细胞色素c突变对过氧化物酶活性的分子动力学影响

i本文的最新情况见最后信息学在医学解锁11（2018）51目录可在ScienceDirect医学信息学期刊主页：www.elsevier.com/locate/imu细胞色素c突变体过氧化物酶活性原子分子机制Gurusamy Muneeswarana，b，*，Manickam Pandiarajc，Subramanian Kartheeswarand，Muniyandi Sankaralingame，Kaliappan Muthukumarf，Karunakarana，**a印度泰米尔纳德邦Virudhunagar VHNSN学院（自治）化学系生物医学研究实验室b化学系，高等科学学院，Kalasalingam研究和教育学院，Krishnankoil，626 126，印度泰米尔纳德邦cElectrodics and Electrocatalysis Division，CSIR-Central Electrochemical Research Institute，Karaikudi，630003，Indiad计算机应用硕士系，计算学院，Kalasalingam研究与教育学院，Krishnankoil，626 126，Tamilnadu，印度韩国梨花女子大学化学与纳米科学系，首尔，03760f美国加利福尼亚州森尼韦尔市应用材料公司，邮编：94085A R T I C L E I N F O关键词：过氧化物酶活性细胞色素c突变细胞凋亡分子动力学A B S T R A C T细胞色素c（Cytc）的突变已被报道在调节过氧化物酶活性中，这反过来导致Cytc从线粒体释放和早期凋亡。然而，这种活性背后的分子调节机制仍然难以捉摸。在此，多个20 ns的分子动力学（MD）模拟的野生型（WT），Y67 F和K72 W突变的细胞色素c在水溶液中进行了研究如何改变结构特征的变化改变过氧化物酶活性的蛋白质。分子动力学模拟结果表明，Y67F突变导致关键电子传递残基之间距离增加，ω环内的构象波动增大，蛋白内氢键减弱，导致Cytc血红素裂隙环构象开放，从而增强了过氧化物酶活性。有趣的是，与WT和Y67F相比，上述结构特征在K72W中得到加强，这触发了K72W将Cytc突变为较差的过氧化物酶。基本动力学结果揭示了前两个特征向量负责WT，Y67F和K72W突变的Cytc的整体运动。因此，这项研究提供了原子水平上的深入了解的分子机制的过氧化物酶活性的细胞色素c，这将有助于设计新的细胞色素c的结构，是更可取的比天然的细胞色素c的生物医学和工业过程。1. 介绍计算研究提供了有关分子运动细节的过去十年见证了结构-功能范式向结构-动力学-功能三元组的转变，以研究生物分子在不同时间尺度上的动力学行为以及三级或四级结构的准确知识，以了解蛋白质功能[1]。除了其作为电子载体的公认作用之外，细胞色素c（Cytc）（血红素蛋白）最近引起了越来越多的关注，因为其在过氧化物酶活性和早期凋亡中起重要作用[2，3]。Cytc介导的凋亡途径对于多种生物学事件是重要的，包括脑发育，免疫系统稳态，遗传毒性诱导细胞死亡，因此在保护生物体免受癌症等疾病的侵害方面发挥重要作用[4细胞凋亡调节的异常可导致多种病理，包括神经退行性疾病、自身免疫和癌症[1，2]。细胞凋亡是通过激活半胱氨酸蛋白酶亚家族（称为半胱天冬酶）来实现的在哺乳动物细胞中，主要的半胱天冬酶活化途径是Cytc启动的途径。在其释放到胞质溶胶中后，Cytc与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）相互作用，然后Apaf-1与胱天蛋白酶原-9结合以产生称为凋亡小体的蛋白质复合物[10，11]。半胱天冬酶原被切割成其活性形式，半胱天冬酶-9，这反过来又通过一系列生化反应诱导细胞死亡。翻译后修饰，如酪氨酸硝化、磷酸化、甲硫氨酸磺氧化和突变* 通讯作者。化学系，高等科学学院，Kalasalingam研究和教育学院，Krishnanakoil，626 126，泰米尔纳德邦，印度。** 通讯作者。电子邮件地址：kgmunees@gmail.com（G. Muneeswaran），ckarunakaran2000@gmail.com（C. Karunakaran）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2018.04.003接收日期：2018年3月12日;接收日期：2018年4月10日;接受日期：2018年4月13日在线提供2018年2352-9148/©2018由Elsevier Ltd.发布这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。G. Muneeswaran等人信息学在医学解锁11（2018）5152þþ¼在Cytc中，导致各种构象状态，所有这些构象状态都可以刺激或调节内在的致突变特性[12，13]。这些替代构象的表征及其功能的阐明为细胞死亡程序、发育性细胞死亡、神经变性、癌症治疗和设计新型治疗剂提供了进化方面[14]。结构研究表明，位于特定位置的氨基酸残基在整个进化过程中高度保守，这些残基也被称为发现67位的Tyr和72位的Lys在Cytc的凋亡前过程中发挥重要作用，因为Tyr 67的侧链延伸到血红素口袋中，而Lys 72的侧链驱动Cytc与Apaf-1的相互作用[17]。Tyr 67是位于螺旋内的高度保守的残基（59Tyr 67的羟基与蛋白质的疏水性血红素口袋形成氢键[19]，并参与氢键网络，该氢键网络维持天然蛋白质血红素口袋的稳定，连接ω（Ω）环（残基71此外，Tyr67的侧链羟基与Asn52、Thr78和Met80的侧链形成广泛的氢键网络Tyr67与Phe（Y67F）的突变可导致血红素缝隙环周围的氢键网络的破坏或重定向。这导致半胱天冬酶活化增强，因为该突变体在其电子转移能力方面变得有缺陷，这最终将对过氧化物酶活性产生关键影响，并因此对细胞凋亡产生关键影响[19]。残基Lys 72在Cyt c与Apaf-1的相互作用中起主要作用，并且位于血红素缝隙环附近（71-85）。该环的表面含有Met80血红素配体，其对电子转移和过氧化物酶活性都很重要[17]。 用Trp（K72 W）替换Lys 72已显示重新定位血红素缝隙环，从而降低Cyt c与Apaf-1结合的能力，这确实已被发现消除Cytc的凋亡前功能[17]。除此之外，K72W代表了哺乳动物突变体的极少数实例之一，并且具有电子转移和抗氧化活性[17]。突变体（Y67F和K72W）的晶体结构只能提供静态信息，不能提供用于预测蛋白质功能的结构动态演化信息。在这种情况下，分子动力学（MD）模拟成为一个有用的工具，因为它能够在不同的时间分辨率提供原子水平的信息MD模拟还将提供原子空间和飞秒时间分辨率下蛋白质动态行为的信息学，这通常无法通过实验研究获得[1]。有几份关于描述Cytc动力学行为的模拟研究的报告 [20例如，RajaSingh等人对Cytc的Y67F和F82H突变体进行了4 ns MD模拟，并证实了突变蛋白的构象可变性降低[26]。此外，我们小组最近研究了Cytc在不同溶剂和温度下的结构和构象动力学[27，28]。然而，尽管它们的重要性，这些研究仍然缺乏在分析详细的原子部分的大图片的细胞色素c突变体介导的过氧化物酶活性。因此，在这项工作中，我们进行了多次20 nsMD模拟，详细研究了野生型（WT）和突变型（Y67 F &K72 W）的微观特性。细胞色素c的凋亡形式（Fe3 β），以了解结构的变化，调整细胞色素c的过氧化物酶活性。在这项工作中，通过使用基本动力学（ED）方法[29]进一步分析动力学模拟轨迹。这种技术成功地应用于研究蛋白质的弹性和构象运动[30-35]，提供了将复杂的蛋白质动力学降低到其基本自由度的可能性。因此，本研究所提供的详细的微观水平的信息可能有助于基因工程，设计和修饰比天然Cytc更理想的新型Cytc，用于特定的工业和生物医学目的。2. 计算方法WT Cytc的起始结构取自蛋白质马心Cytc的1.94倍解析精制结构[36]。Cytc的血红素铁呈3氧化态（Fe3+）。氧化状态下血红素辅基的标度Mulliken电荷来自FeliXAutenrieth等人的理论工作[37]。在pH 7.0下模拟蛋白质每种结构都用SPC水完全溶剂化[38]在具有3.668 × 3.049 × 3.651 nm的边的3D bo x中，每个边的bo X角为90 °。分子动力学模拟中的溶剂分子数WT、Y67 F和K72 W分别使用5270、5270和4257所有这些计算均使用GROMACS 4.5.3 [39- 42 ]中实现的GROMOS 96力场进行使用最速下降算法进行能量最小化能量最小化的最大步长是6000 kjmol-1 nm-1。该蛋白质具有8 e的净电荷，并通过引入8个Cl 这通过替换具有最高静电势的八个溶剂分子来进行。在分子动力学模拟研究之前，对蛋白质结构进行了位置约束分子动力学模拟。这涉及限制（部分冻结）大分子的原子位置，同时允许溶剂在模拟过程中自由移动。在所有模拟中，使用与外部温度浴[43]的弱耦合将温度保持在300 K，耦合常数为2 fs，等于介电常数εr1的时间步长 将蛋白质和系统的其余部分分别偶联到温浴中。 LINCS算法[44]用于约束所有键。对于水分子，使用SETTLE算法[45]MD模拟已经进行了20 ns，并在生产运行期间每500 ps收集数据双范围截止值用于计算非-–bonded对于库仑相互作用和Lennard-Jones相互作用，短程截止半径设定为0.9 nm，长程截止半径设定为1.4 nm。 静电相互作用由粒子网格埃瓦尔德（PME）方法处理。基本动力学（ED）研究基于协方差矩阵的对角化，协方差矩阵由MD轨迹中的原子涨落构建，其中已去除整体平移和旋转运动[29]：Cij^Xi-Xi;0，Xi-Xi;0>（ 1）其中X是围绕其平均位置（X0）波动的原子的x，y和z坐标，.<为了构造蛋白质协方差矩阵，我们使用Cα原子轨迹。事实上，已经表明，Cα原子包含了合理描述蛋白质的所有信息，议案如果本征向量按照本征值递减的顺序排列，第一个描述的是最大尺度的相关运动，而最后一个则对应于小振幅的振动。通过将来自MD轨迹的所有帧投影到特征向量上，可以生成新的轨迹，该轨迹在目视检查时揭示相关模式，例如Cytc蛋白的一部分倾向于与另一部分协同作用的模式[29]。3. 结果和讨论这项研究的动机是基于我们最近发表关于Cytc的文章 [28]。研究了Cytc在低温和高温下的构象动力学 结果表明，Cyt c中在凋亡功能中特别重要的特定区域可以在不久的将来帮助建模诱变研究。因此，在这篇文章中，我们选择了Y67F和K72W的Cyt c突变体，这被证明在调节细胞死亡程序中起重要作用。我们有G. Muneeswaran等人信息学在医学解锁11（2018）5153由于文献中没有马心Cytc的晶体结构，因此通过计算产生了由于马细胞色素c的行为非常像它的人类对应物[36]，因此我们选择了马细胞色素c进行研究。我们的MD结果，如RMSD和Rg-蛋白的平均值是很好的协议与以前报道的MD研究Raja Singh等。[26]. 我们在下面的章节中通过计算不同的值及其在过氧化物酶活性中的意义来定量地讨论Cytc的3.1. 均方根偏差（RMSD）和回转半径（Rg）计算模拟过程中的RMSD和Rg蛋白，以说明突变后蛋白质的结构变化，它们被广泛用作平衡标准[46]。骨架和C α原子相对于三个体系的起始结构的RMSD随时间的变化曲线如图所示。图1a和b中示出了Rg蛋白作为时间的函数的曲线图。1杯相对于WT和Y67F突变体，K72W突变的Cytc的Rg蛋白谱表现出较小的波动，表明K72W突变的Cytc排列成更紧凑的构象。RMSD曲线中的平台证实，在MD模拟期间，所有三个系统都在8000-10000 ps内达到平衡 MD分析表明，与WT和K72W突变体相比，Y67F突变导致结构和动力学行为的显著变化。WT、Y67F和K72W计算的时间平均结构特性列于表1中。这三种不同蛋白质的RMSD的比较提供了关于轨迹中的结构差异的信息对于Y67F突变的Cytc，骨架和Cα RMSD都表现出更高的与WT相比，最高可达8000 ps，但在此之后，RMSD的波动几乎均匀的轨迹与WT相似，并且已经发现在模拟窗口的其余部分中保持恒定两种RMSD的最高波动是由于重要Ω环和氢键网络的破坏，表明过氧化物酶活性增加[26 然而，对于K72W突变的Cyt c，当与WT相比时，骨架和CαRMSD均表现出几乎相似的波动。WT的骨架和C α原子的RMSD平均值分别为0.1282和0.1332 nm，而Y67F和K72W突变的Cyt c的RMSD平均值分别为0.1527和0.1584 nm、&0.1444和0.1506 nm。对于WT Cyt c，计算的Rg蛋白值在1.2684至1.3169 nm之间变化，对于Y67 F突变的Cyt c，为1.2601和1.3228 nm，对于K72 W突变的Cyt c，为1.2579-1.3067nm。根据该模拟计算的WT Cyt c的Rg-蛋白平均值为1.2912 nm，与实验值（1.26 nm）[47]和计算值[26]相当一致，表明所进行模拟的可靠性。类似地，还计算了Y67F和K72W突变的Cyt c的平均值，发现它们分别为1.2861和1.2800 nm，说明蛋白质的稳定性随着结果而增加表1计算WT、Y67F和K72W Cyt c的时间平均结构特性。标准偏差值在括号中给出。性能WT细胞色素cY67F细胞色素cK72W细胞色素c主干RMSD（nm）0.1282（0.02）0.1527（0.02）0.1444（0.02）Cα RMSD（nm）0.1332（0.02）0.1584（0.02）0.1506（0.02）Rg蛋白（nm）1.2912（0.06）1.2861（0.08）1.2800（0.06）Rg-骨架（nm）1.2493（0.07）1.2464（0.08）1.2348（0.06）SASA总蛋白（nm2）66.98（1.37）66.11（1.49）65.31（1.32）Fig. 1. 结构性质随时间的演变a）骨架RMSD b）C α RMSD和c）Rg-蛋白：红色- WT、蓝色-Y67 F和绿色-K72 W Cyt c。(For有关本图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版。）G. Muneeswaran等人信息学在医学解锁11（2018）5154的突变。 从图中可以看出。 1c在8000-14000ns的模拟时间内，Y67 F突变体的构象略低于WT，导致更紧凑的构象。 但对于K72W突变的Cyt c，Rg蛋白在整个模拟期间的波动明显低于WT，导致更紧凑的构象。3.2. 均方根波动（RMSF）每种氨基酸获得的RMSF见图2。 2，这表明WT和突变的Cyt c的动力学性质的主要变化。平均RMSF值的差异表明WT、Y67F和K72W突变的Cytc的核心动力学不同.WT、Y67F和K72W突变的Cytc的RMSF平均值分别为0.1251、0.1199和0.1216 nm。野生型Cyt c中有两个氨基酸片段比两个突变体表现出更大的酶切稳定性，对应的残基片段为35-39和80-83。此外，在Y67 F突变的Cytc中，相对于WT和K72 W突变的Cyt c，氨基酸区域75C. 对于K72 W突变的Cytc，有两个环区（残基20发现的最高的可折叠性是由于属于氨基酸区域20-30（环1）、35-45（环2）和75-88（环3）的残基的环中出现的此外，残基Tyr67被认为是在Cytc的电子转移功能的中心重要性。该氨基酸残基控制重做X电位并调节Cytc中邻近多肽链段（残基65至72）的动态可复性[48]。在Y67F突变的Cyt c中，在整个模拟窗口期间，与WT相比，上述氨基酸区段显示出更大的波动，表明区段中的强烈变形或紊乱。 所观察到的较大波动可能导致影响其重做X电位，从而诱导突变蛋白的过氧化物酶活性。相反，对于K72 W突变体，含有残基65-72的区段表现出比WT更少的波动，解释了突变蛋白的刚性。这些结果揭示了Y67F和K72W突变的Cytc的构象和动力学稳定性可能与细胞凋亡活性有关。3.3. 溶剂可及表面积（SASA）WT、Y67F和K72W的SASA在图中给出。 3. 这三种蛋白质在模拟期间显示出SASA的时间依赖性增加和减少。WT、Y67F和K72W突变的Cyt c的平均SASA值分别为66.98、66.11和65.31 nm 2。 Y67F突变体的SASA表现出与WT相似的行为，直到8000 ps，随后观察到SASA的轻微降低。 与模拟的初始阶段相比，SASA略有下降，这可能是由于血红素构象周围重要的蛋白质内氢键网络的破坏。但是对于K72W突变的Cytc，没有证据表明已发现K72W Cytc的Phe82和Heme105与Tyr67降低。同样，在Y67FCyt c中，Phe82和Heme105之间的平均距离增加，但观察到该值略有下降图2. C α原子的RMSF作为氨基酸的函数：红色- WT、蓝色-Y67 F和绿色-K72 WCyt c。（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版本。图3. 溶剂可及表面积随时间的时间演变：红色- WT，蓝色-Y67 F和绿色-K72 WCyt c 's. （有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版本。表2活动场地环境的距离变化标准偏差值在括号中给出。的SASA值的实质性变化的个别残基比较到WT，这意味着蛋白质内氢键网络周围残基间距离变化WT Cytc（nm）Y67F细胞色素c（nm）K72W细胞色素c（nm）血红素以类似于WT的方式被高度保存Res67和Cys141.14051.1935（0.06）1.1539（0.04）3.4. 活性位点距离变化Res67和Cys17（0.03）1.32771.4079（0.05）1.3192（0.04）（0.03）Zheng et al.[48]血红素活性构象周围的关键电子转移残基之间的最佳距离对于电子的有效流动是重要的因此，分析了WT和突变Cyt c的关键电子转移残基之间的距离变化，并在表2中列出。此外，一些计算的关键电子转移残基之间的距离显示在图。 4 a-e）。 在WT Cyt c中，血红素基团与Cys14和Cys17共价连接，血红素铁的轴向配体为His18和Met80。由表2可知，在Y67F Cytc，残基Cys 14、Cys 17、Phe 82和Heme105与Tyr 67之间的平均Cys17和血红素0.6694（0.02）His 18和血红素0.5116（0.01）Res67和血红素0.7259（0.03）蛋氨酸80和血红素0.4143（0.01）Res82和血红素0.8433（0.010.6729（0.02）0.6651（0.02）0.5014（0.01）0.5118（0.01）0.8116（0.04）0.7073（0.03）0.3881（0.03）0.4162（0.01）0.8833（0.09）0.8215（0.04）Res67和Res820.93210.8072（0.07）0.9613（0.05）（0.07）Met80和Res820.5544（0.1）0.6523（0.1）0.6047（0.04）G. Muneeswaran等人信息学在医学解锁11（2018）5155图第四章 关键残基之间的距离a）Met 80-Phe 82，b）Phe 82-Heme 105，c）Trp 59-Tyr 74，d）Tyr 67-Heme 105，e）Tyr 67-Met 80：红色-WT，蓝色-Y67 F，绿色-K72 W。（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版本表3全Cytc的Tr 59（A）和Tyr-74（B）中两对残基之间的平均距离表示为X，残基Tyr-67（C）和Met-80（D）表示为Y。表4氢键残基之间的距离变化分析细胞色素c距离A-B（nm）距离C-D（nm）相关系数不酪氨酸/苯丙氨酸67-天冬氨酸521.00291.07570.9624重量0.8602（0.07）0.6584（0.03）0.1117酪氨酸/苯丙氨酸67-苏氨酸780.91271.00720.8218Y67F0.8798（0.06）0.7147（0.05）0.1422酪氨酸/苯丙氨酸67-蛋氨酸800.65840.71470.6357K72W0.8657（0.06）0.6357（0.04）0.2024氢键键之间的距离WT细胞色素cY67F细胞色素cK72W细胞色素c残基（nm）（nm）（nm）G. Muneeswaran等人信息学在医学解锁11（2018）5156对于K72W Cytc相对于WT。当上述关键部分之间的平均距离增加时，活性位点构象打开，这有助于小分子如过氧化氢酶和其他过氧化物进入血红素中心，从而增强蛋白质的过氧化氢酶活性[48]。这些观察结果（表1和图4）表明，根据实验报告[ 49 ]，Y67 F突变蛋白在整个模拟窗口期间发生了显著的结构变化，导致开放的活性构象，过氧化物酶活性，而在K72 W突变体中观察到关键电子转移残基之间的距离略有增加，这表明突变蛋白的结构完整性和血红素活性构象相对于WTCytc得到了很好的保持，因此该突变蛋白能够与WT进行呼吸链电子转移，这也与实验报告[17]一致此外，Y67F Cytc中His 18-Hem 105和Met 80-Hem 105的平均距离比WT减少，而在K72 W Cytc中， His 18-Hem 105和Met 80-Hem 105的距离几乎与WT Cytc相似，这表明在所有Cytc中血红素铁的轴向配体此外，Takano et al.[49]这是一个很好的例子。来自线粒体Cytc还原酶的电子传递到氧化形式的Cytc（Fe3+）的途径与来自还原形式的Cytc（Fe2+）的电子传递到CytC氧化酶的途径不同X射线测定表明，Tyr 74和Trp 59在WT Cytc中平行放置，类似地，Tyr 67和Heme105也平行放置在铁细胞色素c中，电子首先是转移至Tyr 74，随后转移至Trp59。此外，从Tyr67到血红素的第二次电子转移被发现可能通过Met 80的硫来恢复电子中性。在第一次电子转移过程中，发现由于Cytc中的电子转移而发生的构象变化使芳香环Trp 59和Tyr 67平行排列，这可能有利于电子从富电子Trp 59转移到缺电子Tyr67。因此，比较这两对残基AB和CD（A（Trp59）B（Tyr74）、C（Tyr67）和D（Met80））之间的距离和可能的方向，其包含对电子转移过程重要的残基，使得能够鉴定这两对是否可以相关。因此，在每1ps时间间隔测量AB和CD之间的距离，以检查它们之间的距离是否相关，并在表3中列出。残余物A和B之间的距离表示为“X”，并且残余物C和D之间的距离表示为“Y”。所有构象的X和Y的平均值及其相关系数列于表3中，这确实说明WT Cyt c和K72 W突变Cyt c的这对残基之间的计算距离几乎相似，说明K72 W突变体可以胜任WT蛋白的电子载体，但在Y67FCytc中发现差异（Tyr 67-Met 80）显著增加，表明这些因素可能被考虑在内，以解释这些突变体的电子转移和凋亡活性。3.5. 氢键网络在Cytc中，Tyr67与轴向配体Met80和保守氨基酸残基（Asn52和Thr78）形成氢键网络除轴向配体Met 80外，Tyr 67还通过氢键与两个Ω环（残基40-57和71-85）连接，并显示与Tyr 67相关的氢键网络参与构象转换，因此蛋白质 考虑到这一点，计算了这些残基之间的距离，结果见表4和图4。 5 a-b。对于WT、Y67 F和K72 W突变的Cytc，Tyr 67/Phe 67和Met 80之间的距离分别为0.6584、0.7147和0.6357 nm图5. H键合残基a）Tyr 67-Asn 52和b）Tyr 67-Thr 78之间的距离：红色- WT，蓝色-Y67 F，绿色-K72 W。(For有关本图例中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版此外，WT、Y67F和K72W的Tyr 67/Phe 67-Asn 52之间观察到的距离分别为1.0082、1.0757和0.9623 nm，WT、Y67F和K72W的Tyr 67/Phe 67-Thr 78之间的距离分别为0.9126、1.0071和0.8217 nm。 这些结果明显表明Y67F突变的Cytc中上述三个氢键全部丢失。这种丢失可能通过破坏Met80、Asn 52和Thr 78的取向以及开放的活性构象而使活性血红素构象不稳定，这有助于血红素催化位点接近小分子，如H2O2诱导过氧化物酶活性，从而启动细胞死亡程序。但是，与WT相比，K72W突变的Cytc中上述三个氢键均显著增强，从而表明其血红素催化活性增加，并与WT作为抗氧化剂的能力一致。此外，我们还在我们的模拟中分析了WT、Y67F和K72W突变的Cyt c的平均结构，并显示在图1中。第六章 这些结构的比较清楚地表明，Y67F突变的Cyt c的血红素活性位点经历了最大的结构波动，表明蛋白质的这一部分经历了严重的变形。3.6. 二级结构分析蛋白质的二级结构是局部多肽骨架结构，用Ramachandran图表示[50]。WT、Y67 F和K72 W突变的Cytc的Ram- achandran图显示于图10中。G. Muneeswaran等人信息学在医学解锁11（2018）5157图第七章从该图中可以明显看出，在WT和K72W突变的Cytc中，保守残基Met80、Thr78和Asn52在最有利的区域内，残基Tyr67在WT中在较不利的区域内，而在K72W中是最有利的区域 而Y67F中Asn52和Thr78位于最有利区域，Phe67和Met80位于较不利区域。 这些结果可能说明残基67的突变通过改变65-72环及其围绕血红素环的氢键网络来增加过氧化物酶活性。 Y67F突变的Cyt c表现出更多的结构变化，这些结构变化可能极大地影响Cyt c动力学，并与蛋白质的过氧化物酶活性有关。3.7. 基本动力学基本动力学（ED）是一种技术，允许识别蛋白质的相关运动，这些运动是MD模拟生成的轨迹期间最基本的活动。 对WT、Y67F和K72W突变的Cyt c的20 ns MD轨迹进行基本动力学分析。诱导全局结构变化的运动（称为协同运动，占蛋白质整体运动的约10%）在分析时提供了关于蛋白质功能中构象变化的定量描述[ 1 ]，并且可以通过ED分析获得的特征值和特征向量进行检查。对图8的检查表明，WT中第一特征向量指数的特征值为0. 2025nm2，而对于Y67 F和K72 W突变的Cytc，发现它们分别为0. 1491和0.1949 nm2WT、Y67F和K72W的第二特征向量指数的本征值分别为0.0959、0.1251和0.1159nm2这些值表明，对于第一特征向量，与WT和K72W相比，Y67F突变体经历较小的运动，并且对于第二特征向量，Y67F突变体相对于WT和K72W突变体经历较大的运动。然而，在其余的特征向量中，我们发现这三种蛋白质几乎有相似的行为，这表明协调运动主要发生在基本子空间中的很少几个方向上这些结果表明，WT，Y67F和K72W的整体运动主要涉及前两个特征向量。涉及omega环的主要集体波动模式主要发生在Y67F突变的Cyt c的前两个特征向量中。然而，Y67F突变体的协同运动幅度相对于其他两个蛋白质降低。图在图9中，显示了WT和突变Cyt c沿前四个特征向量的C α位移，这表明WT和突变Cyt c识别的基本运动是不同的。野生型Cyt c有两个氨基酸残基片段具有比两个突变体更大的酶切稳定性，其残基片段为35-39和80-83。此外，在Y67 F突变体中，氨基酸区域75-80相对于WT和K72W突变体显示出更大的不稳定性。对于K72W突变体，与WT和Y67F突变体相比，有两个环区域显示出更大的可折叠性。这两个区域包含残基20-30和40-45。由于在属于20-30（环1）、35-45（环2）和75-88（环3）的残基的Ω环中出现的变形，已经发现最高的可伸缩性。这些数据表明，在突变的Cytc 's中，协同运动显著减少，与本RMSF分析一致4. 结论在这项研究中，我们提出了从原子分子动力学模拟WT细胞色素c及其突变形式（Y67F和K72W）在水溶液中获得的结果将两个突变体的结构和动力学计算结果与WT进行了比较，目的是了解可能改变结构的微观性质的变化。图6. WT和突变的Cytc在20 ns模拟后的平均3D结构。(A)野生型Cytc，（B）Y67 F突变体，和（C）K72 W突变体。G. Muneeswaran等人信息学在医学解锁11（2018）5158图7. 从WT、Y67F和K72W的MD结果获得的Ramachandran图。过氧化物酶活性。 在Y67F突变后，几种结构特征，即，Ω环（残基65- 72和75-88）中的大波动，随后是重要的蛋白内氢键的减弱，血红素活性位点处的关键电子转移残基之间的距离增加以及残基Tyr67、Asn52和Thr78的精确位置和取向的破坏，导致突变蛋白的结构、构象的显著变化和过氧化物酶活性的增加。 与Y67 F相反，上述结构特征在K72 W中得到加强，并导致电子转移活性的小幅增加，推测导致过氧化物酶活性差，与Y67F一致。与现有的实验报告。这个可怜的过氧化物酶图8. 对应于前十种运动模式的特征向量指数的特征值图;红色- WT，蓝色-Y67 F和绿色-K72 W Cyt c。(For有关本图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版。）K72W突变体的行为应归因于凋亡前活性的丧失。此外，我们基于基本动力学（ED）的研究结果表明，WT、Y67F和K72W突变的Cyt c的整体运动主要由前两个特征向量参与，但Y67F突变体的协同运动幅度相对于其他两种蛋白质有所降低此外，本研究证明了血红素活性位点的开放构象，特别是在Y67F突变体中，从而提供了原子水平上的理解突变诱导的构象变化的分子机制，这可能与早期细胞凋亡中的过氧化物酶活性有关。G. Muneeswaran等人信息学在医学解锁11（2018）5159图第九章 作为C α原子的函数的本征向量的每个原子的RMSF;红色-WT，蓝色-Y67 F和绿色-K72 W Cyt c 's。（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版本确认这 项 工 作 得 到 了 印 度 新 德 里 大 学 教 育 资 助 委 员 会 的 支 持（ F/2005/10 ） 。 39-690/2010 （ SR ） ） 和 印 度 泰 米 尔 纳 德 邦Virudhunagar的Virudhunagar SenthiakaraNadar学院（自治）附录A. 补充数据与本文相关的补充数据可以在https：//doi找到。org/10.1016/j.imu.2018.04.003。引用[1] 作者声明：KARPLUS M.表皮生长因子受体激酶结构域构象转变途径的多分子动力学模拟和贝叶斯聚类。 J Phys Chem B 2012;116：8584- 603.[2] 放大图片创作者：Lee TV，Bergmann A.果蝇细胞程序性死亡的遗传控制。CellDev Biol2005;16：225- 35.[3] 蒋X，王X.细胞色素c介导的细胞凋亡。Annu Rev Biochem 2004;73：87- 106.[4] D. 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