[198]，并且小Rho GTP酶家族的成员是肌动蛋白细胞骨架重塑的主要调节剂[199]。激活Rho及其下游效应物Rho相关蛋白激酶（ROCK），从而抑制肌球蛋白轻链磷酸酶，促进肌动蛋白应力纤维的收缩[200]。通过ROCK依赖性收缩性，肌动蛋白细胞骨架在调节细胞形状中起主导作用，这是细胞生长和分化的已证实的调节剂[201已经证明，当微图案尺寸减小时，限制在微图案蛋白上的细胞从生长切换到凋亡[153]。良好铺展和扁平化的hMSC有利于成骨，而未铺展的圆形细胞进行分化[57，59，203]。对hMSCs形态依赖性分化的研究表明，在分化过程中，粘着斑和肌球蛋白产生的细胞内张力在干细胞分化中起着至关重要的作用。细胞谱系定型[204]。扩散良好的极化形状与高RhoA/ROCK活性相关，而小圆形的细胞具有低RhoA/ROCK活性[154]。药理学药物研究进一步证实，增加细胞内张力可驱使大多数hMSC朝向成骨细胞，尽管形状不同;相反，抑制ROCK活性可使脂肪生成偏向[204]。此外，在成骨培养基中进行成骨分化的hMSC表现出比非分化细胞更高的细胞内张力，而在成脂培养基中不分化为脂肪细胞的hMSC比进行脂肪形成的细胞或维持在生长培养基中的细胞更具收缩性[166]。增加底物硬度促进肌动蛋白聚合和肌动球蛋白力产生，导致细胞内张力增加[205-207]和Rho活性增加，其通过降低底物硬度而减弱[21，208，209]。例如，刚性底物增加RhoA和Cdc 42的活化，从而抑制神经干细胞的神经发生，而RhoA/ROCK信号传导的抑制适度增加神经元分化。RhoA/ROCK信号传导的抑制也阻断了hMSC在刚性基质上的骨生成[210]。在纳米形貌的情况下，纳米形貌的尺寸（特别是高度）和形状影响细胞内张力。当在各种纳米形貌上检查时，人肺成纤维细胞在浅（150 nm高度）纳米形貌上显示出比在其560 nm对应物上显著更硬的细胞骨架。与具有相同尺寸和高度以及类似间距的纳米柱相比，纳米光栅还增加了细胞骨架刚度更硬的细胞骨架与I型胶原合成增加有关[211]。还发现纳米光栅诱导高肌动球蛋白收缩性，这对于hESC的神经分化至关重要[212]。局部粘连之间的分子联系，细胞-骨骼和细胞核与细胞和核结构相关[197，213，214]，使细胞行为的生物物理调节成为可能[215，216]。例如，鼠MSC的软骨形成需要圆形的细胞形状，并且通过比较细胞和软骨形成生物标志物，显示更圆形的核形状与MSC中软骨形成生物标志物的最大表达相关。44岁。Yang等人/工程3（2017）36核形状[217]。细胞核的可塑性也被证明与干/祖细胞的谱系定型密切相关[218]。细胞形状不仅通过肌动蛋白细胞骨架的内容物而且通过肌动蛋白细胞骨架的组织来调节核变形[219]，核变形可导致染色质结构和组织的构象适应，这会影响转录调节[220]、基因表达和蛋白质合成[216，221]，最终导致增殖、分化或细胞死亡的变化[159，218]。将圆形细胞的铺展面积从300 μm2增加到2500 μm2，导致G1期细胞的核体积增加36%，细胞硬化50倍，增殖率增加10倍[222]。据设想，基底硬度和/或纳米形貌配置的变化可改变粘着斑和细胞骨架的大小和分布，导致细胞核变形以及细胞表型和功能的变化[223]。在宽度为350 nm的等间距PDMS纳米光栅上，hMSC表现出沿着纳米光栅方向的优先核（62%核）排列和更多伸长的核（伸长纵横比：1-5），纳米光栅上的平均细胞核面积从平面对照的（194.8 ± 4.8）μm2降至（145.1 ± 4.1）μ m2[224]。与平面对照相比，纳米光栅还显著下调hMSC中A型核纤层蛋白核蛋白和视网膜母细胞瘤蛋白的表达，从而降低细胞增殖并改变分化潜能[213]。核因子是相关蛋白（YAP）和转录因子-具有PDZ结合基序（TAZ）的功能性共激活剂在发育和病理过程中发挥重要作用，并介导细胞机械感应[82，225例如，在早期小鼠胚胎的内细胞团的多能细胞中，YAP被排除在细胞核之外[230]。小鼠ESC中YAP的敲低导致多能性丧失，而YAP的异位表达阻止ESC分化[231]。此外，YAP和TAZ在纤维化而非正常肺组织中显著表达[229]。在小鼠中转移过表达YAP和TAZ的成纤维细胞导致肺中严重的ECM重塑和纤维化[229]。YAP/TAZ细胞内定位和活性主要受细胞伸展和细胞骨架张力调节[225，232]。当细胞铺展时，形成粗而丰富的应力纤维，导致YAP/TAZ去磷酸化和核转位，伴随着促进细胞增殖。相比之下，有限的细胞伸展（紧凑和圆形形态）导致应力纤维变薄和不太明显，导致YAP/TAZ磷酸化和细胞质易位，并伴有细胞增殖抑制[226，228，233]。抑制细胞中的肌球蛋白减少应力纤维和核YAP[234]。YAP去磷酸化可以被Rho完全阻断，但不能被Rac或Cdc42抑制剂阻断[233]。YAP的核质定位和活性可以通过[2019 - 12 - 18][2019 - 09][2019 - 10 - 19][2019 - 09][2019 - 01][在微加工的粘附正方形上，YAP核质分布随着正方形的大小而逐渐改变 细胞主要在小方块上表达细胞质YAP，因为它们主要在大于（30 × 30）μm 2 和（ 40 × 40 ） μm 2 之间 的阈值面 积的方块 上显示 细胞核YAP[226]。YAP/TAZ核质定位显示在生理相关范围（0.5-40 kPa）内依赖于底物硬度[232]。软基质诱导细胞质YAP表达，抑制细胞增殖[228]，并促进人多能干细胞（hPSC）分化为运动神经元或GABA能中间神经元[174，235]。在生长于硬基质或大粘附区域上的hMSC中敲低YAP/TAZ在坚硬的衬底上生长[225]。此外，YAP/TAZ建议作为细胞内的机械变阻器，介导的影响，机械剂量对干细胞可塑性。短时间内机械引发细胞导致YAP的可逆活化;然而，超过阈值剂量的机械给药导致YAP的组成性活化，这使hMSC再生偏向成骨，即使在机械给药被去除后也是如此[82]。 与充分研究的刚度线索相比，纳米形貌线索对YAP细胞内定位的影响尚未得到充分研究[212，232]。细胞质YAP被认为是人类诱导多能干细胞神经分化所必需的，但还不足以，而纳米光栅诱导的细胞极性对诱导神经分化至关重要[234]。4. 生物物理规则之间的比较4.1. 衬底刚度和纳米形貌调制之间的相似性响应于广泛的基底硬度和各种各样的纳米形貌，细胞表现出不同的表型和功能。然而，在细胞对生物物理线索的反应中观察到惊人的相似性。例如，MC 3 T3-E1成骨细胞在不同硬度的PAAm凝胶上表现出不同的粘着斑和细胞骨架，在最软的凝胶（11.8 kPa）上表现出弥散性粘着斑和组织不良的肌动蛋白细胞骨架，但在较硬的凝胶（39kPa）上表现出明显的粘着斑和成熟的肌动蛋白应力纤维，这与在玻璃表面上生长的细胞中的粘着斑和肌动蛋白应力纤维相当[59]。同样，在高度有序的纳米孔阵列上生长的人成骨细胞中，应力纤维发育受到干扰，但观察到随机排列的纳米孔上的细胞分布良好，具有有序的应力纤维;后者的细胞与光滑对照基质上的细胞相似[236]。细胞扩散和迁移的相似性是显而易见的，具有硬度和形貌的逐步变化的基底。如图6（a）[207]所示，在具有软（14 kPa）和硬（30 kPa）区域的PAAm基底上，单个NIH 3 T3成纤维细胞容易从软侧迁移到硬侧，细胞面积和牵引力同时增加，但细胞迁移速度降低：软侧为（0.44 ± 0.23）μm·