氯喹和羟氯喹在COVID-19治疗中的生物/化学信息学评估

医学信息学解锁21（2020）100446氯喹和羟氯喹用于对抗COVID-19：使用生物/化学信息学工具拉尼娅·M Hathout a，*，Sherihan G. 放大图片作者：Abdelhamid b. Metwally a，ca埃及开罗Ain Shams大学药学院药剂学和工业药剂学系b埃及开罗艾因夏姆斯大学药学院生物化学系c科威特科威特大学药学系保健科学中心药剂学系A R T I C L EI N FO关键词：氯喹COVID-19明胶生物信息学鼻内受体肺病毒A B S T R A C T氯喹（CQ）和羟氯喹（HCQ）作为抗病毒药物正在进行多项临床试验以评估其有效性和安全性。然而，关于它们在抗击COVID-19方面的有效性仍存在很大争议。本研究旨在使用生物/化学信息学工具评估CQ/HCQ鼻内和/或肺部给药治疗COVID-19的可行性。因此，我们假设通过明胶基质的鼻内和肺部途径的成功克服了与CQ和HCQ药效学和药代动力学性质相关的几个挑战，并增加了它们在初始病毒进入部位的局部浓度，同时使潜在的副作用最小化。明胶模拟基质上的分子对接显示了高的载量值和持续释放曲线。此外，在肺和鼻内组织中表达的粘蛋白以及各种受体（包括血管紧张素转化酶2（ACE-2）、硫酸肝素蛋白聚糖和磷脂酰肌醇结合网格蛋白组装蛋白（PICALM），其代表病毒颗粒附着到呼吸细胞表面的初始位点）上的对接已经显示CQ和HCQ与这些受体的良好结合。所提供的数据提供了一种新型药物制剂的使用的见解，需要在充分的动力随机对照临床试验中进行测试;旨在针对这种大流行性病毒感染的持续预防效果和/或治疗策略1. 介绍严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2型（SARS-CoV-2）感染或COVID-19现已被世界卫生组织宣布为新的大流行性疾病，因此迫切需要采取应急措施来应对这一迫在眉睫的全球挑战。鉴于感染的新颖性和缺乏预防性疫苗或经证实的治疗方法，目前正在采用药物再利用来对抗这一全球性疫情。这是一种新兴的策略，现有的药物已经在人类中测试安全，被重新部署以对抗难以治疗的疾病。氯喹（CQ）及其衍生物，氢氯喹（HCQ），已被用作疟疾流行地区的预防措施，也用于治疗世界各地的自身免疫性疾病CQ已显示出对病毒的治疗活性[40]，包括人类冠状病毒OC 43在动物模型[29]和SARS冠状病毒在细胞培养[45]。最近显示CQ和HCQ在细胞培养中具有相似的抗SARS-CoV-2作用[32，59]，因此可能对COVID-19具有预防和/或治疗作用[8]。最近，Wang等人证明，在低微摩尔浓度下，CQ能够在体外在SARS-CoV-2的进入和进入后阶段有效地阻断病毒感染。有效浓度是每日接受500 mg的患者可达到的浓度[49]。最近的证据表明，SARS冠状病毒进入（作为一种纳米粒子） [第六十三章] 成 宿主细胞 包括受体介导的内吞作用[64]尽管最初认为它直接与质膜融合[48]。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）被证明为病毒细胞表面的刺突蛋白提供了初步的对接位点[46]，并在SARS冠状病毒早期入侵中发挥重要作用。附接相[30]。的人类状病毒 NL63* 通讯作者。Department of Pharmaceutics and Industrial Pharmacy，Faculty of Pharmacy，Ain Shams University，African Union Organization St，11566，Cairo，Egypt.电子邮件地址：r_hathout@yahoo.com，rania. pharma.asu.edu.eg（R.M. Hathout）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2020.100446接收日期：2020年8月13日;接收日期：2020年10月5日;接受日期：2020年10月5日2020年10月8日网上发售2352-9148/©2020的 作者。发表通过 Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：http://www.elsevier.com/locate/imuR.M. Hathout等人医学信息学解锁21（2020）1004462HCoV-NL 63也显示出利用HSPG附着于靶细胞[36]。已确定血管紧张素转换酶2（ACE 2）作为SARS-CoV和HCoV-NL 63的功能性受体，触发胞吞作用驱动的细胞进入[31，52，54]。类似地，SARS-CoV-2可能利用ACE 2介导的宿主细胞进入机制[53]。SARS-CoV还显示利用网格蛋白介导的和网格蛋白/小窝独立的内吞机制进入人靶细胞[8，26]。此外，磷脂酰肌醇结合网格蛋白组装蛋白（PICALM）是一种货物选择网格蛋白衔接子，可感知并驱动膜曲率，从而调节胞吞作用速率[37]。CQ抗SARS-CoV活性在细胞培养物中得到证实，即使在病毒感染后给药[45]。这包括通过增加内体和溶酶体的pH值来抑制pH依赖性病毒融合/复制[60];防止病毒糖蛋白包膜和宿主受体蛋白的糖基化[13]。此外，CQ引起病毒体组装的抑制[9，40]。除了直接的抗病毒作用外，CQ及其衍生物被证明通过减弱促炎因子和受体的表达而表现出宿主效应[10]，促炎因子和受体可诱导急性呼吸窘迫综合征，并参与与COVID-19疾病严重程度相关的细胞因子风暴[25]。 此外，CQ和HCQ不仅具有抗病毒和抗炎作用，而且具有抗血栓形成作用[39]。尽管如此，CQ被证明是锌离子载体[57]，其中该元件通过干扰病毒RNA依赖性RNA聚合酶来对抗病毒复制[28]。CQ/HCQ在治疗和预防COVID-19的临床背景下的有效性和安全性在几项临床试验中得到了解决，这些临床试验显示了不一致的结果。一项超过100例患者的临床研究证明，CQ磷酸盐在抑制肺炎恶化和缩短病程方面优于对照组，且无严重不良事件[13]。一项在20名患者中进行的非随机开放标签试验显示，HCQ单独或与阿奇霉素联合治疗6天后可诱导鼻咽样本中的病毒清除[14]。另一方面，一项涉及1446名COVID-19住院患者的观察性研究显示，HCQ给药与插管或死亡复合终点的风险大幅降低或增加无关[15]。最近发表的一项系统性综述得出结论，COVID-19患者只有在适当监测的情况下，并且如果治疗处于高质量随机对照试验的背景下，才应接受CQ/HCQ治疗[11]。了解CQ和HCQ影响SARS的机制-CoV-2对于优化和开发预防和治疗策略至关重要[24]。我们试图使用生物/化学信息学工具评估CQ和HCQ作为潜在的抗SARS-CoV-2的药物，旨在为辩论提供帮助。两种研究的分子之间的差异（如果有的话）可以归因于药物的主要结构、拓扑和电子描述符的差异[20，35]。通过研究与HSPG、ACE-2和PICALM的相互作用，在与抑制宿主细胞内吞作用有关的治疗水平上评价了两种药物。还通过比较明胶微球基质中的载量（作为形成微粒系统（微米和纳米）的基础）在制剂水平上对它们进行了评价;通过研究与粘蛋白的相互作用在生物制药水平上对它们进行了评价。CQ及其衍生物据报道具有高体积的分散性，口服给药后达到100 l/kg患者体重的水平，表明在组织隔室中分布较高;因此必须以相对较高的口服剂量给药;这一事实导致相关副作用[19]。这些影响的范围可能从眼部到X线[41]到心肌梗死[5]。这可能反过来限制其临床应用，并阻碍COVID-19患者的成功治疗。为此，本研究的目的是评价CQ/HCQ制剂通过口服递送以外的替代途径（如鼻内和/或肺部途径）给药的可行性。将药物的再利用与重新配制相结合有助于增加SARS-CoV-2初始进入部位的药物局部浓度，并导致持续的预防效果和/或作为治疗策略，同时可能减少不良事件。2. 方法2.1. 虚拟载体的分子动力学模拟构建采用GROMACS（17）v4.6.5软件包进行全原子分子动力学模拟。根据CHARMM通用力场（CgenFF），在线（https://cgenff.paramchem.org/）进行明胶基质的原子分型和参数及电荷分配[35为了制备明胶系统，构建了48个肽分子，每个分子包含18个氨基酸。肽的一级序列为AGPRGQ（Hyp）GPAGPDGQ（Hyp）GP。然后对矩阵进行分子动力学运行，具有完整的周期性边界条件，时间步长为2 fs，以及范德华力和静电相互作用的截止距离1 nm。PME用于计算静电相互作用，LINCS算法用于约束所有键。使用V-重新调节的恒温器在1巴的压力下使用Berendsen恒压器在298 K下使系统平衡7 ns。2.2. 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）的构建HSPG的化学结构获自PubChem®，使用ChemDraw®Ultra包版本10绘制，其中两个分子（模拟存在于细胞膜中的HSPG）用于在能量最小化后使用MMFF 94X力场进行对接，所述力场见于MoE®版本2014.0901（Chemical Computing Group Inc.，加拿大蒙特利尔）。2.3. 获得目标肽和蛋白质虚拟矩阵相 关 递 送 和 相 关 受 体 靶 标 的 晶 体 结 构 获 自 蛋 白 质 数 据 库（http://www.rcsb）。org）。代码2ACM对应于粘蛋白。代号6 m17和3 zyk分别对应ACE-2和PICALM。使用MoE®版本2014.0901（ChemicalComputing Group Inc.，加拿大蒙特利尔）。2.4. 为对接准备药物化学结构对应于所研究的抗疟药物的化学结构的异构体SMILES; CQ和HCQ使用Pub-Chem ®获得。使用MoE®版本2014.0901（Chemical ComputingGroup Inc.，加拿大蒙特利尔）。此外，使用相同软件的MMFF 94X力场对所有研究的分子进行能量最小化[21]。2.5. 被调查药品在被调查载体上的对接使用MoE版本2014.0901（Chemical Computing Group Inc.，加拿大蒙特利尔）。将蛋白质纳米颗粒基质的PDB文件导入MoE，其中鉴定使用MoE的“Site finder“工具[ 23 ]进行结合位点的阳离子化。对接实验是使用“三角形匹配器”作为放置方法进行的。使用的软件在对接目标周围创建虚拟原子R.M. Hathout等人医学信息学解锁21（2020）1004463原子的这些虚拟原子被认为是对接位置。使用London ΔG评分计算结合能评分值。London ΔG评分函数估计来自给定最佳位姿的配体结合的自由能。2.6. 计算研究药物的主要描述符为了解释所研究的药物观察到的对接分数的差异，计算了一些关键的结构、电子和拓扑描述符。选择的描述符是分子量、XLogP、拓扑极性表面积、H原子供体和受体的数量以及最后的片段复杂性。使用Bioclipse®版本2.6（Bioclipse项目，Uppsala University，Sweden），使用使用ChemDraw® Ultra版本10生成的分子mol文件计算描述符。2.7. 统计分析本 研 究 中 的 所 有 统 计 分 析 均 使 用 GraphPad Prism® v.5.0（GraphPad软件，San Diego，CA）进行，显著性水平P <0.05。<3. 结果和讨论COVID-19感染对全球的影响深远，因为它代表着一种公共卫生威胁，正进入一个超越遏制的阶段。重新开发药物是一个漫长而昂贵的过程，因此面对当前的全球需求不切实际。抗疟药CQ和HCQ在细胞培养研究中显示可阻断COVID-19感染[50，59]。特别是，最近发现CQ在减少病毒复制方面非常有效，由于其在组织（如肺bib）中的良好渗透，使用标准剂量可以轻松实现[7，33]。深入研究这些药物可能影响SARS-CoV-2的几种机制，将为治疗这种感染所需的合理配方提供更深刻的见解。在这项研究中，生物/化学信息学工具部署到研究的CQ和HCQ到明胶基质的对接作为形成颗粒系统（微/纳米）的基础。表1显示了两种研究药物HCQ和CQ在相关大分子上对接后获得的结合能。这两种分子都表现出良好的相互作用与研究的载体和受体。 在进行非配对t检验后，在GraphPad Prism® v.5.0中，结合能评分略低（P0.05）（ΔG负值更大）表明HCQ与明胶基质的相互作用更好。<这可以归因于其与CQ对应物相比，其更高的总极性表面积和更多可与明胶羧基和氨基相互作用的氢键供体和受体证明了更亲水的性质[22，38这种更高的相互作用可导致HCQ更高的负载潜力和更持续的释放效果，具体地，从表1研究药物与相关大分子对接后的对接结合能（ΔG）值。明胶基质X.由于明胶的高生物相容性、经鼻和肺部给药的适用性、粘膜粘附特性及其对几种亲水性和疏水性药物的负载效率，明胶已被合理地选择为用于负载所研究药物的纳米颗粒基质材料[1，22，42]。在遵循作者先前研究的相同方案后，使用所采用的分子动力学方法成功构建明胶基质[23，35]。在递送水平上，两种药物对粘蛋白的对接结果粘蛋白是存在于气道中的丰富的小分子[47]。此外，HCQ与HSPG、ACE-2和PICALM的亲和力较高这可能归因于HCQ的较高极性和亲水性性质，如其物理化学描述符所示;较高的总极性表面积、较低的LogP值和较高的氢键供体和受体数量（表2）。这些是保证与粘蛋白、ACE-2和PICALM中存在的亲水性氨基酸相容性的关键性质，所述亲水性氨基酸例如：天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和苯丙氨酸。此外，其他HCQ结构和拓扑描述符，例如：较少的球形度、较高的分子柔性和较低的分子量，有助于总体上更好的亲和力和相互作用，无论是与上述酶还是与HSPG（表2）。然而，获得的HCQ结合能（表1）明确表明与研究的大分子的显著相互作用和高亲和力（图1）。①的人。HSPG作为主要结合位点，促进病毒对接，促进随后与特异性受体的相互作用，并且还作为非允许细胞上的储存位点，通过将病毒呈递给它们的靶细胞来介导此外，硫酸乙酰肝素存在于肺组织中，是肺止血所必需的[17]。 ACE-2已被证明是一种共受体，对于SARS-CoV-2病毒进入，越来越多的证据表明它在COVID-19的发病机制中具有促进作用[61]。ACE-2在许多身体组织中表达，包括肺[27，56，62]。CQ可干扰ACE-2受体糖基化，从而阻止SARS-CoV-2附着于靶细胞[33，49]。 PICALM在鼻咽、支气管和肺组织中显示中等 分 布 （ https://www.proteinatlas.org/ENSG00000073921-PICALM/tissue）。PICALM是网格蛋白包被的凹坑中最丰富的三种蛋白质之一。该受体的消耗先前已显示抑制网格蛋白介导的胞内作用;SARS病毒内化的重要机制[24，37]。这也被认为是纳米颗粒内化的主要机制[2，12]。合理地，利用纳米颗粒制剂可以对病毒进入施加竞争性抑制先前显示CQ和HCQ与PICALM的结合可诱导该蛋白的下调[51]。CQ/HCQ在疟疾或自身免疫性疾病中的安全性已得到充分证实。疾病然而，长期使用高剂量或过量可能会发生一些严重的副作用（心脏毒性、视网膜病和神经肌病）[3，18，19]。CQ磷酸盐治疗COVID-19相关肺炎的临床研究未显示患者出现严重不良反应[13]。另一方面，在一项90名住院COVID-19患者的队列研究中，使用HCQ联合或不联合阿奇霉素治疗COVID-19相关肺炎增加了风险大分子（载体/蛋白质/蛋白聚糖）- PDB代码结合能（千卡/摩尔）校正QT（QTc）延长，并同时接受阿奇霉素与QTc的较大变化相关[34]。COVID-19患者可能更容易受到这些副作用的影响明胶基质-8.72±0.1-10.09 ±0.01（明胶纳米球）粘蛋白-2ACMACE-2-PICALM-3zyk-8.29±0.1-10.49 ±0.2硫酸乙酰肝素蛋白聚糖-8.83±0.1-11.65 ±0.1* ACE-2：血管紧张素转换酶-2。* PICALM：磷脂酰肌醇结合网格蛋白组装蛋白。由于其合并症（如心血管疾病、糖尿病和肥胖）、高龄和随后的合并用药[16]。4. 假设的预防方案CQ和HCQ都显示出对上述受体具有良好的结合评分，如表1所示。此外，在R.M. Hathout等人医学信息学解锁21（2020）1004464表2研究药物的主要理化指标[NH+]（CCO）CC）C）c2cc1图1.一、 羟氯喹在[A]明胶基质、 [B]粘蛋白、[C] PICALM、[D] ACE-2和[E]硫 酸 乙酰肝素上的对接结果。Bernard等人[4]进行的一项有趣的研究证明，鼻内CQ可有效降低以30mg/kg剂量给药的BalB/c小鼠的SARS病毒滴度，降低幅度约为半个对数量级。在最近的研究中，发现SARS-CoV-2进入因子在鼻上皮细胞中高度表达[43]。这一发现鼓励并保证了所建议的抗病毒药物的鼻内给药途径的使用。因此，我们建议在正在进行的临床试验中测试鼻内和肺部途径作为口服递送的替代途径。将药物直接给予病毒进入部位的优点包括受影响组织（肺和鼻内组织）中的药物浓度更高，同时避免了大的全身浓度[6]，并最大限度地减少了潜在的副作用。这对于需要延长药物给药的任何预防性治疗都是非常有益的，特别是在CQ或HCQ的情况下。根据FDA的说法通过静脉和口服途径的替代途径，应根据应用区域进行标准化[44]。取人鼻内和肺面积为Balb/c小鼠的5倍。此外，现在众所周知，鼻内和肺部剂量比口服剂量更有效，因此通常可以下调剂量[55]。因此我们建议每日剂量为50微/纳米球基质与锌口服补充疗法[28]。微球将赋予与持续释放效果相关的药物更好的接触和局部化。与微球作用互补的是，纳米球通过PICALM机制与病毒竞争性抑制而提出了另一种对抗病毒的机制，并且还将赋予更好的渗透到肺细胞中（在治疗目的的情况5. 结论和未来展望因此，我们建议在旨在预防和/或治疗COVID-19的充分设计和有效的临床试验中，评估通过鼻内和肺部途径使用CQ或HCQ的有效性和安全性。我们提出了一种新的想法，将这些相关的重新用途的药物配制在组合的明胶微/纳米颗粒基质系统中，该系统将通过鼻内和肺部途径给药。这将导致一方面预防和竞争性抑制细胞病毒入侵，另一方面增加药物渗透，增强和维持它们的抗病毒活性，同时减少它们的剂量，因此减少不利的副作用。值得注意的是，这种虚拟方法可能有利于评估任何其他重新用途的药物或新分子，不仅在生物学上，而且在制剂水平上。分子典型的微笑总极表面积氢键受体氢键供体分子球状性分子柔性logP（o/w）分子量氯喹Clc1cc2nccc（NC（CCC28.20310.1735.9964.287320.888羟氯喹[NH+]（CC）CC）C）c2cc1Clc1cc2nccc（NC（CCC48.40420.1866.6183.252336.89R.M. Hathout等人医学信息学解锁21（2020）1004465竞合利益作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作确认未申报。引用[1] AbdelradyH，Hathout RM，Osman R，Saleem I，Mortada ND.EX开发明胶纳米载体用于肺癌治疗的甲氨蝶呤的肺部递送。 欧洲药物科学杂志2019;133：115-26。[2] 放大图片创作者：Alfrezhaid SM，Hathout RM，Abou-Aisha K.在乳腺癌细胞系MCF-7中使用siRNA负载的胆碱表面修饰的明胶纳米颗粒沉默转移相关基因AEG-1。胶体Surf B生物界面2016;145：607[3] AshleyEA，Recht J，White NJ. 伯氨喹：风险和益处。 Malar J 2014;13：418.[4] 巴纳德DL，日CW，贝利K，海纳M，蒙哥马利R，劳里德森L，陈PK，西德维尔RW。评价免疫调节剂、干扰素和已知的体外SARS-coV抑制剂对BALB/c小鼠中SARS-coV复制的抑制作用。AntiVirChem Chemother2006;17：275[5] Blignaut M，Espach Y，van Vuuren M，Dhanabalan K，Huisamen B.再论氯喹的心脏毒性作用。血管药物治疗2019;33：1-11。[6] 放大图片作者：J.呼吸系统疾病的吸入治疗：肺动力过程的复杂相互作用。可以的. Respir. 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