囊状棘球蚴病中EgA31和EgG1Y162抗原的免疫显性表位研究

医学信息学解锁21（2020）100464囊型棘球蚴病来自EgA31和EgG1Y162抗原的免疫显性表位Hassan Nourmohammadia，b，1，Erfan Javanmartic， 1，Morteza Shams b，SadeghShamsinia d， Mohammadreza Chaechi Nosratie，Ali Yousefi f，Taher Nemati g，Mohammad Fatollahzadeh g，Ezatollah Ghasemih，Bahareh Kordii， j，Hamidreza Majidianii， *，Hamid Irannejadk，l，**a伊朗伊拉姆医科大学Shahid Mostafa Khomeini医院内科b伊朗伊拉姆医科大学人畜共患疾病研究中心c伊朗布什尔布什尔医科大学“波斯湾烈士”医院临床研究发展中心d伊朗德黑兰Tarbiat Modares大学医学院寄生虫学系e伊朗德黑兰伊斯兰阿扎德大学病理学系科学和研究处f伊朗哈马丹哈马丹医科大学学生研究中心g伊朗伊斯法罕伊斯法罕医科大学医学院寄生虫学和真菌学系hDezful医科大学医学院医学寄生虫学系，伊朗i伊朗Neyshabur医科大学基础医学系j伊朗马什哈德Ferdowsi大学兽医学院病理学系，马什哈德k伊朗萨里马赞达兰医科大学药学院药物化学系l药物科学研究中心，马赞达兰医科大学，萨里，伊朗A R T I C L EI N FO保留字：细粒棘球绦虫EgA31EgG1Y162多表位疫苗A B S T R A C T囊状棘球蚴病（CE）是一个几乎世界性的公共卫生问题，特别是在发展中国家。寄生虫卵通过最终宿主粪便脱落，导致牲畜和偶尔人类感染，导致包虫囊肿。使用合适的抗原进行免疫是一种很好的免疫预防策略。本研究的目的是利用EgA31和EgG1Y162抗原设计多表位疫苗。预测并选择排名靠前的B细胞表位和主要组织相容性复合体（MHC）结合表位构建疫苗模型。然后，使用网络服务器对多表位疫苗构建体的物理化学特征、二级和三级结构、细化和验证进行评估。最后，确定疫苗-抗体相互作用的非线性B细胞表位。此外，对疫苗构建体进行二硫键工程改造、与人MHC-I和MHC-II分子的分子对接以及密码子适应和计算机克隆过程。总之，这种多聚体CE疫苗需要实验和临床确认才能被认为是实际免疫原性疫苗模型。1. 介绍绦虫是具有医学和/或兽医重要性的分节扁虫。其中以带绦虫科为代表，包括“带绦虫“和“棘球绦虫“两个属，生活史中有两种哺乳动物宿主，具有捕食-被捕食关系[ 1 ]。细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosussensu lato，E.颗粒菌属）是一种著名的人畜共患绦虫，几乎世界性分布，主要分布在地中海地区、中亚、南美洲和东北非洲[2]。成虫栖息在食肉动物（犬科动物和猫科动物）的肠道中，而后绦虫阶段主要栖息在草食动物中间宿主（有蹄类动物，兔形目动物和啮齿动物）的肝脏和肺部[3]。人类通过偶然摄入最终宿主粪便中排出的感染性虫卵而感染[4]。囊状棘球蚴病（CE）或包虫病（HD）是中间宿主感染的主要后果，表现为充满液体的囊，其中含有数千个原球蚴（PSC），每年给牲畜部门和人群造成经济负担[5，6]。人类CE的发生率* 通讯作者。** 通讯作者。伊朗萨里马赞达兰医科大学药学院药物化学系电子邮件地址：H. modares.ac.ir，hamidreza. gmail.com（H. Majidiani），Irannejadhamid@gmail.com（H. Irannejad）。1 H. Nourmohammadi和E. Javanmarti同样为这项工作做出了贡献。https://doi.org/10.1016/j.imu.2020.100464接收日期：2020年6月5日;接收日期：2020年10月13日;接受日期：2020年10月17日2020年10月22日在线提供2352-9148/©2020的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：http://www.elsevier.com/locate/imuH. Nourmohammadi等人医学信息学解锁21（2020）1004642在流行地区，发病率为每10万人1至200例，死亡率较低（2CE是一种危及生命的疾病，尽管其具有潜伏性、慢性性，这在很大程度上影响了实际患病或看似健康的受试者的适当诊断;因此，在给定人群中可能存在低报病例[9]。针对CE的治疗方案不够有效和/或会导致Xic后果[10]。此外，通过手术治疗通常是不够的，需要长期的临床随访[11]。因此，采用免疫预防方法将是预防感染的实用和合理的策略[12]。E.颗粒菌涉及用于增强免疫的精确抗原选择和疫苗设计[13]。因此，针对大肠杆菌生活史中不同的关键抗原分子，颗粒菌和/或它们的免疫显性表位将是针对CE的疫苗接种的有前景的方法[14]。有几种抗原在蠕虫路径中起着关键作用-疾病的发生和/或进展[13]。参与狗和人感染的关键抗原是一种66 kDa的纤维蛋白，称为EgA31，具有单拷贝基因。这种抗原在PSC的皮层、皮层下实质细胞和皮下肌肉中表达。在头部发育过程中的前吸盘区域以及成虫的皮层和皮层下薄壁组织中也发现了该蛋白[15]。EgG1Y162是成虫、PSC、棘球蚴的生发层和卵中的表面抗原，其穿透宿主细胞膜[16]。开发候选疫苗在临床前和临床阶段都是昂贵、复杂和耗时的，需要针对人工感染和实验/自然疾病状况、制剂、人用安全性和良好生产实践标准进行体外和体内功效评估。随着生物信息学的出现，计算方法促进了对拟定候选疫苗的计算机模拟评价，大大减少了上述程序所需的时间[17，18]。在这项研究中，我们利用生物信息学的方法来预测B细胞和T细胞特异性表位从四个抗原的E。颗粒菌（EgA31和EgG1Y162），并将地基为设计一基于多表位候选疫苗反对CE。2. 材料和方法2.1. 用于疫苗构建的php），通过结合三肽相似性和倾向性得分（SVMTriP）来利用SVM，以实现更好的预测性能。随后，选择高等级和共享的B细胞表位，并使用VaxiJen v2.0（http：//www.example.com）、AllergenFPv1.0 （ http://ddg-pharmfac.net/AllergenFP/ ） 和 PepCalc（https：//pepcalc.com/）进一步评估抗原性、变应原性和溶解度。www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html最后，选择具有合适特征的表位用于疫苗构建。2.3.主要组织相容性复合体（MHC）结合表位的估计为此目的，利用多功能免疫表位数据库（IEDB）在线服务器来揭示特 定 的 MHC-I （ http ： //tools.org/ ） 。 iedb.org/mhci/ ） 和 MHC-II（http://tools.immuneepitope.org/mhcii）表位的分析2.22.该网络服务器外推分配给特定表位的IC50值，产生可能的结果：高亲和力表位（50 nM），中等亲和力表位（500 nM）和低亲和力表位（5000 nM）。此外，预测的表位被给出百分位，与表位亲和力呈负相关排列。在这里，我们考虑了两种人类白细胞抗原（HLA）分子，包括HLA-A*02：01和HLA-DRB 1 *03：01，分别预测与T细胞CD+8（MHC-I）和T细胞CD+4（MHC-II）结合的特异性表位。MHC-I（10-mer）和MHC-II（15-mer）表位的预测是分别根据IEDB推荐的2020.04（NetMHCpan EL 4.0）和IEDB推荐的2.22方 法 进 行 。 使 用 VaxiJen v2.0 和 AllerTOP v2.0 （ https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/）服务器通过抗原性和变应原性进一步筛选那些选择的高等级表位。2.4.多聚体疫苗候选序列的工程化和组装在使用生物信息学服务器进行表位预测和筛选之后，选择得分最高的免疫显性表位来组织和组装推定的多聚体疫苗候选序列。为了提高蛋白疫苗的免疫原性，结核分枝杆菌的肝素结合血凝素（HBHA）作为一种有效的免疫佐剂，其序列来自UniProtKB服务器（Accession No：P9WIP9）。佐剂序列通过疫苗我们从18个蛋白质序列中选择了4个，E.颗粒菌用于进一步表位作图和多表位疫苗构建的抗原。为此目的，对细粒棘球绦虫s. l. EgA31（登录号：076379）和EgG1Y162顺序B细胞和T细胞CD+8GPGPG接头，而TCD+4至AAY接头。表位通过表位连接在一起（登录号：B9ZZQ3）通过UniProtKB服务器（https）收集：www.uniprot.org/）。此外，配备有深度神经网络的服务器，即DeepLoc1.0，用 于预测蛋 白质的亚 细胞定位（http://www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/）[19]。2.2. 线性B细胞表位预测和筛选采用三个Web服务器进行线性B细胞表位预测，包括BCPREDS，ABCpred和SVMTriP。BCPREDS服务器（ http://ailab.ist.psu.edu/bcpred/predict.html ） 基 于 支 持 向 量 机（SVM）结合子序列核（SSK）态度预测连续B细胞表位，预测准确率为74.57%。对于该研究，选择了具有80%特异性的固定长度表位（20个氨基酸）预测方法。此外，通过其他网络服务器检查预测表位的交叉验证。ABCpred服务器（ http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/ABC_submission.html ） 用 于基于人工神经网络（ANN）算法的固定长度模式预测，准确率为65在SVMTriP服务器（http://sysbio.unl.edu/2.5. 疫苗构建体的理化特征疫苗构建体的物理-化学性质通过可在（www.example.com）获得的E x PASy-ProtParam服务器http://web.expasy。org/protparam/）。通过该网络工具估计若干参数，包括总平均疏水性（GRAVY）、脂肪族指数、不稳定指数、半衰期、等电点（pI）、分子量和原子组成。蛋白质半衰期表示分子在其合成后在细胞中消失的时间。不稳定性指数表明蛋白质分子在试管中的一致性。脂肪族侧链的近似占据质量表示脂肪族指数，而GRAVY是特定蛋白质中氨基酸的平均亲水性值。分子不带任何净电荷的pH值称为pI [ 21 ]。2.6. 设计序列适当的疫苗构建体不应诱导过敏反应。因此，使用AllerTOP v2.0（http：//H. Nourmohammadi等人医学信息学解锁21（2020）1004643==www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP ） 和 AllergenFP v1.0 （ http ：//ddgpharmfac.net/AllergenFP/）。可免费访问的AllerTOP v2.0服务器采用机器学习技术对过敏原进行排序，如k最近邻、自动和交叉方差变换以及氨基酸E-描述符。该服务器的准确性在五重交叉验证时为85.3%[22]。另一个在线服务器AllergenFP v1.0基于四步、免检测、基于指纹图谱的方法区分过敏原和抗原，使用0.759的Mathews相关系数，准确率为88.9%[23]。为了预测构建体的抗原性指数，使用ANTIGENpro（http：//www.example.comscratch.proteomics.ics.uci.edu/）和VaxiJen v2.0（http：//www.example.com）。ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）网络服务器。基于特定的微阵列分析数据，ANTIGENpro执行无病原体的比对。交叉验证实验表明，该服务器的预测准确率为76% [24]。VaxiJen v2.0服务器“对蛋白质的自动和交叉方差（ACC）转换起作用，并将其转换为主要氨基酸特性的统一向量。它产生蛋白质的抗原性，而不涉及任何比对，并侧重于所选候选物的理化性质“[ 25 ]。此外，我们开发了SOLpro在线工具，用于预测溶解度，蛋白质构建体在大肠杆菌（Escherichia coli）（E. 大肠杆菌）主机（http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/），具有74%的准确预测和10倍交叉验证方法[26]。2.7. 候选疫苗二级和三级结构的外推使用两个网络服务器预测多表位疫苗候选物的二级结构，包括Garnier-Osguthorpe-Robson （ GOR IV ） 在 线 服 务 器 （ https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page npsa_gor4.html），平均准确度为64.4% [27]，并对来自PSI-BLAST（www.example.com）的输出进行位置特异性迭代预测（PSIPRED）分析http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/[28]。在下一步中，将多表位疫苗构建体置于I-TASSER服务器中进行同源性建模（ https://zhanglab.ccmb.med.umich. edu/I-TASSER/ ） 。 I-TASSER（Iterative Treading ASSEmbly Refnement）是一个排名最高的服务器，用于生成自动蛋白质结构和预测。在提交氨基酸序列后，I-TASSER通过利用多线程比对和迭代结构组装模拟来设计3D原子模型”[ 25，29 ]。2.8. 三级模型细化和后续验证使用GalaxyRefine服务器（http：//gala x www.example.com）进一步 优 化 和 改 进 通 过 I-TASSER 服 务 器 获 得 的 三 级 蛋 白 质 模 型y.seoklab.org/cgi-bin/subunit.cgi?类型REFINE）。 This server 用高概率旋转异构体取代氨基酸，并应用分子动力学模拟进行整体结构松弛。输出通常包括五个改进的模型，具有不同的参数评分，包括GDT-HA，RMSD，MolProbity，Clash评分，Poor rotamers和Rama favored [30，31]。在下文中，细化的模型需要使用各种服务器进行后续验证。ERRAT服务器探索了非键合原子与原子相互作用的统计数据，并描绘了误差函数值与9残基滑动窗口位置的关系，通过与高分辨率晶体学结构的统计数据进行比较来估计（https://servicesn.mbi.ucla.edu/ERRAT/）[32]。Ramachandran图的生成提供了构成氨基酸psi（ψ）和phi（φ）的能量上允许和不允许的二面角的可视化。该估计主要基于侧链的范德华半径[25]。在本研究中，MolProbity服务器用于提供Ramachandran分析的所有原子结构验证（http://molprobity.biochem.duke.edu/）。2.9. 构象B细胞表位预测IEDB服务器的ElliPro在线工具（可在http://tools.iedb.org/ellipro/获得）用于通过默认设置（即，6个最大距离和0.5分钟评分）来预测多表位序列中的不连续B细胞表位。该预测方法分为三步：相邻残基聚类、残基突出指数（PI）和蛋白质形状估计高分残留物与溶剂可及性改善之间可能存在这是最好的服务器之一，预测的AUC得分为0.732 [33]。2.10. 疫苗蛋白二硫键工程二硫键工程是一种重要的生物技术工具，通过半胱氨酸突变序列中高度移动区域的残基来设计新的二硫键二硫键提供了相当大的稳定性，并加强了蛋白质的几何构象。为此，使用了DbD2在线服务器，可在http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2/index.php上获得。如果每个氨基酸残基突变为半胱氨酸，则可以通过该网络服务器检测能够形成二硫键的残基对[34]。2.11. 分子对接在经验证的候选疫苗构建体与HLA-A0201（PDB登录号：4UQ 3）和HLADRB 1 *03：01（登录号：2 Q6 W）之间进行分子对接过程，以分别评价疫苗与MHC-I和MHC-II分子的该生物信息学预测使用ESPRINPRO 2.0服务器进行，并相应地使用默认设置[35]。使用PyMol v2.4软件将最高等级簇中的最佳对接姿势用于可视化，并解释结果。2.12. 反向翻译、密码子优化和计算机克隆使用SnapGene® v5.1.7软件的计算机克隆工具进行疫苗模型在合适的表达载体中的克隆和表达的评价。为此目的，疫苗氨基酸序列最初通过可获得的Sequence Manipulation Suite服务器的反向翻译工具翻译回核苷酸序列。在https://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html。接下 来 ， 为 了 密 码 子 适 应 的 目 的 ， 将 序 列 置 于 JCat 在 线 软 件（http://www.jcat.de）中。该网络服务器使靶DNA/蛋白质的密码子使用适应其潜在表达宿主，产生优化序列以及密码子适应性指数（CAI）和GC含量百分比（GC %）。对于CAI，0.8至1之间的评分范围被认为是最佳值，表明在相应生物体中基因表达的改善。此外，GC %应该是30%-70%;否则，它可能导致转录和翻译缺陷。随后，NEBcutter v2.0被用来探索各种可能的切割位点。 的 商业 限制 酶 在 密码子优化的序列 （http://nc2.neb.com/NEBcutter2）。 然后， 合适的限制性在优化的候选疫苗DNA序列的5′和3′3. 结果3.1. 氨基酸序列检索和亚细胞定位使用UniProtKB数据库检索EgA31和EgG1Y162抗原序列。DeepLoc1.0输出结果显示，EgA31和EgG1Y162抗原主要分别专用于高尔基体和细胞膜。H. Nourmohammadi等人医学信息学解锁21（2020）1004644=×--±±3.2. 连续B细胞表位预测和筛选应用交叉检查程序以更好地鉴定线性B细胞表位。首先，使用BCPREDS服务器预测具有固定长度和80%阈值的线性B细胞表位。在下文中，为了辨别共享表位并增加置信度，将BCPREDS的输出与使用ABCpred和SVMTriP网络服务器发现的表位交叉验证。在选择共有表位后，进行关于抗原性、变应原性和溶解性特征的最终评价。结果表明，来自每种抗原的一个线性B细胞表位具有适当的特征以包含在最终的多聚体疫苗序列中（补充表1）。3.3. T细胞表位预测和选择首先，预测具有与MHC-I（HLA-A*02：01）和MHC-II（HLA-DRB1 *03：01）分子结合能力的表位，并根据其在IEDB数据库中的百分位等级对其进行排序。接下来，通过VaxiJen v2.0和AllerTOP v2.0服务器分析预测的表位区域的抗原性和变应原性。因此，选择具有高MHC结合和抗原特性且无变应原性的表位。对于每种抗原，为每种检查的MHC分子选择两个表位，并将其鉴定为包含在最终疫苗构建体中（补充表2）。3.4. 疫苗工程和理化性质最终的疫苗由369个氨基酸组成，被组织在通过适当的接头连接在一起的三个结构域中：HBHA作为佐剂，线性B细胞表位和T细胞表位（图1）。EX PASy ProtParam网络服务器确定了我们的产品的物理化学特征。疫苗模型，如表1所示。初步估计证明多表位疫苗构建体是稳定的（不稳定指数40）、亲水的（负GRAVY评分）和中等酸性的（理论pI5.33），计算的分子量为39143.61道尔顿（39.14 kDa）。<组装的疫苗序列含有较高数量的具有非常高的热稳定性（脂肪族指数为90.11）。在哺乳动物网织红细胞（体外）中的蛋白半衰期约为30 h，在酵母（体内）中> 20 h，在E. coli（in vivo）。3.5. 致敏性、抗原性和溶解度特征使用AllerTOP v2.0和AllergenFP v1.0网络服务器，在存在或不存在佐剂序列的情况下，证明疫苗蛋白序列本质上无过敏原性。此外，使用VaxiJen v2.0和ANTIGENpro服务器评估整个疫苗构建体的抗原性，分别为0.6655和0.9377，表明构建体的抗原特性。此外，在不存在HBHA佐剂的情况下，VaxiJen v2.0（0.7191）和ANTIGENpro（0.8227）输出结果表明疫苗构建体本质上具有抗原性。此外，通过SOLpro服务器预测的过表达后的溶解度显示，表1疫苗构建体的理化评估。参数结果氨基酸369分子量（MW）39.14 kDa阳性残基（Arg+Lys）52阴性残基（Asp+Glu）58理论等电点（pI）5.33EX着色系数（280 nm处，在水中）10430 M-1cm-1估计半衰期（哺乳动物网织红细胞，体外）30 h估计半衰期（酵母细胞，体内）>20小时估计半衰期（大肠杆菌，体内）>10小时不稳定指数39.29脂肪族指数90.11亲水性总平均值（重力）-0.355疫苗序列可溶的概率为0.788149。3.6. 二级和三级结构预测通过GOR IV网络服务器以图形方式预测多聚体疫苗的二级结构以辨别α螺旋、延伸链和无规卷曲。因此，输出如下：261（70.73%）个α螺旋，89（24.12%）个无规卷曲和19（5.15%）个延伸链。GOR IV服务器的图形细节以及PSIPRED服务器输出的二级结构如图2所示。基于I-TASSER服务器，采用LOMETS Meta服务器线程方法确定的前10个线程模板预测嵌合疫苗构建体的5个三级结构模型。根据Z值，10个模型中有3个包括5g2a、5h 7cA和6h 2XA具有良好的对齐。服务器提供的五个模型的C分数从1.49到4.09不等。作为每个模型的置信度指数，C-评分通常在5和2之间，其中较高的值表示较高的模型置信度。在本研究中，选择具有最高C分数的模型用于未来的细化过程。该模型的C评分为1.49，估计TM评分为0.52 ± 0.15，估计RMSD为10.1 4.6（图3，A）。TM评分有助于分析两种蛋白质结构之间的相似性，消除与RMSD值相关的所有波动。TM-评分高于0.5或低于0.17分别显示准确的拓扑学或非特异性相似性。3.7. 三级模型GalaxyRefine输出为嵌合构建体提供了五个精细模型。1号模型是Galax-yRefine服务器中最好的细化结构，具有合格参数，例如GDT-HA为0.9614，RMSD为0.381，MolProbity为1.963，Clash得分为12.4，Poorrotamer为0.7，Rama favored为94.8。因此，最终选择该模型作为进一步研究的嵌合模型。接下来，使用两个网络服务器评估改进模型的质量。在ERRAT服务器中，粗模型的总质量估计为94.44，在改进的疫苗模型中提高到98.85。根据Fig. 1. 多表位疫苗构建体中选择的B细胞和MHC结合表位的构象。 最终的嵌合蛋白由369个氨基酸残基组成。H. Nourmohammadi等人医学信息学解锁21（2020）1004645----图二. 疫苗模型的预测二级结构。(A)GOR IV服务器结果表明，70.73%、24.12%和5.15%的多表位序列分别专用于α螺旋（蓝色H）、无规卷曲（黄色C）和延伸链（红色E）。(B)PSIPRED服务器的二级结构图示。（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的Web版本精细模型的MolProbity Ramachandran图分析，94.8%(348)在有利区域中发现，99.5%（365）和7.38%[2]分别在允许区域和离群区域中。另一方面，粗模型显示84.7%（311）的残基位于有利区域（图3B和C）。3.8. 构象B细胞表位预测根据IEDB服务器的ElliPro工具，在工程化精制疫苗模型中有五个构象B细胞表位。鉴定的表位的细节和括号中的相应评分如下：I）32个残基（0.811）;II）57个残基（0.744）; III）43个残基（0.811）;III）残 基 （ 0.737 ） ， IV ） 40 个 残 基 （ 0.673 ） ; 和 V ） 14 个 残 基（0.607）。构象B细胞表位的细节如图1B所示。 四、3.9. 疫苗蛋白二硫键工程通过DbD2服务器预测，总共有27对氨基酸残基具有形成二硫键的潜力。在通过chi 3和B因子能量参数进行残基评估之后，发现仅四个残基满足二硫键形成，包括ALA 83 - ARG 94、VAL 118- PRO– 根据87 ~ 97卡方值和2.5能量值进行残留筛选。3.10. 分子对接最佳的对接位置和方向，成功地预测由HLAPro 2.0服务器，选择从排名最高的集群的基础上的集群大小与最高的成员数75和55和最低的能量分别为4UQ 3（HLA-A0201）和2 Q6 W（HLADRB 1 *03：01）的登录号。发现这些簇的加权得分为1079.3和965.4，这是分别针对4UQ3和2Q6W的PDB ID计算的静电、疏水和范德华能量的平衡权重（图13）。 6）。3.11. 反向翻译、密码子优化和计算机克隆为了进行密码子适应和计算机克隆，将疫苗候选蛋白序列逆转录成核苷酸序列。随后，按照大肠杆菌（E. coli）K12菌株。初始序列的CAI值和GC%分别为0.63和61.51%，而这些在密码子适应序列中分别提高了1.0和52.03%。在疫苗序列中未发现Eco53KI和EcoRV酶的限制性位点，因此使用这些酶进行计算机克隆是安全的。为此目的，将每种酶的切割序列与Shine-Dalgarno（AGGAGG）、H6-标签和起始/终止密码子se-chain一起嵌入疫苗序列中。序列。最后，将该片段插入pET 28a（+）载体后，获得了5133 bp的成功克隆（图1）。 7）。H. Nourmohammadi等人医学信息学解锁21（2020）1004646图三. 蛋白质建模和验证。(A)多表位疫苗的最终3D模型在I-TASSER网络服务器上进行同源建模后收集，如条带和表面所示。(B)通过MolProbity对初始模型进行Ramachandran图分析，分别有84.7%和96.2%的残留物在有利区域和允许区域。（C）优化模型的摩尔概率结果显示，94.8%和99.5%的残基分别位于有利区域和允许区域4. 讨论图四、通过IEDB analysis Resource的ElliPro工具预测构象B细胞表位。在不发达国家，人口、牲畜和家犬之间存在着密切的关系[2]。因此，在本发明中，人类与HD之间的关联可以追溯到古代，当时古代研究人员暗示肝液囊[36]。这种人畜共患病的威胁仍然在世界各地普遍存在，特别是在实施免疫方法将是预防CE传播的有利基石。到目前为止，已经使用了三种疫苗接种策略来对抗CE，包括粗抗原或活疫苗。H. Nourmohammadi等人医学信息学解锁21（2020）1004647图五、疫苗蛋白的二硫键工程。（A）初始模型;（B）突变模型。见图6。 疫苗构建体与人MHC-I（HLA-A0201）和MHC-II（HLADRB 1 *03：01）分子的对接复合物。(A)设计的疫苗肽（青色）与MHC-I分子的A链（蓝色）和C链（红色）相互作用;（B）设计的肽（青色）与MHC-II分子的A链（绿色）、B链（红色）、D链（品红色）和E链（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的Web版本疫苗、DNA疫苗和重组蛋白疫苗[13]。关于使用活生物体或粗抗原的接种，使用了各种接种物，例如E.颗粒藻属L.，富含碳水化合物的部分和包虫囊液[37，38]。然而，这类议定书存在一些根本性的缺陷，包括：1)获得的免疫力不一致，2）缺乏足够和持续的特异性抗体产生，以及3）活疫苗的短保质期和安全性问题[39，40]。此外，DNA疫苗出现了改进的特征，例如持久的免疫应答、引发体液和细胞介导的免疫、可使用生物技术工程化的程序大量生产以及产生特定候选抗原的天然状态[41，42]。此外，许多疫苗候选者先前是利用一些具有免疫保护性的E. 颗粒菌重组形式的抗原[43针对E.颗粒体EG95已经在市场上应用于绵羊，在阿根廷、新新西兰、澳大利亚、中国、智利、罗马尼亚和伊朗[46]。然而，给定抗原的整个氨基酸序列可能不具有免疫原性特征，因此，强烈建议考虑多种抗原以改善免疫应答。随着计算机科学的发展和生物信息学的出现，作为一个跨学科的分支，免疫优势表位的识别已经被简化，这必然会加强针对CE的疫苗接种策略的设计和评估。在基于网络的服务器和独立软件程序的背景下采用免疫信息学算法将促进这种疫苗学方法[13，47]。我们对免疫学机制的了解E.颗粒菌在过去的二十年里，随着“组学“数据的不断增加，感染率已经增加[ 48，49 ]。关于体液应答，IgM、IgE和IgG水平，特别是IgG1和IgG4亚型，将针对CE增加，而细胞免疫包括辅助性T细胞1（Th1）和Th2应答之间的二分法。A Th 2/T调节谱和IL-10水平升高代表活动性慢性囊肿，H. Nourmohammadi等人医学信息学解锁21（2020）1004648图7.第一次会议。 将疫苗构建体的基因序列计算机限制性克隆到pET 28a（+）表达载体中。Th1是保护性的，有益于宿主。因此，针对寄生虫的免疫应答的类型和组成将显著影响疾病进展和结果，从自我治愈（抗性）到快速宿主死亡（高敏感性）[50，51]。因此，CE免疫发病机制的控制与Th 1/Th 2应答之间的平衡显著相关。因此，设计针对这种感染的新型候选疫苗至关重要。本研究旨在探索大肠杆菌EgA31和EgG1Y162抗原的免疫刺激表位。颗粒菌用于设计多表位疫苗模型以更好地预防CE。首先，从大量的E. 细粒棘S.L.分子候选物，Pourseif等人（2018）的综述文章中介绍。之前，这些抗原被显示为针对感染的潜在疫苗候选物[52]，但没有关于其免疫显性表位的任何可用信息来设计基于多表位的免疫方法。从生物化学的角度来看，蛋白质分子存在四个结构水平，包括：I）代表氨基酸序列的一级结构，II）由于主链原子（α-螺旋和β-折叠）而形成的天然空间形式，称为二级结构，III）空间中的蛋白质模型，作为3D模型或三级结构，以及IV）蛋白质多亚基集合中多折叠亚基的数量和位置，作为四元结构[52]。本文利用ProtParam服务器对所设计的多表位候选疫苗的理化性质进行了根据结果，蛋白质的分子量为39.14 kDa，被用作蛋白质SDS-PAGE电泳和western blot分析 的 指 标 另 一 个 有 用 的 参 数 是 理 论 pI ， 估 计 其 性 质 相 当 酸 性（5.33），有利于通过离子交换色谱和等电聚焦进行蛋白质纯化。多聚体疫苗模型被归类为稳定的，不稳定指数为39.29。计算蛋白质构建体的负GRAVY值（-0.355），表明分子的亲水性基于脂肪族指数（90.11），该分子具有非常高的耐热性。总之，这些生化因素是最重要的进一步提取/纯化程序在未来的实验研究。通过ANTIGENpro和VaxiJen v2.0服务器评估疫苗模型的抗原性。服务器输出显示多表位蛋白质本质上是抗原性的，计算的概率分别为0.9377和0.6655。其次，候选疫苗不应引起过敏反应;为此，我们使用了两个网络服务器，AllerTOP v2.0和AllergenFP v1.0。这两个网络服务器都表明这种蛋白质是一种非过敏原分子。此外，预测的可溶性蛋白过表达后，在E。大肠杆菌宿主证明该蛋白是可溶性的，概率为0.788149。在下文中，IV和PSIPRED网络服务器用于表示α螺旋、延伸链、β转角和无规卷曲中的氨基酸作为蛋白质二级结构的贡献。因此，GOR IV服务器输出如下：70.73% α螺旋，24.12%无规卷曲和5.15%延伸链。严格的氢键，主要位于蛋白质内部，将维持蛋白质二级结构的α螺旋和β折叠。无规卷曲和β-转角是蛋白质表面上经常突出的结构[53]。使用有效的同源性建模在线服务器I-TASSER预测疫苗模型的三级结构。由该服务器构建的模型进一步经过GalaxyRefine在线软件的精炼过程，以产生高质量的3D结构。最好的精炼模型具有以下质量分数：GDT-HA为0.9614，RMSD为0.381，MolProbity为0.9614。的1.963，冲突得分为12.4，差旋转异构体为0.7，拉玛青睐94.8. 随 后 ， 通 过 两 个 网 络 服 务 器 （ 包 括 ERRAT 质 量 参 与 者 和MolProbity）验证了细化质量，这表明疫苗序列相对改善，与粗模型相当。B细胞的诱导和随后的体液应答对于抗CE的中和抗体应答是重要的，特别是在早期感染中。为此目的，我们通过免疫组织化学的H. Nourmohammadi等人医学信息学解锁21（2020）1004649+--IEDB服务器。结果在序列中确定了5个免疫显性非线性B细胞表位，分别为32、57、43、40和14个氨基酸残留物，分别为0.811，0.744，0.737，0.673和0.607的合格分数。不可避免地，这些表位在抗体-疫苗相互作用的质量中起着至关重要的作用。缺乏关于Toll样受体（TLR）对CE的保护作用的令人信服的证据，即使已经注意到TLR拮抗剂和/或负调节激动剂可能具有增加对寄生虫的免疫力的关键功能[54，55];因此，我们通过使用人MHC等位基因进行了分子对接研究。结果表明，我们设计的多表位疫苗对HLA-A0201（MHC-I）和HLADRB 1 *03：01（MHC-II）分子都具有亲和力，最低能量分数分别为1079.3和965.4。根据经验，CAI和GC%值是在E中有效表达蛋白质的重要参数。 coli原核宿主。通常，具有30%-70%GC含量和0.8-1的CAI值的DNA序列多表位疫苗序列的密码子适应结果分别显示1.0和55.38%CAI值和GC%，表明在E. coliK12菌株表达系统。最后，将设计的密码子适应的疫苗构建体成功地连接到pET28a（）载体中用于异源克隆和表达。E.颗粒菌显示出高抗原性，可以针对包括免疫预防目的在内的几种方法。此外，由于寄生虫生命周期的复杂性，强烈建议在使用免疫信息学方法的多表位疫苗候选物的背景下采用涉及不同生命阶段的几种抗原。由于本研究的结果令人鼓舞，该候选疫苗可在各种原核和/或真核宿主中表达，用于进一步的体外和体内评价。与需要额外体外步骤的可注射重组蛋白疫苗相比，可食用和基于核酸的疫苗递送系统可以容易地使用。此外，可以使用非病毒递送系统（例如，聚合物和脂质纳米颗粒）以及体内转染系统（例如，基因枪和电穿孔）[56]。5. 结论世界上相当多的地区仍然遭受着HD及其后果的影响。这种人畜共患感染主要发生在欠发达国家，在这些国家，传统的畜牧业，特别是农村地区，为家养/流浪狗、牲畜或偶尔人类之间的感染传播提供了便利。因此，疫苗接种策略在世界上的这些地区将是有益的。目前的计算机辅助研究是为了鉴定E.颗粒菌S.L.，并使用生物信息学方法表征经免疫工程改造的多表位疫苗构建体的生物化学特征。在下文中，必须进一步验证拟定疫苗的交叉反应性、有效剂量测定、总抗体滴度、淋巴细胞增殖和细胞因子产生试验以及在适当动物模型挑战背景下的潜在毒性。事实上，这项调查的结果可以在理论上有助于未来的免疫对CE在体内实验的背景下资金这项研究没有从公共、商业或非营利部门的资助机构获得任何具体的作者这项研究由Hamidreza Majidiani和Hassan Nourmohammadi构思、设计和监