新型病原体SARS-CoV-2的变异株的毒力和传播趋势分析

医学信息学解锁21（2020）100442病毒数据库注释有助于追踪患者信息感染了新出现的病原体Akiko Nakashimaa，*，Mitsue Takeyaa，Keiji Kuba b，Makoto Takano a，Noriyuki Nakashima aa日本福冈市Kursun市Asahi-machi 67 Kursun大学医学院生理学系，邮编830-0011b秋田大学医学研究生院生物化学和代谢科学系，1-1-1 Hondo，Akita，010-8543，JapanA R T I C L EI N FO关键词：SARS冠状病毒2亚株临床特征估计传播史医学注释A B S T R A C TSARS-CoV-2的全球大流行扰乱了人类的社会活动。在重启经济活动的过程中，新变种的连续爆发令人担忧。在这里，我们评估了公共数据库注释的适用性，以估计新出现的SARS-CoV-2变异株的毒力，传播趋势和起源。在可检测的多个突变中，我们追溯了刺突蛋白中的突变。在蛋白质数据库的帮助下，结构建模产生了一个关于病毒进入宿主细胞的可检验的科学假设。同时，对地点和采集日期的注释表明，变异病毒于2020年2月左右在世界某个地方出现，进入美国并在全国范围内传播，可能是由于大约5天的接种延迟造成的周期性采样波动。因此，公共数据库注释有助于自动阐明与人类行为有关的早期传播模式，这应为地方政府的社会决策提供客观参考，以遏制新出现的亚型。我们建议对患者过去的路径和症状进行额外的注释，以进一步帮助表征新出现的病原体的确切毒力和起源。1. 介绍自首次爆发以来，由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）大流行扰乱了全球的社会和经济活动2019年中国[1]。COVID-19在全球范围内呈现不同的症状特征[2表征病原体和药物制剂以及预防性疫苗正在世界范围内进行紧急和广泛的探索[11在重启经济活动方面，第二波SARS-CoV-2这是一个问题[15]。在日本，SARS-CoV-2感染的第一波被集群跟踪和隔离所抑制[17]。 自解除紧急状态以来，病例数量迅速增加[16，18]，这需要迅速做出政策更新的决策[19]，以放松对包括旅行和商务在内的社会活动的管制。目前，疑似患者是检查为症状和测试使用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和抗体相关免疫测定[20]。需要高灵敏度和特异性的诊断试验[21为了追踪患者的行为，本地集群追踪[17]是有效的，但信息准确性取决于直接采访感染者的可靠性个体在包括日本在内的一些地区，通过蓝牙技术追踪过去与患者密切接触的手机应用程序（app）得到了利用[24，25]。然而，此类移动应用程序在服务区域之外的全球追踪、所有年龄组的用户数量[26]、自我报告的可靠性或密切接触时间和距离的定义方面可能存在局限性。在小社区中识别索引病例并使其因恐慌和焦虑而受到审查和严厉判断时也可能存在伦理问题[27，28]。同时，SARS-CoV-2突变变体的出现已得到证实[12，29，30]。用于诊断的RT-PCR、免疫测定、用于治疗的药物或用于预防的疫苗可能易受突变的亚株的影响。虽然技术正在进步[21，22]，但SARS-CoV-2突变亚株的致病性和起源应可实时获得，以便当局在出现时采取早期措施。* 通讯作者。电子邮件地址：nakashima_akiko@med.kurume-u.ac.jp（A.Nakashima）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2020.100442接收日期：2020年7月31日;接收日期：2020年9月20日;接受日期：2020年2020年10月8日网上发售2352-9148/©2020的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：http://www.elsevier.com/locate/imuA. Nakashima等人医学信息学解锁21（2020）1004422在医院和诊所进行个体化治疗的同时，对感染患者的标本进行直接测序，并对SARS-CoV-2的遗传信息进行全球采样，公共数据库[31这些数据库已被用于预测病毒遗传性、抗体亲和力和药物功效[34]。数据库的跨学科可用性应促进积累原始数据的反馈，以预测致病性疾病的实际概况[35]。在区域公共援助下进行简单的实时调查，基本上是必要的，必须采用国际通用的格式。在这里，我们利用这些数据库注释来检测病毒变体，并估计新出现的亚株的毒力和传播轨迹。我们通过查阅国家生物技术信息中心（NCBI）病毒数据库中登记的世界标本，检查了核苷酸突变并可视化了SARS-CoV-2的传播轨迹[32]。2. 方法2.1. SARS-CoV-2和其他标本的数据采集由于其对核苷酸和蛋白质的原始数据的可访问性通过简单FASTA格式的多个注释，我们使用了NCBI病毒-SARS-CoV-2数据中心中存储的数据[36]。在“优化结果“窗口中，我们按发布日期2019/1/11-2019/5/3（从2019年1月11日到2020年5月3日）指定数据。当时的最新数据已于2020年5月1日存入。在“结果”中在窗口中，我们按升序重新排列了然后，我们观察-按 顺 序 获 得 了23042-FASTA 格 式 的 蛋 白 质 数 据 （ 包 括Accession 、GenBank Title 、Geo_Location 、 Host 、Species 和Nucleotide Completeness）和2051-FASTA格式的核苷酸数据。 对于另一个分析，我们还获得了CSV格式的蛋白质的23042-表格视图结果数据和核苷酸的2051-表格视图结果数据，其包含Accession、Release_Date、Species、Genus、Family 、 Length 、 Sequence_Type 、 Nuc_Completeness 、 Genotype 、Segment、Authors、lications、Geo_Location、Host、Isolation_Source、Collection_Date、Bio- Sample和GenBank_Title。用EXcel过滤函数分析单字母编码的蛋白质和核苷酸序列。病毒基因组的登录号 为 SARS-CoV-2 ， NC_045512.2; SARS-CoV ， NC_004718.3; MERS ，NC_019843.3; HCoV-NL 63，KF 530114.1; HCoV-229 E，KF 514433.1;HCoV-HKU 1，NC_006577.2;和HCoV-OC 43，KX344031.1. 同源比对使用在线工具CLUSTALW [37]。逐步程序见补充说明1和22.2. 熵计算为了评估在第i个残基处的突变比例（P），对于S蛋白，我们使用信息熵[30]作为PAAln-PAA的和，其中AA是20种生物氨基酸。 当在第i个样品中未检测到突变残基时，将PAAlnPAA定义为零残余物沿着整个S蛋白质结构绘制计算的熵分数，以产生作为熵谱的分数的谱视图。有关如何使用该程序，请参见补充说明12.3. 蛋白质构象分析使用PyMOL（The PyMOL Molecular Graphics System，Version2.0Schr？dinger，LLC.， USA）。冠状病毒刺突糖蛋白的结构模型2.4. 顺序数据分析我们最初建立了一个程序来操纵大数据。代码由EX cel VisualBasic （ Office Profesional 2016 ， Microsoft Corporation ， WA ，USA）提供作为补充数据。所有的源代码向节目提供注释。 每个程序如下操作：“prPCVcov 2“在FASTA格式的数据文件中针对所有不同的蛋白质数据集分别比对每个单元中所有氨基酸序列的每个单字母代码;“priNuc“提取文本字符串“GAT“或“GGT”，其在文本字符串“CCAGGTTGCTGTTCTTTATCAG”之后。有关如何使用该程序，请参见补充说明1和2。2.5. 图形设计通过Kaleida Graph 4（HULINKS Inc.，东京，日本），艺术品最初是由Illus- trator（Adobe Systems Incorporated，CA，USA）创建的。SVG数据是在www.example.com的CC0 1.0许可下从公共领域获得https://en.wikipedia.org/wiki/File:BlankMap-World6-Equirectangular。svg。世界地图起源于美国中央情报局--《世界真相》2.6. 采样周期使用Ax graph X（版本1.7.4）通过功率谱3. 结果3.1. 注释搜索检测SARS-CoV-2蛋白质的多个转换冠状病毒是一种独特的RNA病毒，具有校对机制[45]。然而，预计会发生大量突变，导致高估了遗传密码子不变的亚株。另一方面，由于密码子的摆动性质，氨基酸突变发生的频率较低[46]。因此，我们查阅了NCBI数据库[36]，并使用下载的数据表和所有适用的注释（另见方法）。 其中，部分序列或不完整的读数是淘汰我们使用了1500所有适用的注释，包括采样日期、地点和病毒遗传信息。我们在SARS-CoV-2的几种组分蛋白中检测到相同突变的积累或在大约100个残基处分支为多个氨基酸（补充表1）。尽管冠状病毒具有基因组校对能力[45]，但已报道了SARS-CoV-2中的多个随机突变[47，48]。任何这些转化都可能归因于病毒颗粒的病毒性增加或降低[29]。特别是，来自不同标本的相同残基处相同突变的存在和增加可能是由于SARS-CoV-2的可传播致病亚株[12]。氨基酸序列的突变确实发生在COVID-19大流行的不同阶段，并且可能是固定的、遗传的，并主要在世界各地传播。然而，这些变异的致病性和确切起源是未知的。很难仅仅用这个突变图谱来追溯。在具有频繁突变的蛋白质中，表面糖蛋白，即刺突蛋白或S蛋白，在614处包含从天冬氨酸（D）到甘氨酸（G）的单一显著突变（D 614 G转化;补充表1）。的5X 5c [第四十届] （中东呼吸综合征）， 6nzk [41] （HCoV-OC43） 和 6u7h [四十二]计算每个残基的相对突变频率，（HCoV-229 E）从蛋白质数据库[43]（www.rcsb. org）。对于疏水性搜索 ， 我 们 咨 询 了 瑞 士 生 物 信 息 学 研 究 所 的 在 线 资 源 门 户 网 站（https://web.expasy.org/protscale/）[44]。在数据库[30]中，使用熵来描述整个S蛋白的变化，并在整个S蛋白的光谱视图中可视化：D 614 G出现在COVID-19大流行的早期阶段，并随着时间的推移而积累（图1a）。在D614G亚株中，额外的主要A. Nakashima等人医学信息学解锁21（2020）1004423Fig. 1. 高致病性冠状病毒与普通冠状病毒的比较。（a）SARS-CoV-2刺突（S）蛋白（上）和熵谱（下）的示意图，以显示不同日期S蛋白的突变。RBD=受体结合结构域，SD=亚结构域，S1/S2= N-末端S1/C-末端S2结构域之间的蛋白酶切割位点。N和C=氨基和羧基末端。D614在SD中。（b）高致病性冠状病毒和其他人类冠状病毒（HCoV-OC 43、-HKU 1、-229 E和-HCoV-OC 44）之间D 614周围残基的同源性比对- NL 63）。HCoV是致命性较低的普通感冒病毒。中东呼吸综合征冠状病毒（MERS）含有A614，但与SARS-CoV和SARS-CoV-2（SCoV-2）相比，在HCoV中，只有HCoV-OC 43具有与SARS-CoV相对同源的等效残基2. 氨基酸编号基于SARS-CoV-2。（c）不同冠状病毒的598-628个残基之间的疏水性疏水性呈现出陡峭的与D 614在603和618个残基之间的初始SARS-CoV-2相比，SARS-CoV、D 614 G转化的SARS-CoV-2和MERS增加 如（b）和（c）中的灰色条所示图二.冠状病毒中D614和等效残基的比较SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS、HCoV-OC的可用钉状晶体结构的全表面视图43和HCoV-229 E。另见图1b和1c中的灰色条。具有D 614 G转化的SARS-CoV-2 S蛋白用米色表示，其他刺突用浅灰色表示;对齐的结构用马赛克颜色表示。SARS-CoV-2的D 614周围的人类区域用不同的颜色突出显示。具有灰色实线的方框显示了SARS-CoV-2中D 614 G转化的特写视图。带黑色实线的框X表示等效的其他冠状病毒中的残基 黑灰色BOXES虚线显示SARS-CoV-2：D 614 G和其它相应CoV之间的等同区域的结构比对。HCoV-229 E缺乏与SARS-CoV-2的D 614等同的残基。绿色的方框X表示 的等效残基旋转90°;不重叠。HCoV-HKU 1和HCoV-NL 63的数据未在数据库中找到。(For在该附图图例中，读者可以理解颜色的含义，参考本文的Web版本A. Nakashima等人医学信息学解锁21（2020）1004424与D 614原始毒株相反，在其他病毒蛋白中积累了突变（补充表1，补充图1）; D 614 G可能是后来在世界上流行的更占优势的亚毒株的初始突变。因此，我们接下来通过结构分析研究了转化亚株S蛋白中D614G突变的可能影响，并基于获得的EX cel数据通过采样周期分析估计了区域来源。3.2. S蛋白中的D614G转换可能影响病毒进入我们咨询了蛋白质数据库[43]和瑞士生物信息学研究所资源门户[44]，以进行随后的结构分析。SARS-CoV-2的刺突形成同源三聚体。每个S蛋白包含大约1300个氨基酸，是一个大的跨膜蛋白，包含两个亚结构域，S1和S2，它们负责 分别用于受体结合和膜融合[49]（图1a）。S蛋白中的D 614在2003年的SARS-CoV以及2020年1月在中国的SARS-CoV-2的初始分离株中是保守的[50]。与致死性较低的人冠状病毒[51]相比，高致病性冠状病毒在亚结构域中D614上游的疏水性大幅增加（图1b和1c）。此外，D614和相应的残基在其他冠状病毒中略微偏离或不存在于等同位置（图11）。2）的情况。在结构上，D614嵌入S蛋白的S1结构域，面对三聚体内的另一个蛋白单元（图3a和3b），但该天冬氨酸残基不能从受体结合的孔进入。因此，预期D614G转化会改变尖峰三聚体的分子间和分子内性质。分子模拟预测，单个D614 G替换不仅会增加附近的热波动，而且会增加整个S蛋白的热波动，特别是在靠近病毒膜的S2亚基中[52]（图13）。 3 c-f）。D614 G转化导致天冬氨酸残基的侧链缺失，并且D614和另一个蛋白质单元的T859之间的距离应该从4.4埃扩大到6.4埃（图3g和3h）。这一估计表明，D614 G突变应该改变亚结构域中的亚单位间相互作用和受体结合结构域的构象状态，使得突变的病毒颗粒可以有效地与宿主细胞中的同源受体相互作用 对于病毒进入[12，34，53]。3.3. GAU到GGU的转换可以追溯到2020年接下来，我们研究了基因组水平的突变，以追溯D614G转化病毒的传播历史。通过分析核苷酸数据库，我们在所有D 614 G转化的情况下检测到从鸟嘌呤-腺嘌呤-尿嘧啶到鸟嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶（GAU到GGU）的相同转化，尽管有8个以上的可转化密码子。然后我们用GGU突变追溯了样本。2020年3月，全球GGU标本呈指数级增长（图10）。 4 a）。截至5月1日，在超过一半的数据库资源样本中发现了这种转换，并且几乎在所有地区都发现了这种转换（图4a）。最初在中国武汉分离出的SARS-CoV-2病毒是一种未转化的GAU型[50，54]，直到3月份紧急状态实际终止之前，中国报告的所有标本都这种GAU到GGU的转化首先在西班牙的一个标本中检测到（MT 292580） ，其 次是在 美国 ; 2 月28 日还 从新英 格兰 （ MT276323）和佛罗里达州（MT 276329，MT 276330）采集了一个标本，2月29 日从新罕布什尔州（MT304484）和乔治亚州（ MT276327）各采集了一个标本（图10）。 4 b）。有趣的是，2020年3月 1 日 在 美 国 遥 远 的 城 市 华 盛 顿 （ MT415895 ） 、 康 涅 狄 格 州（MT350239）和加利福尼亚州（MT304491）对突变标本进行了采样，这意味着D 614 G转化可能赋予欧洲和美国SARS-CoV-2的毒力[29，54]。这一结果表明，患者与另一名患者在其移动史上有密切3.4. D614G亚株入境后在美国境内的传播2020年1月，美国已经报告了没有突变的原始SARS-CoV-2样本（图5a）。GGU突变样本相对于原始GAU样本的采样比率在2月底突然增加，随后出现周期性波动（图5b）。光谱分析表明，主要传播间隔为4~ 6天。这段时间很可能对应于美国境内突变亚株传播早期阶段的适当孵育延迟（图5c）。当2020年6月22日再次查询数据库时，存放的数据不仅在总数上有所增加（全球标本从1866件增加到7596件），而且在基于采集日期的月度标本数量上也有所增加：1月，从84件增加到129件; 2月，从78件增加到189件; 3月，从1527件增加到4155件; 4月，从161件增加到2468件。因此，许多标本是在一个图三. D614G对S蛋白的分子稳定性有影响。（a，b）（a）D614和（b）D614G的刺突结构。I-III表示以不同颜色显示的三聚体S蛋白单元。 D614单元I的原子以蓝色和红色突出显示。（c-f）蛋白质单位和（e，f）分别在D614和D614G附近的特写视图中。热图表示原子位移。（g，h）从（g）D614或（h）D614 G到另一个蛋白质单位的T859的估计距离。(For关于这一图中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版。）A. Nakashima等人医学信息学解锁21（2020）1004425见图4。GAU到GGU的转化在世界范围内都有发现。（a）世界和各大洲新增的携带GAU和GGU核苷酸突变的标本的每月时间轴。在中国抽样的数据单独显示，那里已经解除了紧急状态。4月份的数据未在中国注册（NR）。GGU转化未在中国注册。样本数量以对数标度显示。未发现D614G的其他密码子。（b）2020年3月新采集标本的地理位置和日期。红色圆圈表示以下地区：西班牙、美国、秘鲁、以色列、法国、希腊、南非、斯里兰卡、捷克共和国、台湾、印度、德国、香港和波多黎各。在美国，只有代表性的州被列出：华盛顿州，康涅狄格州，加利福尼亚州，明尼苏达州，伊利诺伊州，德克萨斯州，弗吉尼亚州，亚利桑那州，犹他州和印第安纳州。（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的Web版本由于收集日期（例如，大约在2月底，图5a和5b），尽管存在这样的差异，但光谱分析的趋势基本上没有变化;周期性稍微尖锐（图10）。 5c）。总的来说，病毒基因组数据库中的注释对于假设致病性和追踪新亚株出现早期的传播途径具有基本用途。这些结果阐明了对患者进行额外注释的必要性（图6 a和6 b），这应该通过表征症状特征来加强病毒基因组注释的实用性（图6 a和6 b）。 6 c）。4. 讨论4.1. 注释需要进一步实施目前的NCBI数据库可以阐明新出现的病毒变体传播通过多个数据比较对传播轨迹和密切接触者的估计可以改进SARS-CoV-2的当前基因组和地质特征[25，30，54]。然而，确切的起源和致病性，病毒变种需要更精细化[55，56]。该病毒与人类行为和健康状况密切相关。如果病毒信息被标记上关于患者的额外可注释数据，我们就可以充分利用有限数量的样本。特别是，旅行史和医疗记录非常有用。这种与人类相关的信息应标记到病毒信息中。4.2. 关于新出现病毒为防止全球范围内的进一步经济损失，未来将放宽对国际个人旅行的限制。如果爆发其他致病亚株，需要不同的医疗治疗[57全球流量可能导致变种病毒对人类社会的连续攻击。关于迫切的临床必要性，确定新的致命性结核菌株出现的起源为紧急情况准备医疗设施[29]。与病毒信息相关的患者移动史的注释标签在社会条件下，收款后应存在存款延迟A. Nakashima等人医学信息学解锁21（2020）1004426图五. 在美国的传输是可追溯的。（一）截至2020年5月1日在美国采集并保藏的SARS-CoV-2（GAU）原始标本和转换标本（GGU）（上图），以及GGU占日保藏量的比例（GAU+ GGU）。（b）截至2020年6月22日采集的GAU和GGU标本（上图）及其比例。（c）光谱分析（a）2月28日至4月8日的比率趋势，（b）2月28日至5月21日的感染的周期性（红色箭头）在美国范围内扩大国家得到了澄清。（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的Web版本即使在下一代测序的帮助下也会出现混乱[15，60，61]。 因此，偶尔更新同一个目录是很重要的。尽管志愿服务在全世界并不总是无限制的，但有必要在定点调查方面进行国际合作，以加强对新出现的病原体的传播路径以及人类流动性的全球监测和追溯。4.3. 关于新出现病毒的致病性的信息结构模型将有助于假设致病性。然而，D614下游的一部分构象数据也不在PDB数据库中。这些结构信息将有助于进一步深入了解分子机制，应伴随症状特征[29，56]，以最终在实验研究的基础上了解人类的致病性[62]。4.4. 目前的临床审评制度日本的暴发规模相当小[63]，由于缺乏关于该疾病的可用信息（即患者症状），其机制仍然未知。目前，个体病例报告、病例系列、区域分析和荟萃分析都是在伦理法规下进行的，协议[17，63这些由训练有素的临床工作人员进行的近距离观察描述了COVID-19的独特症状，包括嗅觉和味觉障碍[66]。然而，关于症状的荟萃分析将在稍后出现[17，63]。此外，大多数年轻COVID-19患者被怀疑无症状[67]。如果新变种的出现在具有可视化的实时公共平台中被追踪和追溯[30，68]，利用这种具有人类移动历史数据的医疗数据[69]，政府和其他当局可以采取迅速和灵活的行动来遏制病毒。4.5. 需要病历注释目前，人们对COVID-19的具体症状知之甚少[70]。对流行病趋势的分析得到了带有医学注释的开源公共数据库的加强。应使用过去人员流动路径的医疗记录来完善病毒-人关系的总体概况，并保持可接受的匿名性[70]。由于部分数据在存款初始时间可用，因此信息可能需要不断更新。SARS-CoV-2和其他新发传染病[71，72]与人类社会经济活动以及环境和生态因素有关。有必要根据人类流动趋势[73]和哨点监测（包括病原体采样和患者病历）将世界划分为可监测区域。世界各地的地方政府应该分享有关病毒性质变化的实时信息，并可以采取区域预防措施，包括谨慎程序，旅行限制和封锁。此外，应解决动物对作为中间传播源的病原体的易感性[74]。除了通过家畜或动物园动物进行动物源性感染的风险评估外，还必须使用受感染动物的简单标签来估计人畜共患病的潜在风险[75，76]。4.6. 其他医学生物信息学传统上，使用数据库来预测其他疾病已经被开发为疾病挖掘方法。可以使用MeSH术语检索文献[77]，并且可以从文献中提取可用数据，包括使用自然语言的病例报告[78]，作为荟萃分析或循证医学（EBM）进行。然而，缺乏语言化的资源可能是循证医学的障碍[79]。通过数字数据进行诊断在评价心电图、基因-表型关联和病理数据[80，81]或放射学图像[78]方面尤其强大。复合表型也可以通过多变量相关性进行评估[82，83]。使用数字注释的自动聚类应该减少忽略相关先前研究或发现的实质性风险。人工智能（AI）可以进一步优化诊断准确性[84]。然而，人工智能可能会面临其他风险，因为在极少数情况下，人工智能会因过度拟合错误而忽视小趋势[84]。病毒和医学注释标签在一个简单的和统一的电子表格格式是更可取的，在未来的进一步分析。医务人员的经验性见解肯定需要详细的注释，这对独特病原体的出现很重要5. 结论目前的数据库已经非常强大和有用，并且可以根据社会医学科学的实施需求进行发展。我们建议使用额外的注释标签的患者是匿名的最大的隐私保护和知情A. Nakashima等人医学信息学解锁21（2020）1004427见图6。 医疗和移动历史的注释标签可以实现全球实时荟萃分析。(a) 与病毒数据相关的当前注释列表缺乏关于宿主患者的医学信息。（b）根据医疗面谈、实验室数据和医疗处理提供电子化注释的丰富格式，并保护隐私。（c）对病毒注释数据的分析（左）揭示了新的亚株的出现、预测的病毒传播跨度和周期关于医疗记录的额外信息使宿主与SARS-Cov-2之间的关系总体上得以细化具有相似临床特征和相同病毒信息的病例的起源可以用过去路径注释标签追溯。此外，带有随访和结局的注释将更新COVID-19的特征，包括严重程度、发病率或独特症状趋势。同意在世界各地无国界地采集病毒基因数据。此外，在单一平台上建立国际数据库合作系统[32，33]也可能有助于应对这一全球性的紧急情况。需要进行紧急的国际讨论作者贡献AN和NN分析了下载的数据。AN和NN讨论了结果，并与其他作者一起撰写了手稿竞合利益作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作确认这项工作得到了石桥科学促进基金会和海原盛和医学科学促进基金会对NN的资助，以及KAKENHI JP 20K 16125对AN的资助。一个谢谢博士。松冈聪（Satoshi Matsuoka）博士在编程方面的建议（福井大学医学科学院生理学系）。Kenji Shigemi（福井大学医学部麻醉科），Kiyonao Sada博士（福井大学医学部基因组科学·微生物学研究室）（福井大学医学部生物化学教室）大森春典博士（京都大学生理学研究科），井上久里博士（京都大学研究生院综合研究训练课程）和时正孝之博士（Kurdom大学医学院生理学系）在进行研究和讨论时提出的建议。对于他们在文件归档和手稿校对方面的帮助，我们感谢Kurdom大学医学院的Hideko Yoshitake和Akemi Sakamoto。附录A. 补充数据本文的补充数据可在https：//doi网站上找到。org/10.1016/j.imu.2020.100442。A. 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