成年斑马鱼内耳再生过程中Sox和Six转录因子调控网络

文章Sox和Six转录因子调控网络在成年斑马鱼听觉再生过程图形摘要亮点d听觉再生期间斑马鱼内耳的整合scRNA-seq和scATAC-seqdSox转录因子触发支持细胞dSox和Six因子在毛细胞分化过程中空间协同作用D 一个重要的增强子控制sox 2再生过程中的表达作者作者：Claire C. Slevin，WeiSong，...，阿卜杜勒·G 埃尔卡伦放大图片创作者：Shawn M.伯吉斯对应burgess@mail.nih.gov简言之Jimenez等人询问再生成年斑马鱼内耳感觉上皮的表观基因组和转录组景观。他们表明，支持细胞群体转变为中间的“祖”细胞状态，成为新的毛细胞，他们证明细胞命运的决定可能是由Sox和Six转录因子的协调调节和空间共结合驱动的。通过对sox2上游预测的再生响应增强子进行功能验证，他们发现sox2表达的精确时间对于斑马鱼的听觉再生至关重要。Jimenez等人，2022，细胞基因组学2，1001702022年9月14https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100170会会开放获取文章Sox和Six转录因子的调控网络启动细胞命运转变在成年斑马鱼艾琳·希门尼斯，1克莱尔·C。Slevin，1Wei Song，4Zelin Chen，2，3Stephen C.Frederickson，1Derek Gildea，1Weiwei Wu，5Abdel G.Elkahloun，6Ivan Ovcharenko，4和Shawn M.伯吉斯1，7，*1国家人类基因组研究所翻译和功能基因组学分会，美国马里兰州2中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室，中国科学院南海海洋研究所，中国3南方海洋科学与工程广东省实验室，广州，中国4计算生物学分部，国家生物技术信息中心，国家医学图书馆，国立卫生研究院，Bethesda，MD 20894，美国5疫苗免疫学项目，疫苗研究中心，国家过敏和传染病研究所，美国马里兰州6癌症遗传学和比较基因组学分部，国家人类基因组研究所，美国马里兰州7引线触点* 通讯地址：https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100170burgess@mail.nih.gov总结使用成年斑马鱼内耳作为感觉神经再生的模型，我们消融了机械感觉受体，并在毛细胞再生过程中的连续时间点表征了单细胞表观基因组和转录组我们对再生诱导的开放染色质序列进行了深度学习，并确定了细胞特异性转录因子（TF）基序模式。增强子活性与基因表达相关，并确定了潜在的基因调控网络。Sox和Six家族TF基因表达和结合基序重叠的模式被检测到，表明TF驱动再生和细胞身份的组合程序。单细胞转录组数据的伪时间分析表明，感觉上皮内的支持细胞将细胞身份改变为可以分化为毛细胞的“祖细胞”群体。我们确定了一个2.6 kb的DNA增强子上游的sox2启动子，删除时，表现出显性表型，导致毛细胞再生特定的缺陷，在侧线和成人内耳。介绍损伤后组织再生的能力在脊椎动物谱系中表现不均匀。[1]在大多数哺乳动物中，持续的细胞更新仅限于某些细胞类型，如皮肤、肠道和血液，而主要的组织再生甚至进一步限于少数器官，如肝脏。哺乳动物内耳感觉上皮的损伤是不可逆的，并导致永久性听力丧失或前庭缺陷。有趣的是，这是一个特征，使哺乳动物与大多数其他脊椎动物不同，这些脊椎动物可以在其一生中不断产生新的毛细胞（HC）和/或可以再生它们以应对创伤。HC是机械感觉受体，用于所有脊椎动物的内耳听觉和前庭器官以及水生脊椎动物的侧线系统2在鱼类中，这些器官分别是球囊和椭圆囊（图S1A）。3鱼的球囊主要检测声音振动（通过身体而不是通过耳膜放大），而椭圆囊主要起重力传感器的作用，但也显示出一些听觉潜力2，4类胡萝卜素类似于内耳中的胡萝卜素，也位于鱼类和两栖动物皮肤上的称为“神经丘”的小结构中，2，3尽管侧线毛细胞与成人内耳相比在形态上不同，但皮肤表面上侧线毛细胞的可接近性使其成为受欢迎的体内模型。然而，更多的努力是有道理的，在研究内耳HC再生的鱼类的目标是恢复失去的听力哺乳动物。内耳发育中的关键基因也可以在再生中发挥重要作用。5然而，再生不同于胚胎发育6，最近的全基因组分析表明，虽然再生程序可能靶向许多相同的基因，但它们可能通过不同的调控序列来实现：7，8Rodriguez et al.9和Yang et al.10增强子元件在控制发育中是至关重要的，11并且几个小组已经在增强子调节和组织再生程序之间建立了联系。损伤应答或再生相关增强子指导损伤组织中的基因表达，已在再生组织中鉴定出。细胞基因组学2，100170，2022年9月14日1这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。会开放获取文章2Cell Genomics2，100170，2022斑马鱼心脏和鳍。7，9，12-7，13，21然而，这些研究中增强子的消融表明，即使这些增强子对损伤有反应，它们通常对于正常再生不是必需的。在此，我们以单细胞分辨率分析了斑马鱼内耳再生过程中染色质 可 及 性 （ scATAC-seq ） 和 基 因 表 达 单 细 胞 30RNA 测 序（scRNA-seq）的变化我们发现支持细胞（SC）可能转变为“祖细胞样”状态，分化为新的我们还确定了sox2表达的关键调节因子，当其被删除时，HC正常发育，但损伤后HC再生被显著破坏。结果scRNA-seq鉴定内耳中的不同细胞群我们使用Tg（myo6b：hDTR）转基因斑马鱼，其允许成年斑马鱼内耳中HC的条件性和选择性消融。Tg（myo6b：hDTR）转基因在HC特异性myo6b启动子的控制下表达人白喉毒素受体（hDTR ）基因。用白喉毒素（DT）注射处理成体异型Tg（myo6b：hDTR）斑马鱼导致注射后5天球囊和椭圆囊中HC的广泛消融，而不消融相邻的sox 2阳性支持细胞22（图S1B）。我们表征了成年斑马鱼感觉上皮中与HC消融反应相关的基因表达谱（scRNA-seq）和可接近区域图谱我们在消融后的三个时间点解剖出球囊和椭圆囊：DT后第4、5和7天，并且处理每个样品用于scRNA-seq或scATAC-seq实验。第4天对应于凋亡程序启动后的最大HC清除。第5天对应于HC仍然不存在，但再生已经明显开始。第7天对应于HC开始重新填充感觉上皮的时间（图S1C和S1D）。为了控制hDTR转基因和DT的存在，将未处理的Tg（myo6b：hDTR）转基因斑马鱼、未处理的野生型鱼和野生型DT注射（第4天）的斑马鱼用作非再生对照。随后的单细胞分析需要在每个时间点对非再生和再生感觉上皮细胞进行成对比较。我们使用10 x Chromium系统针对基于液滴的scRNA-seq在非再生和再生内耳组织（球囊和椭圆囊）上生成了12个单独的转录组谱，并使用Cell Ranger定量分析仪对每个数据集进行定量。6.0.0管道（10x Genomics）。在用Seurat过滤后，23，24我们整合了来自所有12个样本的scRNA-seq数据集用于细胞类型聚类，以基于保守基因表达鉴定细胞类型，并证明所有12个样本聚类在一起成为成年斑马鱼内耳感觉上皮细胞的协调图谱。23、24个样本被组装成一个聚合体或聚类将66，296个内耳感觉上皮细胞（球囊和椭圆囊组合）分成离散的scRNA-seq细胞群（图1A;表S6）。我们基于来自内耳细胞的斑马鱼转录组数据和来自幼虫侧线的单细胞转录组数据，基于标记基因的已知表达，将对于每个细胞群，我们鉴定了特异性表达或高度富集的基因（图1B）。使用Seurat预处理和整合程序，我们选择了在簇之间可变的基因。我们将与HC密切相关的细胞类型分配为：SC和祖细胞（PC）。我们检测到两个群体的SC：簇0（SC 0）和簇2（SC 2）。聚类0（SC 0）显示标记si：ch 211 -80h18.1和serpine 2的显著富集，而聚类2（SC2）显示标记krt18a.1和tnfrsf 11b的富集（图1D）。我们观察到表达her4.1、her15.1和dla的PC的不同中间群体（图1E）。PC属于群集1（PC1）和群集3（PC3）。该细胞群包括循环细胞（PC1）和非循环细胞（PC3）。簇4（HC 4）和簇5（HC 5）包含HC并表达atoh1a、s100t和pvalb8基因（图1F）。没有其他细胞簇表达HC谱系基因。簇4（HC 4）被鉴定为年轻HC，因为该簇显示标记rpl的显著富集，并且基因的GO分析显示翻译和核糖体组装的富集，而簇5（HC 5）没有。由于核糖体蛋白的合成在侧线神经肥大的成熟HC中被关闭，因此簇5（HC 5）被鉴定为成熟HC。25所有其他簇中的细胞代表多个非感觉细胞群，如免疫细胞，其不直接促成HC，并且无论是否存在，他们对HC损伤有反应。成体内耳细胞在转录上不同于幼虫横向线细胞斑马鱼侧线经常被用作HC再生的模型，因此我们检查了两个器官在再生程序方面有多少重叠。成体内耳感觉上皮与先前荧光激活细胞分选纯化的幼虫侧线神经瘤表现出明显差异（图S2;表S1）。27细胞簇存在强烈的分离，并且簇内细胞的混合有限（图S2A和S2B）。图S2C突出显示了成人内耳的SC、PC和HC的不同基因表达谱。结果与幼虫神经瘤和成虫内耳之间细胞的显著转录差异一致（图S2D）。斑马鱼内耳球囊和椭圆囊基因表达的相似性我们比较了球囊和椭圆囊scRNA-seq实验，以鉴定这两个器官之间独特或共有的细胞类型，以获得保守的细胞类型标志物，并在再生感觉上皮中发现细胞类型特异性反应（图S3;表S2和S3）。28尽管形态学特征不同，但球囊和椭圆囊感觉和非感觉细胞在转录上相似并且紧密地聚集在一起（图S3A;表S2）。我们测试了是否有显著的Cell Genomics2，100170，2022年9月14日3会开放获取文章图1.听觉和前庭上皮的scRNA-seq鉴定基因表达(A) 左：从12个样品收集的15，443个单细胞的scRNA-seq UMAP每个点代表单个细胞，颜色区分样品。中间：基于已知的细胞标志物对细胞单个联合聚类检测11个细胞群。簇0至5由对感觉上皮有贡献的细胞组成：支持细胞（SC）是簇0（SC 0）和2（SC 2）;祖细胞（PC）是簇1（PC 1）和3（PC 3）;毛细胞（HC）是簇4（HC 4）和5（HC 5）。右：为scRNA-seq收集的样品的标识符和细胞计数S，球囊; U，椭圆囊; DTR，杂合Tg（myo 6 b：hDTR）转基因斑马鱼;天，DT注射后的天数，总计66，293个采样细胞。(B) 热图显示来自每个簇（X轴）的前10个差异表达基因（y轴）的相对表达水平。分配给每个簇的细胞群体身份在每个列上方指示，并且颜色对应于（B）中的簇。(C) 最显著标记基因表。（再生球囊和椭圆囊scRNA-seq实验之间的差异，以确定听觉和前庭感觉上皮的再生程序是否存在分歧（图S3B;表S3）。我们广泛地观察了在再生球囊和椭圆囊细胞类型之间的基因表达中，发现非常少的基因不同（图S3C;表S4）。我们发现，基因表达变化在三个主要细胞群体的数据集之间4Cell Genomics2，100170，2022会开放获取文章HC21046PC18PC1259SC0311SC7HC210PC1846 12PC59SC0311SC7A叠加1050非再生再生合并HC集群0 71 82 93 104 115 126-5-10B1050-5-10-10-50510UMAP_1非再生-10-5 0 510UMAP_1再生HC集群0 71 82 93104115126150010005000非再生再生−10 −5 0 510−10 −5 0 5 10SC PC HCUMAP_1CDsix1b43210Notch33210S100吨6420pou4f143210pax2a43210奥托格尔43210S100s6420myo6b3210her664205atoh1a432104six1a3210Sall1a3210非再生再生（图例见下页）HC263SC33010291388265484407PC感觉细胞群细胞类型非再生SC 1303PC 827HC 236再生5761119939HC210PC1846 1259SC03117表达水平表达水平表达水平表达水平UMAP_2再生反应基因UMAP_2细胞数Cell Genomics2，100170，2022年9月14日5会开放获取文章有助于HC再生的细胞：SC、PC和HC（图S3C;表S5）。我们使用Seurat对球囊和椭圆囊数据集之间的细胞类型进行了差异表达（DE）测试与Yao等人的观点一致，30我们观察到wnt11（以前的wnt 11 r31）、sema 3e、otol 1a和nr 2f 1以及vwa 2的表达水平在再生或非再生球囊中总体升高，但这些基因在再生期间在SC、PC或HC簇中没有差异表达（表S5）。由于器官之间的再生程序非常相似，我们将球囊和椭圆囊数据结合起来进行后续分析，以增加细胞样本量并提高统计功效。斑马鱼成年内耳的不同再生反应我们的scRNA-seq揭示了以细胞类型特异性方式的再生响应性转录。使用Seurat，我们整合了非再生对照和所有再生条件（第4、5和7天）（图2A，重叠图）。然后，我们确定了细胞类型特异性的再生反应。我们辨别出13个不同的细胞群（图2A）。单个细胞类型的均匀流形近似和投影（UMAP）显示，非再生和再生组织中的细胞聚集在一起，并且所有HC谱系群体均存在于稳态和HC再生期间（图2B）。通过从每个样品中随机取相同数量的细胞，我们评估了与非再生对照相比，再生感觉上皮中每个簇中的细胞数量。再生的内耳表现出SC总数（SC 0）的下降、PC（图2B中的PC 1）的增加和HC（HC 2）的增加（图2B）。尽管与非再生组织聚类，但与稳态对照相比，每种所有稳态对照（未处理的DTR鱼和第4天注射DT的野生型鱼）细胞群基本上相同，并最终合并用于进一步比较。通过使用Seurat对对照和再生数据集之间的细胞类型进行DE检验，我们确定了对照和再生SC之间表达改变的2，266个基因 ， PC 中 为 2 ， 564 个 ， HC 中 为 3 ， 164 个 （ p 0.1; FCR0.25）。所有三种细胞类型共有1，388个差异表达基因（图2C;表S7）。HC消融后，观察到HC谱系中涉及的感觉上皮细胞的整体转录变化（p 0.01; FC> 0.25）。基因pax2a和six1b在所有再生感觉细胞类型中上调：SC，PC和HC。SC和PC显示her6（哺乳动物Hes 1）的上调。PC显示notch3上调，耳道1. HC特异性基因，如atoh1a和s100t，在PC和HC再生过程中上调。最后，HC以s100 s、six 1a、pou 4f 1和myo 6 b的上调为标志（图2D;表S7）。时间基因调控模式在HC通过反向图形嵌入，Monocle 3可以测量“伪时间”中的细胞命运变化（图3A）。参与HC再生和分化成15个不同亚群的32个Monocle 3分组细胞，并且基于它们的基因表达谱将细胞类型分配到每个群（图3B）。使用轨迹图，我们根据细胞在再生程序中的进展对细胞进行排序（图3B）。SC具有最早的发育阶段分配，并被指定为轨迹的根。基于所有其他细胞类型与轨迹根（SC）的距离计算它们的伪时间，并且沿轨迹的细胞可视化显示两种状态（SC和HC）之间的转换。作为连接SC和HC的中间分化状态的群体是PC。在UMAP簇中在假时间中早期（在SC中）和晚期（在成熟HC中）表达的基因的实例显示在图3C中。我们观察到关键调控因子表达的开关样变化，如cldn7b、her4.1（哺乳动物中的Hes5）和atoh1a。细胞的伪时间排序表明，一些基因在SC中很早就起作用，然后关闭（如cldn 7 b），而其他基因则显示动态的时间活动，在PC和/或新指定的HC中打开，然后关闭。我们将所有在簇中变化的基因，并将具有相似表达模式的基因分组到基因模块中（图3D）。我们鉴定了9个共表达模块，其代表在HC再生期间共享相似表达模式的基因，并显示在再生过程的各个阶段上调的基因（图3E;表S8）。所鉴定的共调节基因的模块对某些细胞簇是特异性的我们进行了GO丰富-对每个模块的分析（表S8）。模块1针对未成熟的HC，而模块3针对成熟的HC。在模块1中分组的基因参与HC分化和声音的感觉感知。模块3基因参与mRNA剪接、rRNA加工和翻译。模块3中的基因包括许多负调控基因，如six1b和atoh1a，已知它们在成熟HC中下调。模块5是PCs特异性的，涉及核糖体生物合成的基因.模块2专门针对在册种姓和在册部落。在模块2中分组的基因包括缺口非依赖性（hes2.2和hes2.3）基因。图2.再生过程中HC谱系群体的细胞类型特异性基因表达和扩增(A) 左：UMAP显示非再生和再生感觉上皮之间的内耳细胞的覆盖。颜色区分条件。右图：根据基因表达将不同条件下的细胞进行UMAP分组，检测13个细胞群。簇0由SC（SC 0）组成。群集1由PC（PC1）组成。簇2由HC（HC 2）组成。(B) 左：非再生和再生条件的UMAP图并排。颜色区分（A）中标记的簇。中间：来自非再生对照（合并的野生型、未处理的Tg（myo6b：hDTR）和注射DT的野生型鱼）的3，670个随机取样的单细胞的在注射后第4、5和7天从再生样品中随机取样的3，330个单细胞的UMAP样品包括囊和椭圆囊。右：非再生和再生SC、PC和HC中细胞数量的表格和条形图(C) 文氏图显示了HC、SC和PC中重叠和独特的差异表达基因。(D) 小提琴图显示了通过细胞类型间差异表达检测鉴定的主要基因的基因表达分布（p 0.01; FCR 0.25）。6Cell Genomics2，100170，2022会开放获取文章A BPCSCPC集群伪时间SCHCSC01-2-4-6-20HC24UMAP_1伪时间10.07.55.02.50.060-2-4HC-6-20246UMAP_1192103114125136147158伪时间中的C基因SC1.000.100.0110.00PCHC阿托赫1acldn7b阿托赫1acldb7b模块2模块4模块5模块6表达评分210-1-61.000.10模块7模块80.0110.001.00her4.1her4.1模块9模块10.10模块30.010 4 8 12伪时间E1 2 30-2-4-64 5 60-2-4表情评分302010-67 8 90-2-4-6-20246-20246-20246UMAP_1图3. 内耳的细胞谱系(A) 示意图说明成年斑马鱼内耳的伪时间细胞排序。内耳HC谱系群体根据其聚类成员被着色，并以伪时间顺序显示。（图例接下页）DSCPCHCSCPCHCexpression第9第1第7集群13簇10第6第8第2第4簇14第3类组11集群15类组12UMAP_2UMAP_2UMAP_2会开放获取文章细胞基因组学2，100170，2022年9月14日7Hes 6 ） 和 Notch 依 赖 性 （ HER4.1 、 HER4.2 、 HER4.3 和HER4.4）因子：Notch 1a/b、SOX 10和Otog 1。与模块2相关的GO术语为侧线系统发育和上皮细胞连接组织/形态发生。模块4对在册种姓具有高度特异性。在模块4中分组的基因包括哺乳动物HES1相关基因her6和her9，相关GO术语转录负调控，这意味着在再生期间PC中her我们提出，模块2和4可能是重要的，允许SC和PC进行细胞状态转换。33scATAC-seq揭示了再生过程中染色质可及性的我们进行了scATAC-seq来探索再生的成年斑马鱼内耳的染色质可及性我们获得了11个scATAC-seq图谱（图4;表S9）。基于与在类似样品上进行的批量ATAC-seq的相关性评估数据集的质量我们发现scATAC-seq图谱的聚集体与大量ATAC-seq样品非常相似，表明数据具有足够的质量。我们过滤并处理了得到的染色质数据。24然后，我们整合了来自所有11个单独样品的scATAC-seq数据集，23，24这产生了具有11个单细胞表观基因组簇的数据集（图4B，UMAP图）。使用无监督聚类方法，将细胞核聚类，并基于表达基因附近的可及性鉴定细胞类型（图4C;表S10）。簇比scRNA-seq测量值更嘈杂，因为scATAC-seq代表来自稀疏染色质数据的测量值34我们使用用于交叉模态整合和标记转移的方法将scATAC-seq与scRNA-seq概况整合（图4D）。基于scRNA的分类与scATAC-seq UMAP可视化一致，表明两种模式之间共享的相关模式和匹配的生物学状态（图4D，右UMAP图）。再生响应元件我们确定了区域，提出了更高的可访问性再生过程中相比，控制和命名这些地区的再生响应元件（RRE）。为了表征RRE，我们从未处理的内耳球囊和椭圆囊获得sc-ATAC-seq数据以代表组织的基础状态。我们确定了集群之间的差异可访问的峰值。为了鉴定RRE，我们去除了未处理和处理样品之间共有的共同峰，仅留下细胞类型特异性的新出现的峰。使用这种方法，我们在SC中鉴定了12，369个RRE，在PC中鉴定了13，528个RRE，在HC中鉴定了12，597个RRE（图5A;表S11）。PC和HC的染色质可及性比SC与PC或HC的重叠程度高得多。为了理解出现的峰的功能，我们应用GREAT分析来注释峰并预测推定的调控区的功能（图S4）。35GREAT分析表明，约19.5%出现的峰的GO功能注释鉴定了来自所有三种细胞类型的峰与侧线和内耳发育或分化相关，例如机械感觉侧线系统发育（p %6.2061e为了确定来自scATAC-seq分析的细胞特异性开放染色质区域是否与细胞特异性基因表达相关，我们开发了一种计算策略来推断增强子与基因的关系。我们研究了在基因的转录起始位点（TSS）周围的窗口（距TSS±50 kb）中的增强子在多大程度上预测基因的表达（图5B）。图5C显示了sox2基因座的实例对于HC，13，966个基因与峰相关，对于SC，13，709个基因与峰相关，而在PC中，13，874个基因与峰相关（表S12）。 接下来，我们将RRE与基因表达的变化相关联，进行再生。我们发现染色质可及性与附近/远端基因表达之间存在明显相关性，其中60%我们在PC中鉴定了1，546个差异基因（DE基因的60.2%）与至少一个RRE峰相关（p7.53 e-167，超几何检验），36个1，497个SC基因（DE基因的60.0%）（p 2.03 e-249，超几何检验）和2，032个HC基因（DE基因的64.2%）（p 2.73 e-310，超几何检验）（表S14）。为了进一步分析，我们选择了与DE相关的RRE组（无论该基因是否是与RRE最接近的基因），假设该子集将富集直接调节基因表达的调节区。RRE与保守的非编码元件相关保守的非编码元件（CNE）是编码区之外的序列一个序列在进化过程中保守的时间越长，它具有保守功能的可能性就越高。ATAC-seq重叠(B) 左：通过HC再生程序进行的细胞。箭头表示从紫色到黄色的伪时间微分梯度的轨迹。SC是轨迹图的根节点，PC在HC损伤后出现，并且是SC和HC的明显右：UMAP显示在伪时间的重新聚类之后HC谱系群体分成组（对于Louvain聚类，分辨率=13 e-2亚群3、5、11、12、14和15属于SC。子群集2、4和8属于PC。亚群1、6、7、9、10和13属于HC。箭头指示转录上不同于SC的第一PC簇（簇4）(C) 选择基因的基因表达动力学作为SC、PC和HC的假时间的函数颜色区分属于SC、PC和HC群体的亚群通过轨迹差异表达的选择基因的相邻UMAP图。(D) 在HC起始、进展和成熟期间沿着伪时间共调节的基因模块的离散热图显示了9个模块及其在每个簇中的簇对应于水平轴上所示的细胞群体。(E) 映射显示在特定集群中表达的模块，而其他模块在伪时间的多个状态中共享会开放获取文章8Cell Genomics2，100170，20222KBdanRer1129，591，500 29，592，500 29，593，500 29，594，500 29，594，500 29，595，500 29，595，500 29，596，000联系我们UMAP_2UMAP_238A图书馆ID细胞编号未处理WT S 5264未处理 WT U 1535 未 处 理DTR S 4320未处理DTRU 2432第4天WT S261第4天DTR S225第4天DTR U398第5天DTR S15982第5天DTR U5409第7天DTR S3267第7天DTR U3187chr8GRCz11BTSS5周围的插入物粒度分布富集UMAP图50k40k30k20k10k0k10086-542-10未处理DTR S未处理DTR U未处理WT S未处理WT U第4天WT S第4天DTR S第4天DTR U第5天DTR S第5天DTR U第7天DTR S第7天DTR U200400插入尺寸600-1000-5005001000十点五分0 5 10UMAP_1CscATAC-seq簇DHC5HC13HC20台PC6091102115312413514615716SC0SC1SC7SC集群0-5SC11PC 10PCSC12SC81701PC 224PC5-10-10-50SC4-5SC5 106HC47HC910-505-505UMAP_1UMAP_1UMAP_1图4.再生过程中听觉和前庭上皮的scATAC-seq(A) 左：为scATAC-seq收集的样品的标识符和细胞计数S，球囊; U，椭圆囊; DTR，杂合Tg（myo 6 b：hDTR）转基因斑马鱼;以及Day，DT注射后的天数（总计= 42，278个细胞）。右：atoh 1a基因座的基因组浏览器跟踪，突出显示了将单细胞数据与批量ATAC-seq进行比较的注释峰(B) 左图：文库片段大小分布显示核小体带型。中间：测序读数显示在转录起始位点（TSS）周围的强富集。右：所有样品之间显示出高样品一致性。(C) 所有scATAC-seq样品的聚集体，包括未处理的样品。集群4、11和12由SC组成：SC 4、SC 11和SC 12。群集6和群集10由PC组成：PC6和PC10。簇2和13由HC：HC 2和HC 13组成。(D) 左：UMAP共嵌入在同一图上显示scATAC-seq和scRNA-seq细胞。右图：RNA簇组在ATAC-seq数据中保持凝聚力。SC群体是聚类0、1和7：SC 0、SC 1和SC 7。PC细胞群是簇2：PC2。HC种群为第4类：HC 4。具有CNE的峰意味着功能显著性。37为了进一步验证这些数据和鉴定出的增强子在体内发挥功能作用的可能性，并利用进化序列保守性作为筛选器来寻找推定的基因调控元件，我们用Chen等人比较斑马鱼和几种鲤鱼的CNE数据，再次鉴定了与不同基因表达相关的38（图5D;表S13）。我们发现保守的非编码区和RRE峰之间有明显的重叠，这些重叠与我们的研究中鉴定的至少一个差异表达基因scATAC-seq和scRNA-seq数据（SC：p 2.93 e-178; PC：p3.53 e-134; HC：p 2.03 e-193，超几何检验）（图5E;表S14）。这些数据一起鉴定了在HC再生期间强烈富集的转录控制作用的顺深度学习识别关键调控基序和潜在的协同调控盒机器学习可以准确识别增强子序列ATACRUMAP_2ATAC-seq片段计数（线性标尺）散装单细胞相对富集会开放获取文章细胞基因组学2，100170，2022年9月14日7从原始序列数据中从头开始39、我们建造了会开放获取文章Cell Genomics2，100170，2022年9月14日9一基序分析TFBS相关性峰与基因相关性HCBscATAC-seqscRNA-seqC刻度chr22：Sox 2基因座重叠窗口内的所有scATAC-seq峰-50 kb+50 kbscATAC-seq峰与scRNA-seq的相关性-50 kb+50 kbSSSCPCZF/C/GF_CN缺失区域D250020001500与峰连接+/-50 kb与峰连接+/-50 kb CNEE超几何检验p值DE基因与峰值DE基因与Peak + CNESC2.1 x e-2492.9 x e-178PC7.5 x e-1673.5 x e-134HC2.7 x e-3102.0 x e-19310005000SC PC HC图5.scATAC-seq峰与保守区域和差异表达基因的相关性(A) 在SC、PC和HC中识别的再生响应元件（RRE）的维恩图(B) 用于将近端和远端DNA元件中的scATAC-seq峰与基因连接的方法的示意图(C) sox 2基因附近的峰之间的预测联系示意图。对于每种细胞类型，显示了一个轨迹，包括非再生对照（SS，稳态）中存在的峰，来自基因组四向phastcons（Z，斑马鱼; C，草鱼和鲤鱼; GF，金鱼）的保守非编码元件（CNE），以及sox 2hg 138突变体中的缺失区峰、CNE和缺失区的基因组坐标由黑色条表示。(D) 条形图显示了每种细胞类型中差异表达基因（蓝色）50 kb内的RRE数量和与CNE（红色）重叠的RRE数量。(E) 差异表达（DE）基因与峰和峰与CNE的交叉点具有统计学显著性（p 0.001）。预测模型，以确定在RRE中是否发现富集的转录因子结合位点（TFBS）。使用59，785个参数的4层深度学习（DL）模型，通过整合来自Danio-CODE的与增强子活性相关的特征进行训练，40然后将这些模型应用于RRE（表S15）。该模型显示，Six和Sox基序以细胞特异性方式在我们的数据集中显著富集（图6A）。此外，DL显示，Sox因素是更 强 烈 地 富 集 SC （ 图 6B ） ， 并 显 示 与 Pdx 1 、 Foxd 3 、Cebpa、Ebf 1和Rest基序显著共现。在PC中，Sox和Six位点显著富集，并且两者经常与Creb 1或Fos/Ap 1共同出现，但彼此不存在。在HC中，Sox位点显示与Six 4以及Creb 1和Fos/Ap 1显著共发生（TFBS的相关性p 0.001）（图6A）。我们将RRE分为四类，仅包含Sox基序，仅包含SixPCSC63177059039 17905150144159812KBdanRer1137,346,00037,347,00037,348,00037,349,00037,350,00037,351,00037，352，000Sox2RREs差异表达基因CNE/链接缺失峰基因会开放获取文章10Cell Genomics2，100170，2022STAT1FOS/AP 1/NFE2L2POU5F1RESTEBF1CEBPASOX 10/SOX9FOXD3支持细胞祖细胞毛细胞PDX1FOXD 3SIX4POU5F1FOS/AP 1/NFE2L2CREB1SOX10/SOX9SOX9/SOX2/SOX10CEBPAIRF1EBF1FOS/AP 1/NFE2L2休息SIX4SOX9/SOX2/SOX10HNF1BFOXD3POU5F1FOS/AP1/NFE 2L2 STAT1CREB1STAT3EBF 1IRF1/IRF2PBX1/ONECUT POU5F1B20001500Sox连锁基因C六个连锁基因Sox六连锁基因没有Sox Six相关基因p值0.00110005000SC PC HC图6.Six和Sox TF的组合可达性由不同的小区标识定义(A) 成对预测TF在SC、PC和HC中的共缔合x和y轴显示显著富集的预测TF结合位点。灰色框表示TF之间缺乏TFBS的相关性p 0.001。(B) 与SC、PC或HC中差异表达基因相关的含Sox和/或Six TF基序的增强子含TF基序的类别包括含Sox基序、含Six基序、含Sox基序和含Six基序，或两者都不含。(C) 具有协同作用的Six和Sox TF的模型，其充当干细胞促进因子或HC促进因子。在一些实施方案中，Sox基序包含Sox基序和Six基序两者，或既不包含Sox基序也不包含Six基序（图6B;表S16）。我们在SC中检测到一个清晰的模式，其中71%的与SC中差异表达基因（1，498个基因）相关的增强子具有Sox基序。尽管PC比SC具有更多的总峰，但在四个类别中总共少了944个基因关联，并且没有明显的偏好模式。这种模式可能与处于转变中HC具有与增强子元件相关的最多的总差异表达基因，其中最大的类别是含有Sox和Six基序的峰第二大类HC既没有Sox也没有Six基序。在SC中，Sox连锁基因的最高GO富集术语是：HC Six/Sox连锁基因的最高GO富集是：基于scRNA-seq数据和DE测试，我们确定了哪种Sox和Six因子在每种细胞类型中表达，以将可接近的结合位点与可用的转录因子（TF）相关联（图S5A）。与假时间分析一致，Sox基因动态表达（图S6）。Sox基因sox 4a、sox 4 b、sox 11 a和sox 21a均显示DE变化，six 1a、six 1b、six 4a和six 4 b也显示DE变化（p 0.01; FCR 0.25）（图S5B）。基因，如sox10和sox11a，是SC标记。在SC中，尽管sox 10几乎未受影响，但sox 11 a（p<1.64 3 e-5; FC=-0.77 ） 和 sox 4 b （ p <1.04 3 e-20; FC = -1.48）在HC再生期间表达减少。sox 4 b在PC（p2.033 e-12; FC= -0.79）和HC（p1.043 e-20; FC =-1.48）。sox 2和sox 21 a的变化是轻微和局部的。根据伪时间分析（图S6），这仅限于PC，表明它们是状态变化的关键驱动因素，而两种six 1基因，但特别是再生和非再生组中的six 1b（p2.343 e-6; FC = 0.57），在HC中表达非常强烈（p0.01; FC > 0.25）（图S5B）。支持细胞祖细胞六毛细胞SOX SIXSOXSox基因Sox基序基因Sox基序六基序基因Sox基序基因六基序差异表达基因EBF1STAT3CREB1IRF1SOX9/SOX2/SOX10POU5F1SIX4POU5F1PBX1/ONECUTIRF1/IRF2FOXD3HNF1BSOX9/SOX2/SOX10SIX4CREB1FOS/AP 1/NFE会开放获取文章Cell Genomics2，100170，2022年9月14日117 dpf再生一2618 bp删除b5dpf幼虫15C400成人球囊hg138/hDTR3001020051000WTsox2hg138/+DSox2mRNAsox2hg138/sox2 hg1380第五天第七天第九天第十一天第二十三DT后天数ESox2mRNA2.01.5sox2hg138/+sox2hg138/sox2hg1382.5hDTRhg138/hDTR2.01.51.01.00.50.50.0sox2hg138/+ sox2 hg138/sox2 hg1380.0第四天第五天第七天第九天第十一FRREsox2*sox2野生型增强子Sox2增强子时间（图例见下页）Sox2RRE重量2618 bphDTR（对照）平均毛细胞/神经肥大与对照组相比的倍数变化平均鬼笔环肽标记毛细胞/2.5 mm2与对照组相比的倍数变化会开放获取文章12Cell Genomics2，100170，2022六个家族成员在哺乳动物HC分化中具有已证实的作用41，并且Six1的敲除导致内耳发育缺陷在小鼠中，Sox 2在感觉神经发育中具有已知的作用，并且在HC PC和SC中表达，直到其在分化后下调。43观察到的基序富集模式表明从SC中Sox驱动的基因表达到HC中Sox/Six共调节的表达的显著转变。与PC中出现的峰值相关的差异表达基因的数量相对较少，这与它们是SC和HC之间的瞬时状态一致，其中染色质打开以