多能干细胞的大规模生产方法与挑战

××××工程7（2021）144研究组织工程人诱导多能干细胞堀口一喜、木野冈正大坂大学研究生院工学研究科生物技术系，大坂565-0871，日本阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2019年2020年5月10日修订2020年6月30日接受2021年1月14日在线提供保留字：诱导多能干细胞细胞生产扩增灌装冷冻A B S T R A C T诱导性多能干细胞（iPSC）被认为是理想的和有前途的细胞来源，用于各种应用，如再生医学和药物筛选。然而，用于稳定供应所需数量的iPSC的有效大规模生产系统尚未开发。本文介绍了目前可用于稳定iPSC生产的各种方法我们首先讨论iPSC培养过程中需要控制的限制因素，如营养供应、废物清除和氧气可用性。然后，我们介绍了最近的调查iPSC培养系统的基础上粘附，悬浮液和支架。我们还讨论了培养工艺之后的下游工艺，例如灌装和冷冻工艺，由于在冷冻保存培养基中悬浮期间细胞活力降低，这些工艺限制了生产规模。最后，我们总结了稳定大规模生产iPSCs的可能性，并强调了仍需克服的限制。我们认为，多学科的调查是必不可少的，以了解影响细胞生长和质量的不同因素，以获得最佳和稳定的iPSC大规模生产系统。©2021 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍自2006年关于其产生的最初报告以来[1，2]，诱导多能干细胞（iPSC）已被研究为再生医学[3由于其广泛的增殖和分化能力，它们充当体内各种细胞类型的可再生来源，这与胚胎干细胞（ESC）的增殖和分化能力相似。此外，由于它们是在没有胚胎牺牲的情况下获得的，因此它们的产生没有伦理问题，并且它们的自体移植不会引起免疫相关并发症。有了这些高期望，iPSC研究在其发明后的十年中迅速发展。然而，临床或工业相关的iPSC应用需要相当数量的细胞，并且用于稳定大规模生产的方法处于开发阶段。例如，胰岛移植需要每个患者至少6 × 108个b细胞，并且它们的产生需要大约0.6m2的培养表面[9]，这等于80个75 cm2大小的烧瓶。在极端情况下，制备30%的肝组织需要*通讯作者。电子邮件地址：horiguchi@bio.eng.osaka-u.ac.jp（I. Horiguchi）。6每个患者10个肝细胞;这些可以从60m2的培养区域获得，其等于8000个这样的培养皿。此外，考虑到分化过程，需要两倍以上的细胞数量。根据对电池治疗成本估算的研究，假设批量规模约每批1 1010这些要求不能通过实验室遵循的涉及手动操作的常规粘附培养来满足。因此，有必要开发稳定的iPSC制造工艺。已经开发了各种培养系统以产生大量细胞。传统上，基于细胞的大规模生产系统被开发用于细胞衍生产品，如染料、疫苗和抗体[13]。不同的方法对于细胞治疗应用是必不可少的，因为细胞本身就是产品。虽然iPSC是锚定依赖性细胞，但它们也可以通过聚集体形成在悬浮液中培养因此，可以使用两种不同的培养系统培养iPSC：基于粘附的培养系统和基于悬浮的培养系统。此外，正在开发基于支架的方法以控制干细胞生态位并稳定iPSC质量。在大规模生产期间，用于细胞填充和冷冻的下游过程对于开发稳定https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.01.0012095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可从ScienceDirect获取目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engI. Horiguchi和M. 木野冈工程7（2021）144145iPSC生产系统。由于细胞质量在生产过程中随时间变化，因此立即灌装和冷冻对于稳定生产至关重要。用于细胞治疗的高通量填充和冷冻系统仍在开发中;因此，缺乏合适的下游工艺目前限制了批量规模。尽管下游工艺没有像上游工艺如扩增那样广泛报道，但现在人们认识到下游工艺作为扩大细胞生产的限制因素的重要性。 在这篇综述中，我们总结了稳定的iPSC大规模生产系统的上游和下游工艺方面的研究和发展。首先，我们讨论了iPSC培养中的一般限制因素，如营养供应，废物清除和生长因子的存在。关于上游过程，我们介绍了基于粘附培养、悬浮培养和支架培养的培养系统的特点和发展。然后，我们讨论了下游工艺作为扩大规模的限制因素。最后，我们总结了iPSC稳定生产的最新进展，并强调了稳定生产系统的发展所涉及的问题，新的工业应用，如再生医学。2. iPSC培养2.1. 养分供应和废物清除由于iPSC主要依赖糖酵解来满足其能量需求[14一些研究已经报道，在培养基中维持高葡萄糖浓度增强了iPSC中的增殖和多能性标志物的表达[18，19]。这些积极影响的机制尚不清楚;然而，一些报告指出葡萄糖诱导的高渗性起重要作用[19，20]。此外，一些报告提到谷氨酰胺氧化对于人PSC的存活也是必不可少的[21]。谷氨酰胺代谢不仅有助于核苷酸和谷胱甘肽的合成，而且还有助于通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP）在葡萄糖消耗期间，谷氨酰胺氧化被激活以用于三羧酸（TCA）循环以产生ATP。基于这些研究，iPSC生产需要葡萄糖和谷氨酰胺控制，两者的稳定供应对于稳定生产很重要（图1[21]）。在培养过程中，大量的乳酸作为糖酵解的废物被分泌乳酸盐降低了培养基的pH值，由此产生的低pH值导致iPSC死亡。此外，以前的研究表明，乳酸盐会降低生长速率，即使在pH控制条件下也是如此[18]。这些报告表明，及时的葡萄糖供应和乳酸盐去除对于成功的iPSC培养是必不可少的先前的研究还表明，连续喂养改善了iPSC的生长和多能性[22，23]。特别是，使用透析系统来有效和连续地运输营养物和废物是一种成功的技术，用于在营养物和废物浓度方面保持优选的培养条件[23]。然而，这种系统需要额外的设备，因此需要更多的空间和复杂的操作。因此，在细胞培养期间评估和满足此类系统的要求是必要的。2.2. 供氧氧气对细胞培养至关重要，尤其是大规模和高密度培养。关于二维文化的图1.一、人多能干细胞（hPSC）在（a）葡萄糖存在和（b）葡萄糖耗尽条件下葡萄糖和谷氨酰胺代谢的示意图ACO 2：乌头酸酶2; IDH 2/3：异柠檬酸脱氢酶2/3; aKG：α-酮戊二酸; G6 P：葡萄糖-6-磷酸; 3 PG：3-磷酸甘油醛; ACLY：ATP柠檬酸裂解酶. 经Elsevier Inc.许可，转载自参考文献[21]，© 2016.I. Horiguchi和M. 木野冈工程7（2021）144146·指出在透氧膜上培养导致多层组织的形成和改善的细胞功能[24然而，在三维培养中，组织厚度受到氧扩散的限制，因为内部细胞有时会因缺氧而坏死[27]。如第2.1节所述，iPSC通过糖酵解产生所需的能量，而糖酵解不需要氧气。因此，低氧浓度（10%）对于iPSC的维持是优选的，并且已经报道了防止iPSC分化[28，29]。然而，氧消耗（1%）延迟增殖[29]。因此，将氧浓度维持在3%-10%对于有效生产具有稳定质量和稳定数量的iPSC是至关重要的。尽管在大多数实际iPSC培养物中氧气是从培养基的顶面供应的，但一些研究已经利用通过透气膜（例如封闭系统）的补充氧气[30，31]。喷射也是供应氧气的有效方法;然而，在iPSC培养的情况下，目前很少使用鼓泡，因为气泡引起的培养基流动影响iPSC活力。2.3. 其他补充剂添加补充物如生长因子在控制细胞命运如生长、维持和分化方面是重要的，这适用于iPSC培养。Rho依赖性蛋白激酶（ROCK）抑制剂如Y-27632和thiazovivin在人iPSC的产生中具有重要作用。在过去，如果将人iPSC解离成单细胞，则人iPSC无法存活;因此，在传代人iPSC时，应将细胞作为小团块收获。人类iPSC的传代非常困难，需要专业知识。先前的研究表明，解离的单个人iPSC的死亡是由ROCK依赖性细胞凋亡引起的[32]。最近，ROCK抑制剂的添加显示出显著提高传代后的细胞存活率，并简化了传代过程。ROCK诱导剂对iPSC具有除提高传代后存活率之外的其他作用。先前的报告提到ROCK抑制剂对人iPSC培养物的以下附加作用：提高冷冻保存的效率、支持未分化生长和增强分化[33]。因此，ROCK抑制剂可用于稳定生产人iPSC的各种情况。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对于人iPSC的多能性和自我更新至关重要[34-36]，因此通常将其添加到iPSC培养基中。然而，bFGF缺乏热稳定性需要频繁更换培养基，这增加了大规模生产的成本[37]。然而，已经提出了几种方法，例如bFGF的持续释放和bFGF热稳定性的改善[37-转化生长因子-b（TGF-b）超家族蛋白，如TGF-b蛋白、激活素、结节蛋白和骨形态发生蛋白（BMP），在维持iPSC的多能性中也具有重要作用.已显示TGF-β1有助于维持人iPSC的多能性[40，41]。Nodal和激活素A激活相同的受体和信号传导以抑制人iPSC分化并维持多能性。然而，高浓度（约100 ng mL-1）的激活素A也促进人iPSC分化成中内胚层细胞[41，42]。因此，激活素A浓度应维持在50 ng·mL-1以下，以维持人iPSCs的多能性。属于TGF-β超家族的BMP 4诱导人iPSC的分化，即使BMP 4维持小鼠iPSC的多能性[43，44]。BMP 4可以从细胞中分泌并在血清替代物中检测到-基于培养基。拮抗剂noggin与bFGF协同作用以抑制BMP 4的分化诱导并维持多能性[35]。最后，研究人员报告了各种因素，包括培养基、底物和解离方法[45]，不仅在单次传代培养中影响细胞特性，而且在多次传代培养中也影响细胞特性[46]。正如第5所提到的，这些质量波动妨碍了稳定生产，仍然是有待解决的问题。3. 膨胀过程目前开发的iPSC大规模生产系统基于两种主要类型的培养系统之一：基于粘附的培养系统和基于悬浮的培养系统。一个例外是基于支架的培养系统，其涉及基于粘附的培养系统和基于悬浮液的培养系统。3.1. 贴壁培养系统基于粘附的培养是用于在实验室中培养哺乳动物细胞的常规方法在传统的基于粘附的培养中，将细胞接种到含有饲养细胞如小鼠胚胎成纤维细胞的基底最近，已经开发了用于无饲养层iPSC培养的各种细胞外基质（ECM）涂层ECM应含有Arg-Gly-Asp（RGD）基序，例如基质胶、层粘连蛋白或玻连蛋白中的基序最初，使用动物来源的ECM如基质胶;然而，为了确保生物安全性，最近已经开发了包含ECM分子片段如层粘连蛋白-511片段[48，49]和卵连蛋白片段[50]的无动物ECM对于通过基于粘附的培养的大量生产，需要大的培养表面因此，使用增加容器中培养表面的方法，例如堆叠板，是提高生产率的重要方法[51，52]。然而，很难处理具有大培养表面的容器，因此当不能使用微载体时，它们被认为是第二选择。自动化培养操作是提高生产率和确保稳定质量的另一种方法[53世界各地的许多公司已经开发了机械化培养系统，其包含用于进料培养基和去除废培养基的导管这种机械化系统的主要优点是稳定的操作和并行生产的可能性。事实上，已经报道了通过灵活的培养平台进行平行操作的可能性[58]。然而，尽管硬件开发取得了进展，但用于优化操作和监测细胞质量的软件应用细胞培养操作复杂且随细胞类型而变化;因此，了解操作对细胞培养结果的影响并优化培养操作以确保粘附培养中的稳定生产非常重要。基于粘附的培养的一个优点是易于观察细胞形态。在iPSC培养的情况下，包括维持和分化，基于形态学的细胞状态的日常测定对于质量控制是重要的因此，监测iPSC集落的形态是在大规模生产期间检查其质量和稳定性的有效方法这些形态学测定是由有经验的专家进行的.此外，这些专家的技能和知识，I. Horiguchi和M. 木野冈工程7（2021）144147形态确定取决于操作者的经验，以及很难培训其他人员达到类似的专门知识水平。目前，正在开发用于评估iPSC质量的基于图像的分析[59 -61]。最近，深度学习研究已应用于基于粘附培养中iPSC产品的基于图像的质量控制[62，63]。这些方法试图在不使用常规生物质量检查如免疫染色的情况下评估iPSC和iPSC衍生细胞的质量，常规生物质量检查如免疫染色需要技能并且由于试剂如抗体的波动质量而不稳定。虽然建立一个可靠的工具需要成千上万的教学图像，但这些技术应该是监控iPSC生产质量和稳定性的强大工具。总之，基于粘附的培养是常规的细胞培养方法，并且可以利用来自实验室实验的知识和经验来确保最佳生产。虽然这种培养系统的可扩展性有限，但使用机械化生产系统的平行生产可以克服这一障碍。为了通过自动化系统实现稳定的大规模生产，有必要研究每个操作（包括运输、移液、离心和接种）对细胞为了理解这种操作的效果，对机械力到机械力的机械转导的生物学研究[64，65]可能是有帮助的。此外，在设计自动化培养操作时，从化学工程的角度研究从操作中提取影响细胞质量的关键参数是重要的。3.2. 悬浮培养体系基于悬浮液的培养物已被开发为细菌[66]、植物[67]和动物细胞的可扩展培养系统，并用于获得各种生物产品，如发酵食品、药物和细胞本身。与基于粘附的培养物不同，基于悬浮液的培养物不需要粘附表面，从而能够使用更简单且易于扩展的容器。几项研究报道了使用基于悬浮液的培养物进行iPSC和ESC扩增[66由于iPSC需要附着，它们在基于悬浮液的培养物中形成聚集体。然而，由于各种因素，包括营养物质和氧气向聚集体中的有限转移[27，75]和ECM积累，聚集体形成存在大小限制先前的研究表明，一些细胞系形成具有壳状结构的ECM，其包装细胞并阻止细胞生长[76，77]。还报道了ECM的缺乏导致细胞死亡和不稳定的聚集体生长[78]。因此，在设计基于悬浮液的培养系统之前，应考虑iPSC系的特性。由于这些限制，在基于iPSC悬浮液的培养期间聚集控制是重要的。特别是，在早期阶段形成较少的聚集体导致较低的生长[76]。因此，理想的情况将包括产生许多大小受控的聚集体，其中已经提出了一些策略来控制在基于悬浮液的培养的早期阶段的聚集。一种流行的策略是使用微孔来制备均匀的聚集体[79]。其他可能的建议包括修改培养基[80]或培养容器[31]以限制细胞聚集。此外，据报道，通过在培养后期添加降解细胞-细胞接触的分子将大聚集体破碎成较小的聚集体由于iPSC不需要高氧气供应，因此用于iPSC扩增的生物反应器不需要强烈搅拌，这与用于微生物的常规生物反应器不同。然而，这并不意味着，用于iPSC的生物反应器不需要任何搅拌。如上所述，iPSC在基于悬浮液的培养物中形成聚集体，其可以容易地沉积并积聚在生物反应器的底部;因此，需要搅拌以防止这些问题。另一方面，在基于悬浮液的培养过程中，细胞暴露于由于搅拌而导致的培养基流动所产生的剪切应力该剪切应力影响iPSC活力[71]和分化[88]。因此，防止沉淀同时足够温和以避免引起细胞损伤的最佳搅拌水平对于生物反应器中成功的基于悬浮液的培养是重要的。当设计用于iPSC悬浮培养的生物反应器时，需要估计细胞所经历的剪切应力由于很难直接测量细胞上的剪切应力，因此建议使用计算流体动力学来估计剪切应力[89这些基于计算科学的方法有助于理解剪切应力对iPSC的影响，并有助于开发用于iPSC悬浮培养的最佳生物反应器。已经开发了各种生物反应器用于iPSC悬浮培养。用于iPSC的最流行的基于悬浮液的培养系统是转瓶系统，其已被广泛研究[68，70，71，73，74]。在常规的转瓶系统中，通过叶轮操作搅拌以实现高水平的氧转移;因此，搅拌速率高（即，大约大于100转/分钟（rpm））[66]。相比之下，当培养iPSC（即，保持在大约低于60rpm），以保持细胞以最小的剪切力漂浮，因为iPSC不需要高水平的氧转移。在转瓶中，直接搅拌培养基，使其充分混合。然而，来自叶轮的剪切力导致细胞损伤。一个研究小组研究了振荡培养系统[31，72，83]。在振荡培养中，通过振荡容器间接搅拌培养基。由于没有叶轮，细胞上的剪切应力在振荡系统中比在转瓶中低此外，可以简化用于振荡系统的培养容器，使得可以按比例放大用于大规模生产，并且容易地创建封闭系统以保持无菌条件。在振荡培养中，iPSC聚集体由于弱搅拌而倾向于沉积到容器的底部;因此，需要进一步的设计来防止这种沉积。作为类似于摇动容器的系统，贴壁容器可以实现微重力培养[84]。先前的研究已经证明，由血管壁产生的微重力增强了活力、增殖和分化效率[85，86]。作为微重力培养系统的极端情况，开发了一种双向旋转容器系统，实现了伪零重力[87]。如上所述，存在各种类型的生物反应器，并且根据目的进行选择是重要的（即，扩张或分化）和文化的规模。3.3. 支架式培养系统第三种可能的培养系统涉及在支架上培养，例如微载体和微胶囊。微载体提供比常规的基于粘附的培养物提供的粘附表面更大的粘附表面，并且广泛用于粘附依赖性细胞如间充质干细胞的大量生产。由于iPSC也是粘附依赖性的，已经报道了使用基于微载体的培养系统来大量生产和分化iPSC[88，92一般而言，与基于静态粘附的培养物中的细胞不同，微载体上的细胞悬浮在搅拌容器中并暴露于剪切应力，这会影响细胞活力和分化（第3.2节）。此外，当在扩增后收获细胞时，I. Horiguchi和M. 木野冈工程7（2021）144148需要从细胞悬浮液中分离微载体。这个过程可能限制了文化的规模微载体的选择对于在微载体上成功培养iPSC是重要根据先前的研究，尺寸、涂层和表面电荷是iPSC扩增需要考虑的重要性质[92]。根据参考文献[92]，使用小微载体（小于100μ m）导致低细胞产率。此外，iPSC几乎不附着或生长在带负电荷表面的微载体涂覆ECM改善微载体上的细胞生长。在参考文献[92]中，发现基质胶和层粘连蛋白涂层可有效改善细胞生长。为了解决与微载体分离的问题，最近开发了可通过酶处理溶解的新型微载体[94]。通过在膨胀后消化微载体，可以跳过分离过程。微囊化，另一种基于支架的方法iPSC的培养能够保护细胞免受剪切应力、聚集控制以及通过生物打印制备优选结构[95]。一些报告表明，包封可以防止分化并保持iPSC的多能性[96，97]。此外，微胶囊可以被修饰以控制干细胞生态位[98]。尽管这些优势表明了稳定大规模生产iPSC的可能性，但培养后从胶囊中收集iPSC是应用此类基于支架的生产过程的障碍。最近研究了各种包封材料，如聚乙二醇（PEG）、琼脂糖[99]和透明质酸[100]。最流行的包封材料是藻酸盐水凝胶。当藻酸盐滴入二价阳离子溶液如钙、钡和铁离子溶液中时，藻酸盐立即形成水凝胶。因此，通过将含有海藻酸钠溶液的细胞悬浮液滴加到二价阳离子溶液中，可以容易地实现细胞的包封。而且容易通过将胶囊浸泡在螯合物中来消化藻酸盐水凝胶（例如，乙二胺四乙酸（EDTA）和柠檬酸）或藻酸盐裂解酶溶液。作为对胶囊的进一步处理，因为藻酸盐水凝胶胶囊在其表面上具有负电荷，所以藻酸盐水凝胶可以通过将水凝胶胶囊浸泡在聚阳离子如聚-L-赖氨酸和壳聚糖中而被聚离子复合物膜覆盖。在形成聚离子复合物后，可以通过将包衣胶囊浸泡在螯合物溶液中来制备具有液芯的中空胶囊[96，97]。先前的文献已经报道，将多能干细胞（PSC）简单地包封到藻酸盐中导致细胞从帽中渗漏并在胶囊外部生长;因此，形成聚离子复合物膜对于PSC在胶囊中的扩增是必不可少的[96，97，101]。4. 灌装和冷冻过程除了iPSC生产过程的上游部分之外，在iPSC培养研究期间必须考虑扩增过程之后的下游过程。这些下游过程，包括填充和冷冻过程，对于包装扩增的细胞是必不可少的4.1. 冷冻（灌装）在填充过程中，将0.5-2.0 mL含有冷冻保护剂的细胞悬浮液分配到小瓶中是一项耗时的任务，由于冷冻保存介质的毒性，其影响冷冻保存后iPSC的质量和活力。由于这一问题，规模扩大仅限于完成灌装过程（包括从培养物转移）的水平系统到灌装系统，可在1小时内完成。考虑到与常规手动填充程序相关的时间限制，估计的扩增规模约为1这意味着需要用同一批次的细胞悬液填充数千至数万个小瓶在灌装过程中，细胞以时间依赖的方式衰减先前的报告表明，1小时是确保iPSC在冷冻保存培养基中的最大活力的最佳时间[102]。因此，为了获得所需的批量规模，开发高通量灌装工艺和并行生产系统至关重要。这种限制主要是由于冷冻保存介质中的二甲基亚砜（DMSO）据报道，DMSO会导致蛋白质聚集[103]并损害线粒体完整性和膜电位[104]。在冷冻保存iPSC和ESC的情况下，据报道，暴露于DMSO会降低多能性基因[105，106]并促进分化标志物[106]。因此，已经研究了使用不含DMSO的冷冻保存介质的先前的研究表明，乙二醇是DMSO的一种有前景的替代品，具有较低的毒性和玻璃化冷冻的高效性[107，108]。此外，使用由乙二醇、蔗糖和羧化聚-L-赖氨酸组成的冷冻培养基已被证明可通过抑制冰结晶来改善缓慢玻璃化后的细胞活力[109]。4.2. 冷却（Cooling down）冷冻是细胞生产中涉及的关键操作之一。传统上，iPSC通过玻璃化冷冻保存，即在高导热性容器（例如开放式吸管）中用液氮立即冷冻。该技术开发用于保存牛卵子和胚胎，并用于PSC保存。玻璃化可以防止在冷冻过程中形成导致细胞损伤的晶体;因此，这是一种成功的方法，在实验室规模上实现了高回收率（超过75% ，而缓慢冷却后为5%-10%）。然而，用于玻璃化的冷冻保存介质通常具有高浓度的冷冻保护剂，例如DMSO和乙二醇，使介质具有高渗透压和毒性。因此，快速解冻对于玻璃化冷冻细胞样品的成功回收是重要的。这是通过将玻璃化细胞样品浸入预热的培养基中来实现的。尽管玻璃化冷冻是一种在实验室中广泛使用的成功方法，但它在PSC的稳定大规模生产方面具有一定的局限性，例如难以控制温度和由于与液氮直接接触而造成的污染。先前的报告提出了具有可拆卸孔和螺帽的培养板的新颖设计，用于通过玻璃化储存粘附的人ESC，这可能有助于开发用于处理大量细胞的自动化系统[110]。虽然缓慢冷冻在过去表现不佳[111]，低温保存介质的发展[112，113]以及缓慢冷却系统冷冻方法的[114]改进了这些系统的性能和相关的细胞生产率。如果用于缓慢冷却的速度太快，快速冷冻将导致细胞内冰晶形成。这些细胞内冰晶破坏细胞器和细胞膜，并导致细胞在解冻和重新接种期间受损和死亡[115，116]。另一方面，冷冻过慢会导致细胞内水因渗透压而被去除[115，116]，这会导致细胞脱水和收缩，导致细胞器、质膜和细胞骨架的破坏，最终导致细胞死亡。因此，在本发明中，I. Horiguchi和M. 木野冈工程7（2021）144149·在缓慢冷却系统中，冷却速率应当足够慢以防止细胞间冰的形成，但又足够快以防止细胞内水的去除。报告的最佳冷却速率为0.5 -1.0 K min-1[114，116，117]。在缓慢冷却法中，温度被控制并逐渐降低至最终温度（低于-80 °C）[118]。一个程序控制的深冻器用于缓慢冷却，并且已经报道了各种温度控制过程。 然而，当考虑按比例放大时，简单的冷却程序对于在批量冷却期间允许温度可控性是重要的。该方法对于按比例放大是可行的，但是可接受的温差（即，该方法的温度稳定性）仍然不清楚，尽管有几篇关于低温保存的报道。这种温度鲁棒性的缺乏将影响冷冻过程的可扩展性，因为按比例放大会由于热传导而导致温度变化。目前，正在开发一种深度过冷方法，作为使用快速冷却的另一种方法[119，120]。在该方法中，与常规冷冻保存相比，在较高温度下不冷冻地保存细胞。这种方法的困难在于保持过冷水处于未冻结状态，因为它很容易在各种刺激下形成冰晶。最近的一项研究表明，用不混溶的液体密封表面可以提高稳定性，并使研究人员能够在-7至-10 °C下储存人类红细胞100天[120]。经过进一步的开发，这种方法将是一个有前途的候选人储存细胞作为最终产品。总而言之，下游工艺仍然是扩大iPSC生产的潜在瓶颈，必须开发新的方法来优化下游加工。为此，有必要研究各种条件对细胞活力和质量的影响，如在冷冻保存介质中的悬浮时间和温度差。4.3. 冷冻后（储存、运输和解冻）冷冻后，通常将冷冻的细胞悬浮液储存在具有液氮的冷冻保存罐中（约100 °在液相中-196 °C和在气相中-170 °C），如在常规细胞系中。特别是，低于-130 °C的温度是长期储存电池的理想条件。这是因为液态自由水在低于-130 °C的温度下不存在，并且结晶或玻璃态具有足够高的粘度以防止影响完全停止生物时间。 尽管许多细胞系储存在-70至-90 °C的温度范围内，在这种情况下，生物时间不会停止数月或数年，而是减慢。因此，影响细胞活力和特性的生物反应仍然会发生，并且这些影响会累积。事实上，先前的研究表明，在-80 °C下储存期间，肝细胞的活力下降，但在-170 °C下可维持一年[121]。在细胞生产期间，温度由于各种操作而波动，例如在从冷冻器运输到储存期间。此外，冷冻细胞样品的运输方法仍在开发中。先前的研究报告称，储存期间重复的温度波动会降低解冻后的细胞活力[122]。运输过程中温度波动和容器加速度对冻存细胞的影响尚不清楚。因此，为了开发稳定的冷冻保存系统，了解冷冻细胞质量对这些波动的稳健性是必要的。此外，尚未开发出运输冷冻细胞的有效方法。除了适当的热管理，运输振动对冷冻细胞的影响仍然没有得到很好的理解，必须加以考虑。的理解冷冻细胞对温度变化和力的鲁棒性，可以实现细胞产品的稳定运输。解冻细胞是影响细胞质量的另一个关键操作。传统上，在37 °C下快速解冻细胞并避免过热对成功回收很重要[116]。据报道，缓慢解冻由于冰晶重新形成而导致细胞损伤。虽然在这一领域已经完成了一些工作，但为了用电池产品获得稳定和成功的结果，5. 未来展望：稳定生产的障碍尚未解决如上所述，有必要开发从膨胀过程到填充和冷冻过程的可扩展过程。尽管已经在实验室规模上对PSC进行了研究大规模生产的主要障碍之一是iPSC生产中的操作复杂且手动进行，由于手动处理的波动，可能导致电池质量的波动。此外，如第2.3节所述，细胞特征在培养过程中以时间依赖性方式发生突变[46，123]。最近的分析表明，细胞的特征，包括基因表达和药物反应，在实验室之间具有广泛的异质性，即使在相同的细胞株内也是如此[124，125]。与抗体等细胞产物的生产不同，这种异质性不能被忽视，应该最小化，因为细胞本身就是iPSC生产过程中的产物为了避免这种异质性，必须建立一种合适的质量控制方法，包括评价方法的开发和评价参数的设置。还需要开发可重复的生产工艺。如第3.1节所述，自动化是实现稳定生产的培养操作的高重现性的有前途的方法。虽然各个行业都开发了自动化培养系统，但从人工操作到自动化操作的转换仍在发展中。这一发展需要了解细胞培养中的关键操作和参数对于自动化细胞培养系统等开发在化学工程方面，已经利用各种参数来优化细胞生产过程。例如，雷诺数（即惯性力与粘性力之比）当开发稳定的iPSC生产过程时，这些参数有助于在实际执行之前预测操作的结果在最近的一项研究中，一个专门研究运输现象的小组证明，弗劳德数，即流动惯性离心力和重力体积力的比值，可用于预测接种过程中振摇后细胞的异质性[126]。这些参数设计和性能指标对于开发iPSC的稳定生产方法是必要的。在质量控制方面，生物学分析和统计学分析都是有效的如3.1节所述，包括深度学习在内的人工智能策略有望得到发展。深度学习在生物信息学、计算生物学和医学应用等各个领域都在迅速发展[127，128]。这些分析可以实现无破坏的质量检查，并允许通过显微镜的延时捕获进行实时监测。然而，这种分析也往往是“黑箱”模型，因此为了建立有效的深度学习系统，生物实验的支持非常重要。I. Horiguchi和M. 木野冈工程7（2021）144150开发稳定大规模生产iPSC的另一个困难是，操作对细胞的影响是间接的。例如，在通过移液分离细胞的过程中，移液操作可以由流速定义;然而，该操作对细胞的影响以剪切应力的形式发生。换句话说，在操作期间可以调整的参数和实际影响细胞的参数是不同的。因此，进一步研究如何将操作参数转化为实际影响电池的参数对于开发稳定的大规模生产工艺是重要的。这种解释不仅需要生物学，而且需要各种工程领域，如力学，流体动力学和计算工程。6. 结论在这篇综述中，我们讨论了iPSC生产中涉及的上游工艺（如扩增）和下游工艺（如灌装和冷冻）的发展和障碍。我们介绍了基于粘附、悬浮和支架的培养系统的优点和缺点，并讨论了作为iPSC大规模生产的可能瓶颈的下游过程。虽然iPSC的研究已经进行了几十年，但iPSC生产的工业化尚未实现。为了确保稳定的iPSC生产，必须研究生产工艺，以确定细胞质量的评估因素，确定操作期间影响细胞质量的输入，并了解这些影响的机制。对于这些研究，有必要设计实验以从诸如生物学、机械工程、物理学和计算工程的各种观点研究iPSC生产。上述问题不仅适用于iPSC的生产，而且也是其他常见细胞产物如间充质干细胞的生产中的问题。因此，解决这些问题的工程方法将可用于稳定生产各种细胞产品，包括再生组织和人造肉。确认本 研 究 得 到 了 日 本 医 学 研 究 与 开 发 机 构 （ AMED; JP 20 be0604001）的支持。遵守道德操守准则Ikki Horiguchi和Masahiro Kino-oka声明他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。引用[1] 高桥K，山中S.通过确定的因子从小鼠胚胎和成体成纤维细胞培养物诱导多能干细胞。Cell 2006;126（4）：663-76.[2] Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，Narita M，Ichisaka T，Tomoda K，et al. 通过确定的因子从成人成纤维细胞诱导多能干细胞。Cell2007;131（5）：861-72.[3] Uto S，Nishizawa S，Hikita A，Takato T，Hoshi K.诱导多能干细胞在CLAWN小型猪骨软骨替代模型中的应用。 Regen Ther 2018;9：58-70.[4] RezaniaA，Bruin JE，Arora P，Rubin A，Batushansky I，Asadi A，et al. 体外培 养 人 多 能 干 细 胞 产 生 胰 岛 素 的 细 胞 治 疗 糖 尿 病 。 Nat Biotechnol2014;32（11）：1121-33.[5] Bertolotti E，Neri A，Camparini M，Macaluso C，Marigo V.干细胞作为视网膜色素上皮移植的来源。Prog Retin Eye Res2014;42：130-44.[6] HartmanME，Dai DF，Laflamme MA. 人类多能干细胞：作为心肌细胞来源用 于 体 外 建 模 和 基 于 细 胞 的 心 脏 修 复 的 前 景 和 挑 战 。 Adv Drug DeliverRev2016;96：3-17.[7] Farkhondeh A，Li R，Gorshkov K，Chen KG，Might M，Rodems S，et al.Inducedpluripotent stem cells for neural drug discovery.今日药物发现2019;24（4）：992-9.[8] 后MJ。从干细胞培养肉：挑战和前景。肉类科学2012;92（3）：297-301。[9] 茨韦格特河干细胞及其衍生物的大规模生产。In：Martin U，editor.干细胞治疗生物化学工程/生物技术进展。Berlin：Springer. p.201比35[10] Hassan S，Simaria AS，Varadaraju H，Gupta S，Warren K，Farid SS.同种异体细胞治疗生物过程经济学和优化：下游处理决策。再生医学2015;10（5）：591-609。[11] Simaria AS，Hassan S，Varadaraju H，Rowley J，Warren K，Vanek P，等. 同 种异 体细 胞治 疗生 物过 程的 经济 性和 优化 ： 一次 性细 胞扩 增技 术。Biotechnol Bioeng2014;111（1）：69-83.[12] Li Y，Ma T.大规模人类多能干细胞库冷冻保存的生物处理。BioRes OpenAccess2012;1（5）：205-14.[13] [10] RavenN，Rasche S，Kuehn C，Anderlei T，Klöckner W，Schuster F，etal. 在200 L轨道振荡一次性生物反应器中按比例放大生产由植物细胞产生的重组抗体。Biotechnol Bioeng2015;112（2）：308-21。[14] Varum S ， Rodrigues AS ， Momcilovic MB ， Momcilovic O ， Easley CA ，Ramalho-SantosJ，et al. 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