工程6（2020）49研究动物疾病研究-文章人苍白杆菌的首次分离及鉴定顾世江a，#，侯瑞庆a，#，高胜国a，孙哲a，李向东a，翟路峰a，金云云a，朱巧艳a，廖永红a，刘晓波，田克功a，b，刘国家兽医研究中心，洛阳471000b河南农业大学畜牧兽医学院，郑州450002阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2019年2019年7月31日修订2019年8月2日接受在线发售2019年关键词：人苍白杆菌猪脑A B S T R A C T从患有神经系统症状的猪的脑样品中分离到一种革兰氏阴性杆菌。尸检时病理检查显示脑膜炎。人苍白杆菌（O.从脑样品中分离出人），并通过生化反应结果（API 20 NE）和基因测序证实。该菌株对β-内酰胺类抗生素高度耐药。实验用O.并表现出典型的脑膜炎。这是首次报道O. anthropi分离自猪，表明O. 人类可能具有更广泛的宿主感染谱。©2020 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CCBY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍人苍白杆菌（O. anthropi）是一种革兰氏阴性杆菌，在环境中非常丰富。它以前被置于CDC组Vd的类别中[1]，属于布鲁氏菌科[2]。O. 人类以前被认为是一种主要感染免疫功能低下患者的人类条件性病原体[1，3，4]。然而，一些报告指出，O。 人类也可以引起健康人的感染[5-7]。对O.人类感染是眼内炎[6]、心内膜炎、脑膜炎、骨软骨炎、骨髓炎、胰腺脓肿、穿刺伤、盆腔脓肿和尿路感染[8-14]。除人类外，O.据报道，人类感染了其他哺乳动物。Franci等人[15]是第一个报告一只健康的狗感染了O.这发生在常规牙齿清洁后，由于麻醉溶液被O.人类学El-Adawy等人[16]分离O. 从火鸡的盲肠中取出的人类标本。 迄今为止，O. 人类没有报告在任何其他物种中发生。本研究分离并鉴定了一株O.第一次从猪身上分离出人类。*通讯作者。电子邮件地址：ebrain04@163.com（Y. Liao），tiankg@263.net（K. Tian）。#这些作者对这项工作做出了同样的2. 材料和方法2.1. 猪临床样品中细菌的分离猪脑样品获自中国江西省的商业农场。该猪出现神经系统症状，尸检时病理检查显示脑膜炎。对脑组织标本进行组织学检查和细菌分离。在无菌条件下从脑样品中取出拭子以避免污染。将分离物在含有10%新生牛血清（浙江天航生物技术有限公司，有限公司、China）在37 °C下搅拌24 h。根据Gerhardt等人[17]描述的方法进行革兰氏染色。使用API 20 NE测定（bioMérieux Inc.，法国），根据制造商2.2. DNA制备根据制造商的说明书，通过GENEWIZ细菌基因组DNA试剂盒（GENEWIZ，中国）2.3. PCR、基因测序和系统发育树的构建使用Scholz等人先前描述的方法扩增16S rRNA基因和recA[18].前向https://doi.org/10.1016/j.eng.2019.08.0142095-8099/©2020 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志主页：www.elsevier.com/locate/eng50S. Gu等人/工程6（2020）49·×·××× ×··反 向 引 物 27 f （50-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-30 ） 和 1492 r （50-AAGTCGTAACAAGGTARCCG-30）用于产生约1400 bp的16 SrRNA基因片段。聚合酶链反应（PCR）循环的概况如下：94 °C下5分钟，30个循环，94 °C下60秒，56 °C下30秒，72 °C下在72 °C下搅拌90 s和10min。在1%琼脂糖中通过凝胶电泳分析PCR产物。recA的引物是recA-f（ 50-ATGTCTCAA AATTCATTGCG AC-30 ） 和 recA-r （ 50-AGCATC-30）。TTCTTCCGGTCCGC-30）;这些用于获得recA基因的1065 bp大小的条带。 PCR循环如下：94 °C持续5分钟，30个循环，94 °C持续30秒，58 °C持续30秒，72 °C持续60秒，在72 °C下搅拌10分钟。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分 析 。将PCR产物送至GENEWIZ进行测序。通过国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中的BLASTnx对序列进行BLAST（其中BLAST代表基本局部比对搜索工具）。使用了CLUSTAL X[19]第19话你的故事基于16S rRNA基因（rrs）和recA基因，使用MEGA版本5 [21，22]中Kimura双参数模型[20]中的在分支旁边显示了在自举测试中相关分类群聚集在一起的重复树的百分比（1000个重复）[23]。2.4. 基因组测序和BLAST通过NCBI数据库中的BLAST基因组对基因组序列进行BLASTrecA和16S rRNA的部分序列以及苍白杆菌属和布鲁氏菌属的基因组序列保藏在GenBank中，登录号记录在附录A的表S1中。补充数据。2.5. 抗生素敏感性和耐药性检测通过Bauer等人提出的纸片扩散法对分离株进行抗生素敏感性和耐药性试验[24]。将分离的菌株在含有10%新生牛血清的TSA上在37 °C 下 培 养 24 小 时 ， 然 后 在 磷 酸 盐 缓 冲 液 中 稀 释 。盐 水（PBS）(0.01 mol L-1，pH7.2)在1 × 108 CFU mL-1（其中CFU代表菌落形成单位）。 用无菌棉拭子将细菌悬液涂布在含有10%新生牛血清的TSA上，并将抗生素纸片（杭州微生物试剂有限公司，有限公司、中国）置于接种的琼脂表面上。测定前，将平板在35 °C下孵育24小时。 每种药物的区域直径均使用美国FDA公布的标准进行解释。动物细菌的抗菌药物纸片和稀释敏感性试验的性能标准[25]。2.6. 小鼠实验感染研究将分离的菌株在含有10%新生牛血清的TSA上于37 °C培养24小时，然后在PBS（0.01molL-1，pH 7.2）中稀释，以获得约100 μ g/ml的系列悬浮液。5 109BALB/c小鼠腹腔注射0.2mL菌液，每只小鼠1 × 109取小鼠脑组织进行组织学观察。动物试验遵循中国兽医研究中心动物管理和伦理委员会批准的动物方案。2.7. 组织病理学观察将脑样品用10%缓冲福尔马林固定过夜，然后包埋在石蜡中。将脑组织切片并用苏木精和伊红染色以进行组织病理学评价。3. 结果3.1. 组织学检查和细菌分离猪脑样品的组织病理学结果显示脑白质中的坏死结节、灰质神经元坏死和大量中性粒细胞浸润，如图1所示。将脑样品划线接种到TSA平板上以获得纯菌落。菌落小而光滑;革兰氏染色后，菌落中的细胞显示为革兰氏阴性杆菌（图1）。 2）的情况。生化鉴定结果表明，分离菌株为氧化酶和过氧化氢酶阳性。分离株经鉴定为O. 通过API 20 NE试验（表1）检测人类（99.9%概率）。该分离物被命名为JXLH03B。3.2. 序列测定和系统进化分析JXLH03B的16S rRNA基因序列与苍白杆菌属（Ochrobactrumsp.）（GenBank登录号MH201346.1）、O. anthropi（GenBank登录号LT671861.1）和羽扇豆苍白杆菌（Ochrobactrum lupini）。lupini）（GenBank登录号图1.一、猪 脑 样品的组织学观察（苏木精和伊红染色（HE&），20×）。（a）脑白质坏死结节（箭头所示）;（b）灰质神经元坏死（三角形所示）和中性粒细胞浸润（箭头所S. Gu等人/工程6（2020）4951图二.分离株的菌落形态和细胞形态。(a)分离株的菌落形态;（b）革兰氏染色后细胞形态的显微镜检查（100×）。表1JXLH03B分离株的API 20 NE鉴别试验名称反应/酶孵育时间（h）结果NO3硝酸盐还原+TRP吲哚形成-葡萄糖发酵-ADH精氨酸二氢水解酶生产-尿素酶生产+ESC水解（b-葡萄糖苷酶）-凝胶水解（蛋白酶）-PNPGb-半乳糖苷酶-葡萄糖同化24-48岁以上ARA阿拉伯糖同化24-48岁以上甘露糖同化24-48岁以上MAN Mandarin同化24 +48岁以上NAGN-乙酰葡糖胺同化24 +48岁以上麦芽糖同化24-四十八-葡萄糖酸钾同化24 +48岁以上CAP癸酸同化24-四十八-ADI己二酸同化24-四十八-MLT苹果酸同化24 +48岁以上CIT柠檬酸三钠同化24 +48岁以上PAC苯乙酸同化24-四十八-OX细胞色素氧化酶24 +48岁以上API20 NEO。 人类99.9%KU217325.1 ） 。 recA 基 因 也 进 行 了 BLAST 分 析 ， 结 果 表 明 与 O.anthropi（GenBank登录号LT671861.1）。根据16S rRNA基因进行系统发育分析。如图3所示，JXLH03B与O.anthropi LMG 7991，O. anthropi OAB、O. anthropi LMG 5140、O.anthropi LMG 3333 、 O. anthropi LMG 3333T 、 O. anthropi DSM14396，O. anthropi ATCC 49188、O. anthropi 7b2C和O. lupini LMG1821.相比之下JXLH03B与O. anthropi DSM 14396，O. 人苍白LMG3333和O. anthropi 10CS0094，基于recA基因（图1）。 4）。3.3. 基因组测序和BLASTJXLH03B分离株基因组测序结果为2个序列，总长度为4 725913 bp。G + C含量为56.01%。序列1和序列2的长度分别为52S. Gu等人/工程6（2020）49××图3.第三章。基于16S rRNA基因的系统发育分析，使用CLUSTREE相邻连接方法。比例尺：每个位点0.002个不同的残基每个分支的显著性由针对1000个子集计算的自举值指示2 641 072 bp和2 084 841 bp。BLAST结果表明，JXLH03B分离物序列与两个保藏的O.人感染率为97.54%~ 98.08%。3.4. 小鼠实验感染研究JXLH03B以1109每只小鼠4 × 10 -9CFU。小鼠死亡率范围为0/5至5/5（表3）。所有死亡小鼠均取脑组织进行组织病理学检查。感染后死亡的所有小鼠的脑组织都组织病理学结果显示脑内有数个坏死灶。脑实质液化，大量中性粒细胞坏死聚集形成结节（图5箭头所示）。一些神经胶质细胞被发现崩溃（图。 5）。3.5. 药敏试验根据动物细菌抗菌药物纸片和稀释敏感性试验的性能标准指南，使用纸片扩散试验进行抗菌药物敏感性试验[25]。JXLH03B分离株对硫酸庆大霉素、阿米卡星、恩诺沙星、环丙沙星、强力霉素和氟苯尼考敏感，但对青霉素钠、头孢噻呋、硫酸卡那霉素、林可霉素和泰乐菌素耐药（表4）。4. 讨论O.人杆菌是一种需氧的、非乳糖发酵的、能动的、氧化酶阳性的、尿素酶阳性的、革兰氏阴性的芽孢杆菌，被称为“无色杆菌群Vd”[1]。生物化学反应谱（API 20 NE）将JXLH03 B菌株鉴定为O. 人类学的属苍白杆菌 属于到家庭S. Gu等人/工程6（2020）4953图四、基于recA基因的系统发育分析，使用CLUSTRE相邻连接方法。比例尺：每个位点0.01个不同的残基每个分支的显著性由针对1000个子集计算的自举值指示表2JXLH03B与两个不同的O. 人类菌株。O.人类品系染色体GenBank登录号序列相似性JXLH03B序列1JXLH03B序列2ATCC49188OAB染色体12号染色体染色体1CP000758.1CP000759.1CP008820.1百分之九十八点零八-98.08%-97.82%-2号染色体CP008819.1-百分之九十七点五四布鲁氏菌科（Brucellaceae），与布鲁氏菌属（Brucella）有密切的系统发育关系[26];苍白杆菌属（Ochrobactrum）包括约16个种[27]。 应用16S rRNA基因分析对苍白杆菌和布鲁氏菌进行了鉴定和鉴别。 [2，26，27]。 然而，这种方法-特别是部分测序-由于它们的高序列相似性，容易错误识别这些病原体[27]。同时，recA分析提供了更准确的识别和区分[18，27]。我们表演了16S对JXLH03B分离株进行了RNA基因序列比对，不能完全鉴定为O.recA基因测序结果表明，JXLH03B分离株为O. 人类学小鼠感染试验表明，该菌株具有一定的为检测JXLH 0 3B株对猪的致病性，对9头80日龄健康猪进行气管内注射攻毒，攻毒剂量分别为1.2× 109、1.2 × 1010、54S. Gu等人/工程6（2020）49×表3来自感染JXLH03B的小鼠的结果。感染剂量（CFU/小鼠）死亡率4× 109 5/52× 109 3/51× 109 0/5图五.小鼠脑组织标本的组织学观察（HE，20×）。脑内出现坏死灶，中性粒细胞坏死聚集形成结节（箭头所示）。表4JXLH03B分离株的纸片扩散试验值和判读。O.除了碳青霉烯类外，人类对几乎所有的β-内酰胺类抗生素都有耐药性，这部分是由于产生了AmpC β-内酰胺酶[29]。我们的结果表明，JXLH03B分离株对青霉素和头孢噻呋耐药，这与文献报道一致[30]。5. 结论在这项研究中，我们是第一个分离和表征O。从猪身上取人。该细菌能够实验性感染小鼠并导致典型的脑膜炎，这表明O。人类可能具有更广泛的宿主感染谱。确认本工作得到了万人计划（李向东）和洛阳河洛人才计划（田克功）的支持。遵守道德操守准则顾世江、侯瑞庆、高胜国、孙哲、李向东、翟路峰、金云云、朱巧燕、廖永红及田克功声明彼等并无利益冲突或财务冲突须予披露。附录A.补充数据本文的补充数据可以在https://doi.org/10.1016/j.eng.2019.08.014上找到。引用抗微生物剂盘内容区域直径（mm）口译口译类别和区域直径断点（mm）R I S[1] Holmes B，Popoff M，Kiredjian M，Kersters K. 人苍白杆菌属，sp. nov.，以前称为Vd群。Int系统细菌学杂 志 1988;38（4）：406-16.[2] Lebuhn M，Achouak W，Schloter M，Berge O，Meier H，Barakat M，et al.苍白杆菌属的分类学研究。 从土壤样品和小麦根中分离的菌株，以及对三色苍白杆菌和格氏苍白杆菌的描述。IntJ Syst Evol Microbiol 2000;50（Pt 6）：2207-23。青霉素钠10单位0R≤1718–20≥21头孢噻呋30 l g6R≤1718–20≥21硫酸卡那霉素30 l g13R≤1314–17≥18硫酸庆大霉素10 l g35S≤1213–14≥15阿米卡星30 l g34S≤1415–16≥17恩诺沙星10 l g34S≤1213–16≥17环丙沙星5 l g33S≤2021–30≥31林可霉素2 l g10R≤1415–20≥21强力霉素30 l g45S≤1011–13≥14氟苯尼考30 l g38S≤1415–18≥19泰乐菌素30 lg10R≤ 15 16 -2 0 ≥ 21S ： 敏 感 ， R ： 耐 药 ， I ： 中 间 体 。1.2 × 10~（11） CFU/头。然而，攻毒后没有动物显示临床症状，并且在猪脑样品的组织病理学检查中未观察到异常（数据未显示）。因此，我们未能建立JXLH03B O. 人类对健康猪的研究在人类中，O. 人类主要感染免疫功能低下的患者[1，3，4]。我们怀疑O.感染人类的猪可能由于其他病原体感染而导致免疫力下降。在患病猪中检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）（数据未显示）。已知PRRSV可引起免疫抑制性呼吸道疾病[28]。因此，我们怀疑这头猪感染了O。人类由于免疫系统受损而死亡O.人类在土壤和水中广泛分布[2]，因此我们怀疑猪可能是通过这些途径感染的。[3] 放大图片作者：Alnor D，Frimodt-Møller N，Espersen F，Frederiksen W.感染不寻常的人类病原体农杆菌属和人苍白杆菌。临床感染疾病1994;18（6）：914-20。[4] CieslakTJ，Robb ML，Drabick CJ，Fischer GW. 由人苍白杆菌引起的导管相关性脓毒症：1例病例报告和相关非发酵菌的回顾。临床感染与疾病1992;14（4）：902-7。[5] 伯曼AJDelPrioreLV，FischerCK。内源苍白杆菌 人苍白眼内炎 Am J眼科学1997;123（4）：560-2。[6] Braun M，Jonas JB，Schönherr U，Naumann GO. 无并发症白内障手术后的人苍白杆菌眼内炎。美国眼科杂志1996;122（2）：272-3。[7] [10] Galanakis E， Bitsori M ，Samonis G， Christidou A， Georgiladakis A，Sbyrakis S，et al. 免疫功能正常儿童的人苍白杆菌菌血症。 Scand J Infect Dis2002;34（11）：800-3.[8] Romero Gómez MP，Peinado Esteban AM，Sobrino Daza JA，Sáez Nieto JA，Alvarez D，Peña García P.人类苍白杆菌引起的人工二尖瓣心内膜炎：病例报告。临床微生物学杂 志 2004;42（7）：3371-3.[9] Appelbaum PC，Campbell DB.与无色杆菌群Vd生 物 型1相关的胰腺脓肿。 临床微生物学杂志 1980;12（2）：282-3.[10] BarsonWJ，Cromer BA，Marcon MJ. 由CDC组Vd引起的足部穿刺伤口骨软骨炎。J Clin Microbiol 1987;25（10）：2014-6.[11] Chang HJ，Christenson JC，Pavia AT，Bobrin BD，Bland LA，Carson LA，etal. 小儿心包移植受者的人苍白杆菌脑膜炎。J Infect Dis 1996;173（3）：656-60.[12] ChristensonJC，Pavia AT，Seskin K，Brockmeyer D，Korgenski EK，JenkinsE，et al. 人苍白杆菌引起的脑膜炎：一种新出现的医院感染病原体。三个案例的报告。 小儿神经外科1997;27（4）：218-21。[13] Vaidya SA，Citron DM，Fine MB，Murakami G，Goldstein EJ. 免疫活性宿主中中间苍白杆菌引起的盆腔脓肿：病例报告和文献回顾。临床微生物学杂志2006;44（3）：1184-6.[14] Jelveh N，Cunha BA. 人苍白杆菌菌血症。心肺1999;28（2）：145-6.[15] FranciP，Dotto G，Cattai A，Pasotto D. 人类苍白杆菌污染异丙酚导致健康狗洁牙后发生致死性感染性休克。 J SmallAnimPract2015;56（5）：345-7.S. 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