宣肺败毒方对巨噬细胞免疫反应的研究

工程20（2023）63研究中药-文章宣肺败毒方抑制巨噬细胞免疫反应赵璐a，#，刘浩a，#，王颖超a，王淑芳a，荀德金a，王毅a，b，刘晓，程一宇a，b，刘晓，Boli Zhangba浙江大学药学院药物信息学研究所，浙江b天津中医药大学中药基础国家重点实验室，天津301617阿提奇莱因福奥文章历史记录：2021年5月24日收到2021年7月23日修订2021年9月21日接受2021年11月15日网上发售保留字：宣肺败毒方多模态鉴别炎症巨噬细胞活化巨噬细胞迁移A B S T R A C T宣肺败毒方（XFBD）是一种用于临床治疗2019冠状病毒病（COVID-19）患者的中药临床应用表明，血府逐瘀汤具有显著的治疗作用在这里，我们结合了一个全面的研究方法，包括网络药理学，转录组学和生物测定在多个模型系统中，以探讨XFBD及其生物活性物质的药理机制。高分辨率质谱与分子网络相结合，以分析XFBD中共鉴定或初步鉴定了104种化合物，包括黄酮类、萜类、羧酸类和其他类型的成分。基于XFBD的化学组成，基于网络药理学的分析将炎症相关途径鉴定为主要靶点。因此，我们在脂多糖诱导的急性炎症小鼠模型中检测了XFBD的抗炎活性。XFBD可明显减轻肺组织炎症反应，降低血清促炎细胞因子水平。转录组学分析表明，XFBD处理后，与巨噬细胞功能相关的基因表达不同。因此，在巨噬细胞系和斑马鱼创伤模型中研究了XFBD对巨噬细胞活化和动员的影响。XFBD对巨噬细胞活化和迁移都有很强的抑制作用。此外，通过多模式筛选，我们进一步确定了XFBD不同草药中介导其抗炎作用的主要成分和化合物。然后发现XFBD的活性成分包括虎杖、芦根和红花化橘红，强烈下调巨噬细胞活化，并鉴定出虎杖苷、异甘草苷和acteo-side为活性化合物。结果表明，地黄和麻黄的成分可显著抑制内源性巨噬细胞迁移，而麻黄碱、麻黄碱和山萘酚的存在则是这些作用的原因。综上所述，本研究从多模式的角度探讨了XFBD调节炎症的药理机制和有效成分，为XFBD的临床疗效提供了生物学例证©2021 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）在非典型肺炎中首次引起了世界*通讯作者。电子邮件地址：chengyy@zju.edu.cn（Y.程），zjuwangyi@zju.edu.cn（Y. Wang）。#这些作者对这项工作做出了同样的由这种病毒引起的新型冠状病毒病-即2019冠状病毒病（COVID-19）-具有高度传播性，已成为对全球公共卫生的压倒性威胁[2，3]。COVID-19的全球发病率及死亡率持续上升。作为截至二零二一年七月二十日，COVID-19已在全球超过1. 9亿人中确诊，并已导致超过400万人死亡[4]。为了应对全球COVID-19大流行，医学，公共卫生，制药和许多其他相关领域的研究人员做出了巨大努力，以开发有效的治疗和治疗方法。https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.09.0072095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engL. Zhao，H.Liu，Y.Wang等人工程20（2023）6364·····×疾病控制方法。越来越多的证据表明，COVID-19患者的一个亚组可能会出现细胞因子风暴综合征，其发生与死亡率增加有关[5]。炎症是响应病毒感染的主要宿主防御，其特征在于多种炎性细胞（包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞）的活化和移动炎症细胞的过度活化可导致细胞因子的不受控制的释放和有害的全身免疫应答，即所谓的因此，在早期阶段识别和抑制该亚组COVID-19患者的过度炎症非常重要宣肺败毒方是由中国工程院院士张伯礼、刘清泉教授设计的用于治疗COVID-19患者”湿毒郁肺"症状的一线中药方剂[6]。一项初步随机临床试验表明，与单独使用抗病毒药物治疗的患者相比，XFBD与常规抗病毒药物联合使用显著加速了COVID-19患者临床症状的消退[7]。XFBD由13种草药和天然材料组成，根据中医理论，具有多靶点作用[6]。值得注意的是，计算机药理学分析表明，近10%的推定XFBD靶标富集在病毒感染和肺损伤的疾病途径中，免疫和炎症是靶标调节的主要生物学途径[6]。然而，XFBD的药理机制仍需进一步验证。在XFBD药理学研究中遇到的主要困难，在许多其他中药的研究中，是其化学组成和生物活性的复杂性。针对这一挑战，提出了中药活性成分多模态识别的必要性，强调了多个研究模型在不同尺度下的信息获取与融合 在本研究中，我们整合了来自网络药理学结果的信息，基于高分辨率质谱（MS）实验和小鼠炎症模型的转录组学分析，以鉴定XFBD的潜在靶向途径（图1A和1B）。附录A中的S1和S2）。接下来，重点关注XFBD在巨噬细胞介导的过度炎症中的预测作用，我们进一步检查了XFBD及其活性组分在体外和体内系统中的药理作用综上所述，我们的研究结果确定了XFBD及其组分在炎症刺激的巨噬细胞迁移和细胞因子分泌的病理过程中的调节作用，这部分解释了XFBD操纵免疫超活化的药理学机制。2. 方法2.1. 材料和试剂XFBD颗粒和单味中药提取物由天津现代创新中药科技有限公司提供，有限公司（中国）。绿原酸、阿魏酸、3，4-二咖啡酰奎尼酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸、柚皮素、山奈酚、大黄素I、大黄素、广藿香酮、新绿原酸、苦杏仁苷、异夏托苷、马鞭草苷、戟叶皂苷、迷迭香酸、异毛蕊花糖苷、异甘草苷、芹菜素、儿茶素、槲皮素-3-O-b-D-葡萄糖-7-O-b-D-龙胆双糖苷、隐绿原酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、橙皮苷、异甘草苷、芹菜苷、甘草酸，和青蒿素购自上海威禾医药科技有限公司，有限公司（中国）。腺苷、紫杉醇III和Ononin购自上海原野生物技术有限公司，公司（中国）。木犀草素购自上海阿拉丁生物化学技术有限公司，公司（中国）。Schaftoside和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸购自成都MUST生物技术有限公司，有限公司（中国）。盐酸麻黄碱购自中国食品药品检定研究院。白藜芦醇购自所有化合物的纯度将所有化合物溶解于二甲基亚砜（DMSO）中以形成浓度为100 mmol L-1的储备溶液高葡萄糖Dulbecco100 g mL-1链霉素）购自Gibco BRL（USA）。小鼠外周血单个核细胞（PBMC）分离试剂盒购自浩洋生物制品有限公司，有限公司（中国）。Poly（I：C）和Pam3CSK 4购自Invivogen（USA）。白细胞介素（IL）-6酶联免疫吸附测定（ELISA ）试剂盒购自BosterBiologicalTechnology公司，公司（中国）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）小鼠单克隆抗体、细胞裂解缓冲液和用于蛋白质印迹的苯基-甲基磺酰氟（PMSF）购自Beyotime Biotechnology（中国）。2.2. XFBD和草药测试溶液质 量 为 119 g 的 XFBD 颗 粒 样 品 含 有 以 下 组 分 ： 3 g 的 麻 黄（ Ephebrahrhiza ） （ Ephebrahrhiza H. ） 、 7.5g 的 亚 美 尼 亚 籽（ Armeniacidum S. ） 、 15g 石 膏 （ Gypsum F. ） 、 15g 的 薏 苡 仁（Cocalus S. ）、5g的甘草酸（甘草酸R. ）、广藿香（PogostemonisH.6 g; ） 、 虎 杖 10 g 。 ） 、 马 鞭 草 （ Verbenae H. ） 、 15g 芦 苇（Phragmitis R. ）、7.5g的千里光/播娘蒿种子（千里光/播娘蒿S. ）、7.5g红花化橘红（Exocarpium Rubrum（Egrandis E. ）、黄芪（P. ）.将XFBD颗粒溶解于水中以形成浓度为200 mg mL-1的储备溶液。对于单独的草药提取物，每种草药材料100g（或对于麻黄H. ）加入到1.5L水中，分别回流提取1小时。所有提取物均通过减压和冷冻干燥进行浓缩。将提取物溶于水中，形成浓度为1 mg· mL-1 的储备液。2.3. XFBD提取物采用ACQUITY超高效液相色谱（UPLC）系统（Waters，USA）与三重飞行时间（TOF）5600+ MS（AB SCIEX，USA）偶联并配备电喷雾在Waters ACQUITY UPLC HSS T3（150 mm）上分离样品2.1 mm;内径（i.d.），1.8 Im），流速为0.3mL min-1，柱温为50 °C。流动相如下：0.1%甲酸-水作为水性流动相（A）和0.1%甲酸-乙腈作为有机流动相（B）。线性梯度洗脱的最佳条件为：0-2 min，0% B，2-25min，0%~ 30% B，25-35 min，30%~ 95% B，10%~ 100% B。35-37 min，95%B.进样量为2μ L，检测波长为254 nm。扫描范围，质荷比（m/z）扫描范围100-2000 Da（负），90-1500 Da（正）;离子源GS 1，50 psi（1 psi = 6.89 kPa）;离子源GS 2，50 psi;固化气体（CUR），35 psi;温度，对于正离子ESI（ESI+）为600 °C，对于负离子ESI（ESI -）为550 °C;离子喷雾（IS）电压，对于ESI -为-4.5kV，对于ESI -为5.5 kVL. Zhao，H.Liu，Y.Wang等人工程20（2023）6365××××≥≥≥·····+;去簇电位（DP），100 V;和碰撞能量（CE），10 V。2.4. XFBD的分子网络化构建在 ProteoWizard 软 件 包 中 ， 使 用 MSConvert 软 件 将 串 联 MS（MS2）数据文件从.wiff（AB SCIEX）标准数据格式转换为.mzXML格式然后使用MZmine 2 v.40.1处理所有.mzXML数据[8]。通过将噪声水平设置为5.0 × 10 -4进行MS检测。使用自动数据分析流水线（ADAP）色谱构建器，其中一组最小扫描组大小为5，组强度阈值为5.0 × 104，最小最高强度为5.0 × 104，m/z公差为0.001 Da或10 ppm。使用ADAP小波去卷积算法[9]：信噪比（S/N）阈值= 10，最小特征高度= 5.0 ×104计数，系数/面积阈值= 100，峰持续时间范围00.1分钟使用同位素峰分组器算法，并且使用连接比对器模块进行峰比对使用峰值查找器模块对峰值列表进行间隙填充，然后使用峰值列表行过滤器进行过滤。最终，导出了.mgf数据文件及其相应的.csv元数据文件，包括峰高和面积积分根据全球天然产物社会分子网络（GNPS）y[10]的在线工作流程创建相应的分子网络，母体质量公差为0.02 Da，MS2碎片离子公差为0.02 Da，最小簇大小为1。运行了MScluster，并关闭了筛选器前体窗口工具。所创建的网络的余弦分数高于0.7，并且有四个以上的匹配峰值。然后，根据GNPS光谱库搜索网络中的光谱。使用Cytoscape（ver.3.7.2）可视化分子网络数据。2.5. XFBD的化合物-目标网络XFBD的主要化合物的靶标来自中国传统医学百科全书（ETCM）数据库、中国传统医学系统药理学（TCMSP）数 据 库和TargetNet数据库（截至2020年3月31日）。选择靶点的标准如下：ETCM中的值高于0.8;TargetNet 中 的 受 试 者 工 作 特 征 曲 线 下 面 积 （ AUC ） 0.7 ， 概 率（Prob）> 0.9;或TCMSP中的口服生物利用度（OB）30%或药物相似性（DL）0.18。然后将结果标准化如下：来自ETCM的靶标对所有数据库检索结果进行汇总，建立化合物-靶标对应数据库。接下来，从 GeneCards yyy、比较毒理学基因组学数据库（CTD）、PubMed Geneyyyy和在线人类孟德尔遗传（OMIM）数据库中收集COVID-19的疾病基因。yhttp://gnps.ucsd.edu。http://www.tcmip.cn/ETCM.yyhttps://tcmspw.com/。http://targetnet.scbdd.com/.yyyhttps://www.genecards.org/。http://ctdbase.org/.yyyyhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.https://www.omim.org/.从GeneMANIAyyyyy中获得了 5556个ACE2共表达基因，并将其转化为人的标准基因名称。将所有基因上传至STRING基因组测序数据库以获得每个基因的相关性，并通过Cytoscape（版本3.7.2）进行可视化。通过STRING数据库和注释、可视化和集成发现数据库（DAVID）yyyyyy分析关键靶点的生物学功能。2.6. 脂多糖（LPS）诱导的C57 BL/6小鼠模型和XFBD治疗6-8周龄的C57 BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，将小鼠随机分为对照组、LPS组、低剂量XFBD组和高剂量XFBD组，每组10-15只。先前已报道了小鼠中LPS诱导的急性炎症的建模策略[11简单地说，对照组和LPS组小鼠口服生理盐水3天，LPS组小鼠腹腔注射LPS(20 mg·kg~（-1）。在临床实践中，XFBD的日剂量约为8.6 g kg-1体重[7]。本实验中，XFBD治疗组小鼠经口给予XFBD（低剂量：2.16 gkg~（-1）;高剂量：4.32 g kg~（-1）），连续3天，然后在第4天腹腔注射LPS（20 mg kg~（-1））和XFBD，持续4 h。将小鼠麻醉并处死，收集血液和肺。将至少六只小鼠的血液样品离心以获得血清。根据制造商的说明书，通过ELISA试剂盒测量血清中IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α和IL-1b通过PBMC分离试剂盒收集另外6只小鼠血液样品中的单个核细胞，并将同一组中的每两个样品合并为一个用于转录组测序。肺组织标本固定，苏木精-伊红（HE）染色。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）出版的实验动物护理和使用指南（1996）进行，并经浙江大学机构动物护理和使用委员会批准。2.7. XFBD的体内从LPS诱导和XFBD治疗（2.16g· kg-1）的小鼠获得的血清和肺样品被处理用于体内成分和代谢物分析。将血清样品（60μ L）加入到4倍于其体积的甲醇中进行蛋白质沉淀。将混合物以12000转/分钟（rpm）离心10分钟，然后将上清液蒸发至干。用150μ L 80%甲醇溶解残留物，采用与浸提液相同的方法进行LC-Q-TOF-MS分析将肺样品在5倍体积的80%甲醇中匀浆，并以12 000 rpm离心15 min。然后将上清液用于LC-Q-TOF-MS分析。将MS数据与XFBD的先前MS分析进行比较以鉴定组分。为了定量分析，加入100μL血清样品用四倍体积的甲醇沉淀蛋白质。将整个肺组织样品在1 mL 80%甲醇中匀浆。离心后，将血清和肺样品的上清液蒸发至干;最后，将残留物yyyyyhttp://genemania.org/。https://string-db.org.yyyyyyhttps://david.ncifcrf.gov/。L. Zhao，H.Liu，Y.Wang等人工程20（2023）6366·····×·········×··×············全部用100μ L 80%甲醇溶解，用于LC-Q-TOF-MS分析。2.8. LPS诱导和XFBD处理小鼠使用DESeq2 R软件包（版本1.16.1）对LPS处理组和XFBD处理组的单核细胞进行差异表达分析。DESeq2提供了统计例程，用于使用基于负二项分布的模型确定数字基因表达数据中的差异表达。使用Benjamini和Hochberg方法[14]调整所得P将DESeq2发现的经校正P0.05的基因指定为差异表达。在STRING数据库上进行差异表达基因的蛋白质使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8y.2.9. 用于抗炎活性评价的巨噬细胞活化模型RAW 264.7细胞系购自中国科学院上海细胞库（Shanghai CellBank of Chinese Academy of Sciences（China）），并在含有10%FBS和抗生素（100单位mL-1青霉素和100μ g mL-1链霉素）的高葡萄糖DMEM将细胞以100 000个细胞的密度接种在12孔板中。1天后，将细胞与Poly（I：C）（10μ g mL-1）+-Pam 3CSK 4（100 ng mL-1）（P2P）共孵育，并进行药物测试24小时。浓度设定如下：、大花野牡丹E. 和Phragmitis R.，800、400和200l g mL-1;亚美尼亚S.，你好，和ZeroR.，400、200和100μ g mL-1;Lepidii/播娘蒿S.，200、100和501 g mL-1;Coi-cis S.，50、25和12.51 g mL-1;100%乙醇，4、2和11 g mL~（-1）;马鞭草属， 2、1和0.5lgmL-1;广藿香属（Pogostemonis H.） 1，0.5，和0.251 g mL-1;和Epheptide H.，0.125、0.0625和0.03131 g mL-1。这些草药提取物和化合物的浓度是根据它们对细胞的毒性和我们的研究结果结合起来过去的经验[15]。 作为阳性对照，地塞米松（DEX）1.2l mol L24小时之后，根据制造商的说明，收集细胞培养基，使用ELISA试剂盒测量IL-6浓度2.10. Western blotting用化合物预处理24小时的RAW 264.7细胞（3 × 105细胞/孔）用P2P处理1小时。通过含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液产生细胞裂解物裂解物用上样缓冲液制备，并通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭膜，并在4 °C下与特异性一抗孵育过夜。在用含有Tween 20的tris缓冲盐水（TBST）洗涤三次后，将膜与相应的第二抗体在室温下孵育1小时，随后洗涤。用化学发光法检测膜的信号。最后，使用ImageLabv5.2软件（Bio-Rad，USA）进行条带密度yhttps://david.ncifcrf.gov/tools.jsp。2.11. 斑马鱼断尾与药物治疗Tg（mpeg：eGFP）[16]和Tg（Lyz：dsRED2）[17]转基因斑马鱼获自浙江大学实验动物中心。按照标准原生态系统饲养斑马鱼[18]。E3培养基（0.29g L0.048 g L7.2)用作胚培养基。胚胎通过自然产卵获得。所有斑马鱼实验均按照浙江大学实验动物中心动物伦理委员会的指导原则对于药物预处理，将受精后5天（dpf）的斑马鱼胚胎在补充有XFBD总配方、XFBD草药提取物或化合物的胚胎培养基中孵育24小时。对于单次给药，浓度如下：麻黄碱为0.25lg mL-1 H. 11gmL-1。、2.5 1g mL-1为马鞭草 H. 、6 1g mL-1为你好、34 l g mL-1。、50 1g mL-1为薏苡 S. 、其它草药的最大吸收量为200μ g mL~（-1）。在协同效应试验中，每种药物的剂量减少到单药剂量的一半。 针对化合物测试，的浓度为20lmol L草药提取物和化合物的浓度根据其毒性和溶解度以及我们以前的经验单独或组合确定[19]。斑马鱼尾鳍损伤模型已被大量报道[18简言之，将胚胎在0.016%三卡因（A5040; Sigma-Aldrich）中麻醉，并在一致的解剖部位用无菌手术刀进行尾部切除，该部位略位于尾循环末端的后部。在尾部横切约5分钟后，将鱼胚胎在新鲜胚胎培养基中回收，然后在成像前在相应的药物溶液中再孵育4小时。2.12. 显微镜成像和图像分析使用荧光显微镜（DMI 3000 B; Leica，Germany）对巨噬细胞或嗜中性粒细胞的尾部积聚进行成像，并用ImageJ软件（版本1.52q;NIH，USA）进行定量。如先前报道的，手动计数受伤尾部区域中相同大小的限定区域中的细胞数量[20，21]。对于延时成像和巨噬细胞迁移的自动跟踪，在科学玻璃底细胞培养皿（F15 mm; NEST，中国）上，将截肢的幼虫固定在含或不含药物溶液的胚胎培养基中的1.2%低熔点琼脂糖（0815; Amresco，USA）中。使用具有10光电倍增管（PMT）检测器物镜的共焦激光扫描显微镜（TCS SP8，Leica ） 进 行 共 焦 显 微 术 在 28°C 下 以 8 分 钟 的 间 隔 使 用 LeicaApplication Suite X软件从所获得的z-堆叠中生成对于速度分析，使用Image J软件手动追踪迁移的巨噬细胞。2.13. RNA分离、互补DNA（cDNA）合成和定量聚合酶链反应（qPCR）用RNA-quick纯化试剂盒（RN 001; EZ Bioscience，USA）提取斑马鱼胚胎的总RNA，然后用HiFiScript cDNA合成试剂盒（CW 2569M，ComWin Biotech，China）转化为单链cDNA。采用两步定量RT-PCR方法，使用2SYBR green qPCR混合物（B21202; Bimake，中国 ） 进 行 实 时 聚 合 酶 链 反 应 引 物 序 列 为 ： ef 1a （ 内 参 ） 正 向AGAAGGCTGCCAAGACCAAG，反向AGAGGTTGG-GAAGAACACGC;116正向CGCTAAGGCAACTGGAAGAC，反向L. Zhao，H.Liu，Y.Wang等人工程20（2023）6367··CCAGACCACTGGGAAACACT;il 1b正向TGTGTGTTTGGGAATC-TCCA，反向CTGATAAACCAACCGGACA。2.14. 统计分析所有数据均表示为平均值±标准差。使用双尾Student t检验分析两组之间的差异采用单因素方差分析（ANOVA）进行多组比较。使用GraphPad PRISM 8.0软件（GraphPad Software，Inc.，美国）。认为P0.05具有统计学显著性。3. 结果3.1. XFBD中化学成分的高分辨质谱尽管 XFBD 在 COVID-19 治疗 中获得了 积极的 临床反 馈，但XFBD的化学组成仍然难以捉摸，阻碍了对其药理机制的进一步阐述因此，我们首先通过UPLC-Q-TOF-MS分析了XFBD的化学组成（图1）。 1（a））。 在检查原始数据后，171个独立的离子峰被识别为主要化合物。根据高分辨m/z的结果，得到了这些化合物的分子式然后从文献和公共数据库中初步推断其候选结构，并通过MS碎片化进一步证实。随后，共鉴定或初步表征了XFBD的104种成分（附录A中的表S1）。鉴定出黄酮类化合物36种，萜类化合物22种，羧酸类化合物21种，生物碱类化合物3种，蒽醌类化合物3种，其它19种。其中，通过与参比标准品在保留时间和质谱方面的比较，明确鉴别了33种化合物（附录A中的图S3根据MS2谱图的相似性，利用MS2数据构建了XFBD的分子网络（图1（b））。具有从原始数据识别的MS2数据的每个单个离子被表示为节点。基于负模式的MS谱，得到1125个节点和1686条链路，其中23个簇包含5个以上节点;而基于正模式的MS谱，得到616个节点和1272条链路，其中9个簇包含5个以上节点（附录图S4A）。与MS鉴定结果一致，黄酮类化合物、萜类化合物和羧酸构成了分子网络中的主要簇，提供了这些化合物是XFBD的主要组分的证据。3.2. 基于MS的网络药理学分析表明XFBD在病毒感染，炎症和肺损伤中起调节作用接下来，通过网络药理学分析LC-MS鉴定的XFBD化合物的潜在功能靶标。通过在数据库（例如，ETCM、TCMSP和TargetNet），总共有751个命中被预测为XFBD靶标，其中超过33.5%的命中被识别为COVID-19相关基因（详见第2.5节我们继续使用这些重叠的基因来构建靶网络。在245次点击中，建立了2897个连接，平均连接度为23.6。（附录A图S5）。接下来，通过STRING对中心靶标进行功能富集分析。值得注意的是，17%的富集途径与肺损伤相关，13%与细菌或病毒感染相关，12%与免疫调节相关（附录A中图S6）。两者之间的整合关系化合物-靶点-抗病毒活性、免疫调节和抗肺损伤活性的途径示于图1B中。S7在Appen-A.A. 值得注意的是，Toll样受体（TLR）和核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体信号传导途径--这两种主要的模式识别受体在激活针对微生物感染的免疫应答中至关重要[22]--是与XFBD相关的主要途径之一，靶基因如TNF-α、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基c基因（PIK 3CG）和前列腺素-内过氧化物合酶1/2基因（PTGS 1/2）。总之，基于MS的网络药理学的结果强烈表明XFBD在对病原体入侵的免疫应答中具有调节作用。3.3. XFBD抑制LPS诱导的小鼠急性炎症为了验证通过网络药理学分析预测的XFBD的免疫调节作用，我们在LPS诱导的炎症小鼠模型中测试XFBD的功能。LPS以20 mgkg-1给药4小时足以诱导小鼠的急性炎症，如促炎细胞因子（包括IL-6、TNF-α和IL-1b）的血清水平大大增加所证明的. 发现在LPS刺激之前用XFBD预处理3天显著抑制促炎性细胞因子的释放，表明XFBD在LPS诱导的免疫超活化中的抑制作用（图1A和1B）。2（a）-（d））。此外，组织病理学检查检测到LPS处理后肺组织中的典型炎症变化（图2（e））。与未损伤对照组相比，LPS刺激小鼠的肺泡隔显著增厚，伴有严重的炎性细胞浸润。在XFBD预处理的小鼠中，肺病理学改变大大减轻病理图像进一步量化了肺间质组织面积与充满空气的肺泡腔面积。结果表明LPS处理的小鼠中肺泡隔增厚，表明炎性浸润增加;这种表型在XFBD处理的小鼠中基本上得到解决（图1B）。 2（f））。为了分析XFBD的内源性成分和代谢物，对经口给予XFBD后LPS刺激小鼠的血清和肺样品进行LC-Q-TOF-MS分析（附录A中图S8）。结果表明，在血清中共检测到67种成分，其中1种成分仅以原型存在，20种成分既以原型成分存在又以代谢物存在，46种成分仅以代谢物存在。在肺中共检测到57种成分，其中2种为原型，21种为原型成分和代谢物，34种仅为代谢物。定量分析进一步表明，几个代表性的化合物，包括胡萝卜酸，柚皮苷，和isoliquiritin存在于血清或肺样品的LPS治疗的小鼠口服XFBD 3天后，在0.4-此外，与血清相比，在肺样品中观察到更高浓度的几种样品，表明肺可能是XFBD的关键靶器官之一。代表性化合物的分布见附录A中的图S9，详细信息见附录A中的表S2和S3以及图S103.4. XFBD在多种感染和炎症相关途径为了系统地评估XFBD治疗对LPS刺激的小鼠模型中的基因表达谱的影响，收集PBMCs并通过流式细胞术检查。L. Zhao，H.Liu，Y.Wang等人工程20（2023）6368图1.一、基于MS的XFBD分子网络和网络药理学分析（a）具有正模式和负模式的XFBD的基峰质谱（b）XFBD分子网络的主要簇不同颜色的节点代表不同的复合分类。黄色：类黄酮;红色：萜烯;绿色：羧酸;蓝色：糖苷。信使RNA（mRNA）测序。基于用或不用XFBD治疗的LPS诱导的小鼠的转录组学分析，鉴定了1077个差异表达基因（DEG），其中871个上调基因和206个下调基因（图3（a））。此外，对照组和仅LPS组之间有357个DEG差异表达，这可能与LPS诱导的炎症的发展有关（图3（b））。接下来，我们将357个DEG纳入PPI分析（附录A中的图S11）和途径富集。血小板活化，细胞外基质（ECM）-此外，在357个DEG中，在XFBD治疗后，107个DEG的表达逆转或部分恢复至正常水平（附录A中的图S12）。 重要的是，在炎症过程中的多个关键调节因子的表达在XFBD治疗后改变。例如，血管内皮生长因子A（VEGFA），其已被建议促进L. Zhao，H.Liu，Y.Wang等人工程20（2023）6369图二、XFBD抑制LPS诱导的小鼠急性炎症（a）XFBD施用和LPS注射的方案（2.16g·kg-1对 LPS（20 mg·kg-1，4 h）诱导的血清炎性细胞因子分泌有抑制作用。每组至少检查6只动物（*：P0.05，**：P0.01 vs生理盐水; #：P0.05，##：P0.01 vs LPS）。(e)各组肺组织HE染色。(f)小鼠肺病理切片定量：（空白区大小/大小总面积）×100%。为进行分析，对每只小鼠拍摄一张切片图像，每组包括3只小鼠（*：P0.05，**：P0.01 vs生理盐水）。i.p.：腹膜内注射;例如：灌胃给药。SARS-CoV-2感染期间的炎症[23]被鉴定为具有最多连接靶标的靶标，并且可以被XFBD下调。特别值得注意的是，已报道调控基因之间的多个命中在巨噬细胞功能中起作用。例如，据报道可溶性CD93（sCD93）可诱导单核细胞分化为巨噬细胞样细胞[24]，sCD93的增加与巨噬细胞浸润相关[25]。此外，核的长同种型因子红细胞2相关因子1（NFE 2L1）作为M1极化（其是巨噬细胞的炎性表型）和促炎反应的负调节剂起作用[26]。由于巨噬细胞是先天免疫应答中有效的免疫调节细胞，我们想知道XFBD是否通过介导巨噬细胞的功能起作用。因此，我们继续测试XFBD对巨噬细胞活化和迁移的影响，这是巨噬细胞介导的免疫应答的两个关键过程。L. Zhao，H.Liu，Y.Wang等人工程20（2023）6370···图三.转录组学分析表明，XFBD在多种感染和炎症相关途径中调节基因表达。（a）用或不用XFBD处理的LPS刺激的小鼠的DEG的计数和红色：上调基因;绿色：下调基因;蓝色：无显著变化的基因。Padj：调整P值。(b)各组DEG的维恩图。(c)京都基因和基因组百科全书（KEGG）357个重叠DEG的途径富集。FC：倍数变化。3.5. XFBD及其活性化合物抑制巨噬细胞活化体外由于巨噬细胞活化在炎症的起始中起关键作用，我们检查了XFBD对用TLR 2激动剂Pam3CSK 4和TLR 3激动剂Poly（I：C）刺激的巨噬细胞活化细胞模型的影响[27]。先前的研究表明，与单个TLR活化相反，多TLR活化可能在巨噬细胞中刺激更严重的细胞因子应答[28]。由于IL-6是由巨噬细胞分泌的主要促炎细胞因子，并且与M1巨噬细胞的分化相关[29]，因此在我们的测定中使用IL-6的释放来评价巨噬细胞活化的水平。如所预期的，TLR激动剂在我们的模型中显著诱导IL-6的释放（图1A和1B）。4（a）和（b））。重要的是，用6.25-100.00 μ g mL - 1范围内随后，XFBD配方中所有12种草药提取物的抗炎作用在通过各自的细胞毒性测定确定的剂量水平下 进 行 评 估 。 因 此 ， 在 。 、 Phragmi tis R. 、 大 花 野 牡 丹 E. ，ZeroR. ，以及cocos。显著抑制IL-6的释放，并呈剂量依赖性; 对IL-6释放产生一定的影响（图4（c））。进一步筛选出具有代表性的有效成分。异甘草苷、毛蕊花糖苷和虎杖苷在10、20和30 μ mol/L时显示出抑制IL-6分泌的剂量依赖性趋势。50 lmol L之间这些，统计学显著的抑制影响是观察到为异甘草素和毛蕊花糖苷.50l mol L先前的研究表明，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，包括p38 MAPK、c-Jun N-末端激酶（JNK）和MAPK-细胞外信号调节激酶（ERK）（MEK），在调节巨噬细胞和其他免疫细胞介导的炎症反应中发挥重要作用[30，31]。因此，我们进一步探索XFBD化合物对MAPK信号传导的影响，使用异甘草素作为代表。有趣的是，异甘草素显著下调磷酸化JNK的蛋白质水平，但在p38的磷酸化中显示出增强作用（图1A和1B）。4（e）和（f））。已经一致报道了p38对JNK磷酸化的负调节作用[32]，并且JNK超活化与巨噬细胞的M1表型转换相关[33]。这些结果证实了XFBD及其主要成分对巨噬细胞活化过程的体外抑制作用。3.6. XFBD抑制炎症诱导的巨噬细胞募集体内免疫细胞从微循环向受损组织的募集是后续炎症反应的先决步骤因此，我们继续研究XFBD及其组分在巨噬细胞动员过程中的作用。为了动态观察巨噬细胞迁移的内源性过程，我们采用了斑马鱼断尾诱导的炎症模型。如先前研究中所观察到的[20]，在Tg（mpeg：eGFP ） 和 Tg （ Lyz ： dsRED2 ） 转 基 因 系 中 分 别 在 截 肢 后 4 小 时（hpa）检测到荧光素标记的巨噬细胞和中性粒细胞的积累。为了检查其效果，在断尾之前24小时和之后立即将XFBD补充到斑马鱼胚胎的培养基中，直到显微镜分析（图1A和1B）。 5（a）和（b））。重要的是，XFBD在4hpa下在减少创伤部位处的巨噬细胞的数量方面显示出剂量依赖性作用（图1A和1B）。5（c）和（d））。此外，XFBD对细胞迁移的负调节似乎根据先天性免疫细胞的类型而变化，因为中性粒细胞在横切尾部的积累不受XFBD处理的影响（图1A和1B）。5（e）和（f））。总之，这些结果表明，XFBD选择性抑制斑马鱼断尾模型中炎症诱导的接下来，使用延时共焦成像，动态记录小鼠尾横断后巨噬细胞的增殖情况。值得注意的是，在XFBD中孵育的胚胎中，巨噬细胞朝向创伤部位的移动速度大大降低，这表明XFBD直接抑制巨噬细胞动员（图1A和1B）。5（g）及（h），附录A的录像S1及S2）。此外，为了评估药物对断尾胚胎炎症状态的影响，我们检测了IL-6和IL-1b的转录水平。在断尾胚胎中，发现XFBD处理后两种促炎性细胞因子的表达显著减弱（图1B）。 5（i））。3.7. 多种XFBD中药成分在抑制微噬细胞迁移此外，我们考虑了XFBD配方中是否存在下调微噬细胞迁移的协同效应。从总XFBD溶液制备总共12种草药提取物，并筛选每种提取物对微噬菌体迁移的调节作用你好和以弗所。显著抑制巨噬细胞向创伤部位的募集。 你好 也显示出边际抑制作用，但没有统计学意义（图11）。 6（a））。L. Zhao，H.Liu，Y.Wang等人工程20（2023）6371图四、血府逐瘀汤及其活性成分抑制体外巨噬细胞活化。（a）巨噬细胞活化和分析的方案（2）6.2 5~10 0.0 0 lg·mL-1的仙芪扶正汤提取物(c)用不同化合物处理的巨噬细胞中IL-6的蛋白水平（n= 3，**：P0.01，*：P0.001 vs P2P）。DEX用作阳性对照。每种治疗的详细浓度见第2.9节。（d）在P2P刺激的巨噬细胞模型中，不同剂量的代表性XFBD化合物对IL-6释放的影响通过比较各化合物处理组与模型组的值来计算相对IL-6浓度（e，f）异甘草素（50lmol·L-1）对JNK（p-JNK）、p38（p-p38）和MEK（p-MEK）磷酸化的影响代表性蛋白质印迹见（e），统计图见（f）（n= 3;*：P0.05 vs P2P; #：P0.05，##：P0.01 vs对照）。CTR：对照。炎症的病理过程与中医理论中的“热毒”症状有关。因此，从XFBD全方中选择具有”清热解毒“（清热解毒）功能的药物你好 和以弗所。 为了确定