短文利用基因工程锌指转录因子对人类微卫星重复序列进行图形摘要亮点d工程化ZFA融合体可以有效地靶向人类基因组dEWS-ZFA重现了尤文肉瘤中GGAA重复序列的全基因组激活dKRAB-ZFA沉默GGAA重复序列并诱导尤文肉瘤细胞dZFA融合是重复序列作者Y. Esther Tak，Gaylor Boulay，LukuoLee，.，Nicolo`Riggi，J. 作者：Michael N.里维拉通信nicolo. chuv.ch（N.R.），jjoung@mgh.harvard.edu（J.K.J.），mnrivera@mgh.harvard.edu（M.N.R.）简言之在生物学和疾病中对重复序列进行功能注释仍然具有挑战性。Tak等人表明基于工程化锌指阵列的融合可以靶向整个基因组的微卫星，并在癌症模型中调节它们的活性，从而阐明对这些微卫星的全基因组功能的见解，并提出潜在的治疗策略。Tak等人，2022，细胞基因组学2，1001192022年4月13日，作者。https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100119会会开放获取短文基因工程微卫星重复序列的全基因组功能锌指转录因子Y.埃丝特·塔克，1，2，3，6盖勒·布莱，1，3，4，6李卢阔，1索米亚·伊耶，1尼古拉斯·T。佩里，1，2海莉T。舒尔茨，1，2萨拉P。加西亚，1莉莉安布洛伊，5乔伊E。洪，1，2肖尼·伦加拉詹，1贝弗利·奈格尔斯，1安吉拉·沃洛里奥，1，5杰弗里·D。 1，2，3龚敬一，1，2Nicolo`Riggi，5，*J. KeithJesus，1，2，3，* 和MiguelN. Rivera1，3，4，7，*1分子病理学单位和癌症研究中心，马萨诸塞州总医院，查尔斯顿，MA，美国2计算和整合生物学中心，马萨诸塞州总医院，查尔斯顿，MA，美国3美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院病理学系4Broad Institute of MIT and Harvard，Cambridge，MA，USA5病理学研究所，实验病理学系，Vaudois大学中心医院，洛桑大学，1011 Lausanne，Switzerland6作者贡献相等7引线触点* 通信：nicolo. chuv.ch（N.R.），jjoung@mgh.harvard.edu（J.K.J.），mnrivera@mgh.harvard.edu（M.N.R.）https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100119总结在人类疾病中，重复元件可以在全基因组范围内失调。例如，在尤文肉瘤中，当被EWS-FLI 1结合时，数百个惰性GGAA重复可以转化为活性增强子。在这里，我们表明，EWS和GGAA重复序列靶向的工程化锌指阵列（ZFA）之间的融合可以至少与EWS-FLI 1一样有效地将数百个GGAA重复序列转化为尤文肉瘤前体细胞模型中的活性增强子此外，KRAB结构域与ZFA的融合可以沉默尤文肉瘤细胞中全基因组的GGAA微卫星增强子，从而减少EWS-FLI 1激活基因的表达值得注意的是，与非尤因癌细胞相比，这种KRAB-ZFA融合物显示出对尤因肉瘤细胞的选择性毒性这些发现证明了ZFA对重复序列的功能注释的价值，并说明了异常微卫星活性如何被调节以用于潜在的治疗应用。介绍随着大规模测序和作图工作的成功，组装基因组的功能注释已经成为生物学和医学中最重要的当前科学挑战之一。通过开发靶向基因编辑和表观遗传编辑工具，这一任务得到了加速和促进，这些工具使探测单个基因和调控序列的内源性功能成为可能。1，2虽然编码序列的表征已经快速发展，但非编码区的功能注释提出了重大挑战，特别是对于构成高达三分之二的人类基因组并且被认为在正常发育和疾病中起关键作用的高度重复序列。3-我 们 试 图 通 过 首 先 关 注 微 卫 星 重 复 序 列 （ microsatelliterepeats）来开发在功能上表征基因组中的重复元件的策略，微卫星重复序列是一类简单串联重复序列，先前的研究已经表明其可以在多种疾病状态中失调。4，10-13，14这种融合包括EWS的N-末端反式激活结构域和FLI 1的C-末端DNA结合结构域。与仅稳定结合非重复GGAA位点的FLI 1相反，EWS-FLI 1可以结合非重复GGAA基序和GGAA微卫星重复。值得注意的是，EWS-FLI 1的结合将存在于整个人类基因组中的数百个GGAA微卫星转化为转录增强子，从而诱导肿瘤特异性基因调控程序。14-CellGenomics 2，100119，April 13，2022？作者。1这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。会开放获取短文2细胞基因组学2，100119，2022强调需要强大的工具来进行全基因组研究和这些元素的扰动。在这里，我们提供了一个概念验证的示范工程ZFA如何可以用来有效地靶向和改变人类细胞中一类微卫星重复的染色质状态使用EWS-FLI 1结合的GGAA微卫星重复序列作为测试案例，我们表明，靶向这些重复序列的工程化EWS-ZFA融合蛋白可以比EWS-dCas 9靶向融合体更有效地激活先前显示被EWS-FLI 1转化为从头增强子的GGAA此外，EWS-ZFA融合体可以有效地表型复制EWS-FLI 1在GGAA微卫星上的先锋功能，并重现尤文肉瘤的GGAA重复依赖的染色质景观和基因表达谱值得注意的是，靶向GGAA重复序列的ZFA与转录阻遏物KRAB结构域的偶联导致GGAA微卫星的全基因组沉默和通过致癌基因表达程序的靶向失活对尤文肉瘤细胞具有选择性的细胞毒性。我们的研究结果验证了工程化锌指（ZF）技术用于靶向和改变微卫星重复序列的功能状态的能力和效率，并说明了该平台如何在基因组规模上用于询问微卫星重复元件结果工程化序列特异性DNA结合结构域以靶向GGAA微卫星重复尽管有多种平台可用于产生可能能够识别由EWS-FLI 1融合蛋白结合的GGAA微卫星重复序列的DNA结合模块，但我们选择集中于使用来自化脓链球菌的工程化ZFA和RNA引导的dCas 9。Cys2His2 ZFA可以被工程化以识别感兴趣的新DNA序列，并且已经成功地用于构建能够影响人类细胞中基因表达的人工转录因子。19，20，21，22或者，由向导RNA（gRNA）编程的dCas 9已类似地用于产生在人细胞中有效发挥功能的基因调节蛋白23TALE重复序列也已用于构建定制的DNA结合结构域，利用四个TALE重复序列结构域的组装阵列26-我们设计了ZFA以识别两个18 bp序列，这两个序列在4.5个GGAA重复的不同寄存器内对齐：50-GGA AGG AAG GAA GGAAGG和50-AAG GAA GGA AGG AAGGAA。单个ZF识别约3bp的DNA，并且先前的工作已经表明，识别18 bp靶位点的六个ZF的高活性阵列可以通过使用通过非规范（非TGEKP）接头如TGSQKP或CGSQKP连接在一起的预先选择的2-ZF单元来组装32的实验室，未发表的数据）。使用这种策略和预先选择的2-ZF单位档案，这些单位被工程化以结合各种特定的靶序列，我们为两个18 bp靶位点中的每一个组装了8个不同的6-ZF阵列（图1A）（STAR方法和表S1）。为了测试这16种ZFA结合GGAA微卫星重复序列的能力，我们将EWSR117，41的无序朊病毒样N末端结构域（下文称为EWS结构域）融合到每种ZFA的N末端或C末端（图1B）。然后，我们评估了这32种融合物中的每一种在人U2 OS细胞中激活UGT 3A 2基因（EWS-FLI 1靶基因，在其启动子上游约2kb处具有11个GGAA重复序列）的能力我们发现，所有这些基于ZF的融合物以不同水平的效率激活UGT 3A 2（平均激活倍数范围为14- 190倍）（图1C）。因为ZF阵列ZFA 7显示出与EWS结构域的位置无关的大致相等的活性（平均激活倍数为83倍和70倍），并且该激活水平类似于用EWS-FLI 1观察到的激活水平（平均激活倍数为121倍）（图1C），我们选择EWS-ZFA 7融合体（下文称为EWS-ZFA）用于进一步的实验。为了能够通过dCas9结合GGAA重复序列，我们还设计了一种gRNA，其将靶向由约5.5个GGAA重复序列组成的23 bp序列：GAA GG，由20 nt间隔区（粗体）和NGG原间隔区相邻基序（下划线）组成令我们惊讶的是，该gRNA与其中EWS结构域融合至dCas 9的N-末端或C-末端的融合蛋白（下文分别称为EWS-dCas 9或dCas 9-EWS）一起的表达未能激活U2 OS细胞中的UGT 3A 2基因（图1D）。为了增加由我们的dCas 9-gRNA复合物募集的EWS结构域的数量，我们使用了称为DmrA和DmrC的两个结构域的单和多聚化构型，其仅在小分子A/C异二聚体存在下相互作用。我们在U2 OS细胞中共表达了我们的gRNA和DmrC-EWS结构域融合物以及具有一个、两个、三个或四个DmrA结构域的dCas 9-DmrA融合蛋白（图1D）。在异二聚化剂存在下，我们发现含有两个、三个或四个DmrA结构域的dCas 9-DmrA融合体可以介导UGT 3A 2基因的适度活化（平均活化倍数分别为3.1、3或1.1），其水平远低于使用EWS-ZFA融合体观察到的活化（图1D ）。相比之下，当使用针对U2OS 细胞和HEK293细胞中的那些基因的启动子内的非重复靶位点的不同gRNA时，这些相同的基于dCas9的EWS构建体有效地激活各种其他基因（图S1）。我们的基于dCas 9的EWS构建体介导来自基因组中的独特位点而不是来自GGAA重复序列的激活的能力表明，这些融合体识别和/或结合存在于人类基因组中超过13，000个基因座（包括UGT 3A 2启动子）的这些重复序列可能具有挑战性。综上所述，我们的结果表明，工程化的EWS-ZFA融合体可以比与EWS结构域的类似的基于dCas 9的融合体更有效地激活具有上游GGAA重复序列的EWS-FLI 1靶基因。EWS-ZFA融合再现了尤文肉瘤中观察到的微卫星重复序列的我们接下来通过比较其活性来测试EWS-ZFA是否可以靶向并激活全基因组的GGAA微卫星，细胞基因组学2，100119，2022年4月13日3会开放获取短文一BCD图1.工程化ZFA以结合人类基因组中的GGAA微卫星以及通过融合至EWS的工程化ZFA有效激活靶基因(A) 16个ZFA的示意图，每个ZFA被设计为结合~4.5个GGAA微卫星。ZFA有六个锌指，每个锌指识别三个核苷酸。ZFA 1至8的靶序列以GGA开始，ZFA 9至16以AAG开始。每个锌指的识别螺旋的氨基酸组成显示在右侧。具有不同识别螺旋的多个锌指可以识别相同的核苷酸。(B) 通过与位于转录起始位点上游约2 kb的11单位GGAA微卫星结合，与EWS融合的ZFA激活UGT 3A2的示意图EWS与ZFA的N末端（左）或C末端（右）融合。(C) 通过核转染在U2OS细胞中测试靶向GGAA重复序列的32种EWS和ZFA融合物的UGT 3A2基因活化。EWS-ZFA 7密切模拟EWS-FLI 1的活化水平，因此被选择用于进一步的实验。(D) 用EWS-ZFA 7、EWS-dCas 9、dCas 9-EWS或基于dCas 9的二分EWS激活剂（dCas 9-DmrA和DmrC-EWS）核转染的U2 OS细胞中UGT 3A 2的mRNA表达二分系统增加了募集到靶位点的EWS分子的密度。另见图S1和表S1。会开放获取短文（图例接下页）4细胞基因组学2，100119，2022B一个CDFEGH图2. EWS-ZFA与MSC中GGAA重复序列的有效和特异性结合诱导活性染色质和GGAA重复序列相关基因(A) 在MSC中由EWS-ZFA结合的位点处鉴定的GGAA重复基序(B) 散点图显示使用血凝素（HA）ChIP-seq测定的MSC中3xHA标记的EWS-FLI 1和EWS-ZFA与全基因组GGAA重复序列（n = 13，029）的结合ChIP-seq信号在log2标度上斯皮尔曼相关系数为0.68，p为2.23 10- 16。显示了来自两个生物重复实验之一的数据(C) 条形图显示了在MSC中慢病毒转导后由EWS-ZFA（左）和EWS-FLI 1（右）结合的基因组中GGAA重复的分数显示了来自两个生物重复实验之一的数据每个类别中连续GGAA重复的数目显示在X轴上。(D) 热图显示了在尤文肉瘤（n = 812）中鉴定的EWS-FLI 1结合GGAA重复序列处MSC中的HA和H3 K27 ac ChIP-seq信号，在慢病毒转导3xHA标记的EWS-FLI1或EWS-ZFA后。3xHA标记的GFP用作对照。每个图中的10-kb窗口以尤文肉瘤中的EWS-FLI 1结合位点为中心。(E) 显示MSC中在含有GGAA重复元件和典型ETS结合位点的IGF 2BP 1基因座处3xHA标记的EWS-FLI 1或EWS-ZFA的结合和伴随的H3 K27 ac水平的实施例会开放获取短文细胞基因组学2，100119，2022年4月13日5间充质干细胞（MSC）中的EWS-FLI 1。MSC是尤文肉瘤起源细胞的模型，并且EWS-FLI 1先前已被证明在这些细胞中作为GGAA重复的先锋因子，以诱导类似于肿瘤细胞的染色质景观和基因表达模式。14用表达EWS-ZFA的慢病毒载体转导MSC，然后进行染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和无偏序列分析，鉴定了GGAA重复序列为在EWS-ZFA峰中发现的主要基序（超过80%的EWS-ZFA结合位点含有超过四个连续的GGAA单位，图2A和S2A）。EWS-ZFA还结合了基因组中几乎所有被EWS-FLI1结合的GGAA重复序列（图2B和S2B）。我们基于其长度对具有超过四个连续GGAA单元的13，029个GGAA微卫星进行分类（图S2C），并且发现在每个长度间隔处，EWS-ZFA比EWS-FLI 1结合更高比例的GGAA微卫星（10%-我们进一步测试了EWS-ZFA结合是否会导致MSC中GGAA重复序列处活性染色质状态的诱导。为此，我们使用ChIP-seq来测量812个GGAA微卫星上的活性染色质标记H3 K27 ac，这些微卫星在尤文肉瘤细胞系中始终与内源性EWS-FLI 1结合。14我们观察到EWS-ZFA在这些相同位点的强结合和H3 K27 ac的从头沉积，通常以比EWS-FLI 1诱导的更高的水平（图2D、2 E和S2E ） 。 与 EWS-FLI 1 相 比 ， EWS-ZFA 的 这 种 更 高 活 性 和GGAA重复的更高结合（图2C和S2D）可能是由于慢病毒诱导后观察到的更高蛋白表达水平（图S2F）。然而，我们不能排除其他可能的解释，例如ZFA和FLI1 DNA结合结构域之间的结构和功能差异（这可能为每种融合蛋白提供不同的DNA稳定性特征）或募集到给定GGAA重复序列的融合蛋白的不同数量（这可能导致参与H3K27ac沉积的染色质辅因子的可变募集相比之下，由EWS-FLI 1结合的典型非重复GGAA位点未显示EWS-ZFA结合或染色质状态变化的证据，从而证明了工程化EWS-ZFA融合物相对于非重复GGAA位点对GGAA重复的特异性，如所预期的（图2F、2G和S2G）。除了染色质活性的变化外，我们还测量了EWS-FLI 1结合GGAA重复序列附近基因的转录变化。转录物分析显示，在EWS-FLI 1结合的GGAA重复序列的100 kb内（图2H和表S2）并被EWS-FLI 1诱导R2倍的72%的基因也被EWS-ZFA上调至相似的程度。综上所述，这些数据表明EWS-ZFA能够表型复制染色质并转录。在尤文肉瘤中观察到的激活，表明通过工程化的ZFA而不是FLI1 DNA结合结构域将N-末端EWS结构域定位于GGAA重复序列足以启动先锋功能、增强子激活和靶基因表达所需的染色质调节子的募集这些结果为工程化ZFA如何成为靶向和改变全基因组GGAA微卫星功能状态的有效工具提供了重要的概念证明。KRAB-ZFA可选择性沉默微卫星驱动的尤文肉瘤基因表达程序考虑到EWS-ZFA可以有效地靶向并激活MSC中的GGAA微卫星，我们假设我们的工程化ZFA与抑制性KRAB结构域的融合物42，43可能连续沉默尤文肉瘤细胞中内源性EWS-FLI 1结合的活性GGAA微卫星，从而使其下游致癌基因表达程序失活。这种方法提供了一种可能性，以描绘精确的功能作用，在尤文肉瘤细胞中的GGAA重复，在隔离的非重复GGAA的EWS-FLI 1的目标网站。我们表达了KRAB-ZFA融合蛋白，并发现它有效地结合到两个尤文肉瘤细胞系（SKNMC和A673）中的GGAA微卫星。有趣的是，KRAB-ZFA结合之后是EWS-FLI 1从相同基因组位点的驱逐，如在SKNMC和A673细胞中进行的FLI 1 ChIP-seq所示（FLI1 ChIP-seq可用于检测EWS-FLI 1的结合，因为这两种细胞系不表达内源性野生型FLI 1）（图3A、3B、S3A和S3 B）。KRAB-ZFA结合还与染色质状态的显著变化和抑制标记的诱导相关，其中GGAA微卫星处的H3 K9 me 3信号增加和H3 K27 ac信号减少（图3A、3C、3D、S3A和S3 C）。正如预期的那样，这些变化仅在GGAA重复序列处观察到，而在非重复序列GGAA EWS-FLI1结合位点处未观察到，证实了KRAB-ZFA的特异性（图S3在位于EWS-FLI 1结合的GGAA重复序列的IOOkb内的基因中，由于SKNMC和A673细胞中的KRAB-ZFA表达，分别有49%和47%的基因在EWS-FLI 1耗尽的细胞系中显示出R2倍降低（图3G和S4A;表S3）。涉及特定功能类别的基因（例如，细胞周期调控和神经发生），这些基因在SKNMC和A673细胞中被KRAB-ZFA下调的基因中富集（图S4B;表S4和S5）。因为预期KRAB-ZFA融合物仅会改变表达EWS-FLI 1的尤文肉瘤细胞中GGAA重复序列的功能（并且这些重复序列的功能与EWS-FLI1相同），(F) 热图显示了在尤文肉瘤（n = 973）中鉴定的EWS-FLI 1结合的典型ETS结合位点处的MSC中的HA和H3 K27 ac ChIP-seq信号，在慢病毒转导3xHA标记的EWS-FLI 1或EWS-ZFA后。GFP用作对照。每个图中的10-kb窗口以尤文肉瘤中的EWS-FLI 1结合位点为中心(G) 显示MSC中含有典型ETS结合位点的NIBAN 3和COLGALT 1(H) 通过RNA测序（RNA-seq）确定的，与GFP对照相比，用EWS-FLI 1或EWS-ZFA构建体处理的MSC中GGAA重复相关基因（n = 126）的表达的log2倍变化的热图显示了两个生物学重复EWS-FLI 1和EWS-ZNF中log2倍数变化的Spearman相关性为0.58（p2.223 10- 16）。另见图S2和表S2。会开放获取短文（图例接下页）6细胞基因组学2，100119，2022A B ECFG H图3.KRAB-ZFA与GGAA重复序列的结合通过抑制靶基因表达诱导尤文肉瘤细胞系的选择性毒性(A) 热图显示如使用ChIP-seq测定的SKNMC细胞中3xHA标记的KRAB-ZFA的结合和H3 K9 me 3沉积在EWS-FLI 1结合的GGAA重复（n = 812）处(B) 显示在SKNMC中引入KRAB-ZFA或GFP（对照）后GGAA重复的EWS-FLI 1占据的复合图。X轴代表以812个GGAA重复序列为中心的10-kb窗口。(C) 直方图显示在用KRAB-ZFA处理SKNMC细胞后，在812个EWS-FLI 1结合的GGAA重复序列处H3 K27 ac的变化。(D) 显示KRAB-ZFA（3xHA标记的）、内源性EWS-FLI、H3 K9 me 3和H3 K27 ac（与H3 K9 me 3相关的GGA A重复元件）的结合的实施例。CCND 1基因座，用KRAB-ZFA构建体处理SKNMC细胞后。GFP用作对照。(E) 热图显示如使用ChIP-seq测定的，在尤因肉瘤（n = 812）中，在EWS-FLI 1结合的GGAA重复序列处，HEK 293 T细胞中KRAB-ZFA（3xHA标记的）和H3K9 me 3沉积的结合D会开放获取短文细胞基因组学2，100119，2022年4月13日7增强子），我们感兴趣的是评估KRAB-ZFA表达在非尤文肉瘤细胞中的作用。为此，我们分析了表达KRAB-ZFA后HEK 293 T细胞中全基因组染色质状态的变化。与先前检查的大多数非尤因细胞类型中观察到的相似，14我们发现HEK 293 T细胞在GGAA重复序列处基本上缺乏活性染色质标记，并且KRAB-ZFA表达诱导的H3 K27 ac信号没有重大变化（图S4C）。然而，HEK 293 T细胞中的GGAA重复序列在以与尤文肉瘤细胞相同的方式表达KRAB-ZFA后积累了强抑制性H3 K9 me 3信号（图3E和3F）。与尤文肉瘤细胞相反，用KRAB-ZFA转导的HEK 293 T显示出最小的转录变化，其仅包括少数具有位于其启动子内的GGAA重复序列的基因（图S4D和表S5）。最后，我们测试了KRAB-ZFA融合物对尤文肉瘤细胞中EWS-FLI 1诱导的转录程序产生的选择性拮抗作用是否为此，我们定量比较了在表达KRAB-ZFA或GFP（作为阴性对照）时四种不同尤文肉瘤细胞系与四种非尤文肉瘤对照系的活力（图3H）。引人注目的是，尽管KRAB-ZFA蛋白表达水平相似（图S4E），但只有尤文肉瘤细胞的活力受到KRAB-ZFA的影响，降低超过80%，而在所有阴性对照非尤文肉瘤细胞系中观察到最小的毒性（图3H）。讨论我们的研究结果表明，工程ZFA是高度有效的和具体的工具，针对广泛分布的重复元件和改变他们的染色质状态。工程化的ZFA对于该目的具有明显的优势，因为它们具有高DNA结合亲和力、小尺寸和与内源性转录因子的相似性。44我们的研究结果进一步证明，工程化ZFA可以极大地促进人类基因组的重要但具有挑战性的重复元件的功能评估，并可能提供治疗性修饰这些重复序列的非编码功能用ZFA靶向非编码区之外的重复元件也可能具有治疗价值，如最近靶向亨廷顿病基因HTT的编码序列中的单个CAG重复扩增的研究所表明的。因此，未来的研究可能会开发出靶向其他重复序列的ZFA，这些重复序列的扩增或功能障碍可能会改变许多生物学过程，包括基因调控、RNA稳定性和蛋白质功能的改变。11此外，我们的方法提供了研究广泛分布的其他微卫星元件功能的工具，作为端粒重复序列，涉及基因组稳定性的间质端粒序列，46或在启动子和调节元件处富集的特定类型的简单重复序列。47在尤文肉瘤中被激活的GGAA微卫星的情况通过募集特异性调节结构域而不涉及内源性DNA结合蛋白，工程化的ZFA还使得研究知之甚少的蛋白质的贡献成为可能，如我们的发现所示，在不存在EWS-FLI 1中所含的成红细胞转化特异性（ETS）DNA结合结构域的情况下，EWSR 1的N末端足以激活GGAA微卫星有趣的是，我们观察到ZFA和RNA引导的dCas9靶向GGAA重复序列的方法之间存在很大差异。尽管需要未来的研究来调查其根本原因，但我们推测这些差异可能与以下有关：（1）与dCas9-EWS相比，EWS-ZFA对GGAA重复序列的结合亲和力更高和/或EWS-ZFA的表达更高（可能是由于蛋白质大小差异），这反过来导致GGAA重复序列位点的占用率更高;（2）dCas 9-EWS形成R环，这可能干扰其他内源性转录因子的募集;48以及(3)与它们的ZF对应物相比，核小体在dCas9融合体上的闭合GGAA重复处施加的潜在更高的结合空间位阻约束综上所述，这些观察结果表明，ZFA在研究人类基因组中大量不同位置的串联重复序列的功能方面可能优于dCas9。最后，与其他细胞类型相比，在尤文肉瘤细胞中沉默GGAA重复序列时观察到的显著毒性这指出了系统评估重复序列在正常和致病状态中的作用及其作为以稳健和特异性方式改变细胞行为的靶标的潜力的重要性。该研究我们的研究提出了概念验证实验，表明ZFA可用于改变微卫星重复基因组范围内的染色质状态。虽然所采用的方法原则上可以更普遍地适用于其他重复性要素，但需要进一步试验，以测试这种方法在其他情况下的有效性。我们的结果也值得注意，因为与基于dCas9的技术相比，ZFA具有显著的优势。需要进一步的研究来确定这些差异是否适用于其他基因组。(F) 显示在用KRAB-ZFA构建体处理HEK 293 T细胞后，KRAB-ZFA（3xHA标记的）、H3 K9 me 3和H3 K27 ac在与CCND 1基因座相关的GGA-重复元件处的结合的实施例。GFP用作对照。(G) 热图显示了通过RNA-seq测定的用KRAB-ZFA或GFP（对照）处理的SKNMC和HEK 293 T细胞中的GGAA重复相关基因（n = 235）的表达（行归一化计数）数据来自两个生物学重复。(H) KRAB-ZFA和GFP（对照）慢病毒转导后8天尤文肉瘤和非尤文细胞系的活力。空心圆表示两个生物学重复，三个技术重复;误差条显示SEM。另见图S3和S4;表S3会开放获取短文8细胞基因组学2，100119，2022重复，并阐明这些观察的机械基础。最后，我们证明了KRAB-ZFA对GGAA重复的抑制导致尤文肉瘤细胞系的选择性毒性这一概念的进一步发展将需要广泛的体内验证和开发将KRAB-ZFA递送至实体瘤的有效STAR+方法本文件的在线版本提供了详细的方法，包括以下内容：d关键资源表d资源可用性B电极导线触点B材料供应情况B数据和代码可用性d实验模型和子系统B细胞系d方法和步骤B质粒和寡核苷酸B转染B慢病毒世代B免疫印迹分析B实时定量逆转录PCRB细胞活力测定B与EWS-FLI 1结合的GGA-重复序列BChIP-seqBChIP-seq生物信息学分析BRNA-seqBGSEA分析d量化和统计分析补充信息补充信息可以在www.example.com上找到https://doi.org/10.1016/j。xgen.2022.100119。致谢J. K. J.得到了美国国立卫生研究院的资助（R35 GM 118158、R 01 CA211707、R 01 CA 204954、DP 1 OD 006862和DP 1 GM 105378），马萨诸塞州总医院（MGH）X连锁肌张力障碍-帕金森病协作中心资助，Jim和AnnOrr MGH研究学者奖，以及德斯蒙德和安·希思伍德MGH研究学者奖。N.R.由瑞士国家科学基金会教授资助（PP 00 P3 -157468/1和PP00P3_183724），瑞士癌症联盟资助（KFS-3973-08-2016和KFS 4859 -08-2019），FondM.N.R由NCI/NIH（U 54 CA 231637）和Thomas F.和Diana L.Ryan MGH研究学者奖。我们感谢Eliz-abeth Dahlborg对采埃孚工程的帮助我们感谢利吉保罗Pottenplackel，布拉德利E。伯恩斯坦、马丁·阿尔耶和董瑞对手写体的评论图形摘要由BioRender.com创建。作者贡献YET G.B. J.K.J.，N.R.，和核磁共振设想和设计的实验。YET G.B. L. L.，L.B.，H.T.S. N.T. P J.E.H. S.R.，B.N.，AV，和J.G. 每-形成实验。S.I. 和S.P.G.实现了用于分析RNA和ChIP-seq数据的计算G.B. S.P.G和S.I.分析了ChIP和RNA-seq数据。J.D.S.和J. K. J.设计了本研究中使用YET G.B. J.K.J.，N.R.，和核磁共振用所有作者的输入编写了申报利益J.K.J.在本研究过程中，在几家开发基因编辑或表观遗传编辑技术的公司中拥有或曾经拥有经济利益：Beam Therapeutics，Blink Therapeutics，ChromaMedicine ，Editas Medicine， EpiLogic Therapeutics ，ETx Inc. ，ExcelsiorGenomics ， Hera Biolabs ， Monitor Biotechnologies ， Pairwise Plants ，Poseida Therapeutics，SeQure Dx Inc.，和神韵治疗公司J.K.J.'的利益进行了审查，并由马萨诸塞州总医院和马萨诸塞州总布里格姆根据其利益冲突的政策管理。J.K.J. 是Beam Therapeu- tics、Chroma Medicine、ETx Inc.成对植物 ， SeQure Dx Inc. ， 他 是 这 些 公 司 以 及 Blink Therapeutics ， EditasMedicine ， EpiLogicTherapeutics ， ExcelsiorGenomics 和 MonitorBiotechnologies的科学联合创始人。G.B. J.K.J.，核磁共振，和Y.E.T.是专利申请的发明人，该专利申请包括本文所述的工作。J.K.J.和Y.E.T.是专利或专利申请的发明人，各种基因和表观遗传编辑技术。M.N. R接受ACD和默克雪兰诺的研究支持，用于与本研究无关的工作。S.I.和S.P.G.是神韵治疗公司的员工J.K.J.是细胞基因组学顾问委员会的成员。投稿时间：2021 - 03 - 18修订日期：2021受理时间：2022发布时间：2022引用1. Sander，J.D.，和J.K.（2014年）。用于编辑、调节和靶向基因组的CRISPR-Cas系统。国家生物技术32，347-355。2. 霍尔茨曼湖和Gersbach，C.A.（2018年）。 编辑表观基因组：基因组景观重塑。Annu. Rev. Genom. Hum. Genet. 19，43-71.3. Payer，L.M.，和Burns，K.H.（2019年）。转座因子与人类遗传病。遗传学国家牧师20，760-772。4. Usdin，K. （2008年）。简单串联重复序列的生物学效应：重复序列扩增疾病的教训。Genome Res. 18，1011-1019.5. Pehrsson，E.C.，Choudhary，M.N.K.，Sundaram，V.，和Wang，T.（2019年）。转座因子在正常人类发育和解剖学中的表观基因组景观。国家通信10，5640。6. Ting，D.T.，Lipson，D.，保罗，S.，Brannigan，B.W.，Akhavanfard，S.，考夫曼，E.J. ，Contino ，G. ，Deshpande ，V.，Iafrate ，A.J.，Letovsky，S.，等人（2011年）。胰腺癌和其他上皮癌中卫星重复序列的异常过表达科学331，593-596。7. Lander，E.S.，Linton，L.M.，Birren，B.，Nusbaum，C.，M.C.佐迪Baldwin，J.，德文郡，K.，Dewar，K.，Doyle，M.，菲茨休，W.，等（2001）。人类基因组的初步测序和分析。Nature 409，860-921.8. Jachowi cz，J.W.，宾 ，X.，Pontabry ，J.， B oBrosskov ic'，A.，兰多，O.J.， 和Torres-Padilla，M. E.（2017年）。受精后LINE-1激活调节小鼠早期胚胎的整体染色质可及性Nat. Genet.49，1502-1510。9. Fuentes，D.R.，Swigut，T.，Wysocka，J.（2018）.逆转录病毒LTR的系统干扰揭示了对人类基因调控的广泛的长期影响。Elife 7，e35989。10. Subramanian，S.，Mishra，R.K.，和Singh，L.（2003年）的报告。人类微卫星重复序列的全基因组分析：它们在特定基因组区域的丰度和密度Genome Biol.4，R13。11. 马利克岛凯利，C.P.，王，E. T.，托德，P.K.（2021年）。核苷酸重复序列扩增紊乱的分子机制。Nat. Rev. Mol. Cell Biol.22，589-607.会开放获取短文细胞基因组学2，100119，2022年4月13日912. 特罗斯特，B.，Engchuan，W.，Nguyen，C.M.，Thiruvahindrapuram，B.，Dolz-henko，E.，巴克斯卓岛Mirceta ，M.，Mojarad，文学士，Yin，Y.， Dov，A.，等（2020年）。全基因组范围内检测在自闭症中扩展的串联DNA重复序列Nature 586，80-86.13. 德 拉特 尔湖 ，澳- 地Zucman ， J. ，Plougastel ，B.， Desmaze ，C.，Melot，T.，彼得，M.，Kovar，H.，茹贝尔岛de Jong，P.，Rouleau，G.（1992年）。人类肿瘤中染色体易位引起的ETS DNA结合域的基因融合Nature 359，162-165.14. Riggi，N.，Knoechel，B.，Gillespie，S.M.，Rheinbay，E.，Boulay，G.，M.L.苏瓦，罗塞蒂，东北部，Boonseng，W.E.，Oksuz，O.库克，E.B.，等人（2014年）。EWS-FLI 1利用不同的染色质重塑机制直接激活或抑制尤文肉瘤中的增强子元件。 癌症细胞26，668-681。15. Gangwal，K.，Sankar，S.，Hollenhorst，P.C.，Kinsey，M.，南卡罗来纳 州 哈 罗 德 森 ， Shah ， A.A. ， Boucher ， K.M. ， Watkins ， W. S. ，Jorde ， L.B. ， 格雷 夫 斯， B.J. ，等 人（ 2008 年 ）。 微卫 星作 为EWS/FLI响应元件在Ewing's sar- coma中的作用Proc. Natl. Acad. Sci. US A 105，10149-10154。16. Guillon，N.，Tirode，F.，Boeva，V.，Zynovyev，A.，Barillot，E.，和Delattre，O.（2009年）。 致癌EWS-FLI 1蛋白结合体内GGAA微卫星序列具有潜在的转录激活功能。PLoS One 4，e4932。17. Boulay，G.，桑多瓦尔，G.J.，Riggi，N.，Iyer，S.，比松河Naigles，B.，阿瓦德法医Rengarajan，S.，Volorio，A.，McBride，M.J.，等人（2017年）。朊病毒样结构域对BAF复合物的癌特异性重靶向。细胞171，163-178.e19。18. Burns，K.H. （2017年）。癌症中的转座因子Nat. Rev. Cancer 17，415-424.19. Graslund，T.，Li，X.，马格内纳湖Popkov，M.，和Barbas，C.F.，3日（2005年）。 人工转录因子设计策略的探索：靶向已知调控区附近的位点诱导γ-珠蛋白表达和治疗镰状细胞病。J. Biol. Chem. 280，3707-3714。20. Beerli，R.R.，西格尔，D.J.，Dreier，B.，和Barbas，C.F.（1998年）。随意控制基因表达：通过使用由模块构建块构建的多指锌指蛋白特异性调节 erbB-2/HER-2 启 动 子 。 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 95 ， 14628-14633。21. Liu，P.Q.，Rebar，E.J.，张，L.，刘昆，Jamieson，A.C.，梁玉，等人（2001年）的第10页。使用靶向可接近染色质区域的一组设计的锌指蛋白调节内源性基因座。J BiolChem 276，
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