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工程17(2022)170微生态学研究发酵乳杆菌菌株的系统发育和比较基因组学分析及其肠道抗炎作用赵燕a、b,张成成a、b,俞蕾蕾a、b,田峰伟a、b,赵建新a、b,张浩a、b、c,陈伟a,b,c,e,翟奇晓a,b,d,刘伟江南大学食品科学与技术国家重点实验室,无锡214122b江南大学食品科学与技术学院,无锡214122c江南大学功能食品国家工程研究中心,无锡214122d江南大学益生菌国际联合研究实验室,无锡214122e北京工商大学食品营养与人体健康创新中心,北京100048阿提奇莱因福奥文章历史记录:收到2020年2020年9月13日修订2020年9月24日接受在线预订2021年保留字:发酵乳杆菌溃疡性结肠炎抗炎系统发育分析比较基因组分析A B S T R A C T新出现的证据表明,一些发酵乳杆菌(L。发酵菌)菌株可有助于预防和治疗溃疡性结肠炎(UC)。 本研究对105株L. 从我国不同地区人群粪便中分离发酵菌株,并对其基因组草图进行测序。对这些菌株和4个模式菌株进行了全基因组和系统发育分析。 fermentum 3872、CECT 5716、IFO 3956和VRI 003)。系统发育分析表明,该属各 基 因 组 之 间 不 存 在 明 显 的 适 应 性 进 化 。 发 酵 菌 株 和 宿 主 的 地 理 位 置 、 性 别 、 种 族 和 年 龄 。 三 湖FWXBH115、FGDLZR121和FXJCJ61菌株的系统发育树和菌株L型。选择发酵菌CECT 5716,并进一步研究它们在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠模型中的抗炎和免疫调节活性。 两个湖发酵菌FXJCJ61和CECT 5716通过降低所有结肠炎相关的组织学指标、维持粘膜完整性和刺激短链脂肪酸(SCFA)的补充而显著减轻UC,而其他两种菌株则失败提供类似的保护。并对L. FXJCJ61和CECT 5716与抑制核因子κ B(NF-κ B)信号通路激活和增强白细胞介素10(IL-10)产生有关。这些菌株的比较基因组分析确定了可能有助于特定L.发酵菌株©2021 THE COUNTORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇CCBY-NC-ND许可下的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)中找到。1. 介绍发酵乳杆菌(L.发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)是乳杆菌属中的小的、细长的、非运动的革兰氏阳性细菌。它广泛存在于发酵植物饲料和食品、牛奶、奶酪、手工发酵剂、人唾液、人阴道以及人和动物的肠道等环境中[1,2]。L. 2008年首次测定了65株L.现在可以从美国国家联合建筑研究所(NCBI)微生物基因组数据库y[3]获得发酵菌株。基因组大小和G + C含量*通讯作者。电子邮件地址:zhaiqixiao@sina.com(问:Zhai)。yhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/711。乳发酵培养基中的蛋白质含量分别为(2.1 ± 0.1)Mbp和51% ± 1%。随着全基因组测序技术的出现,L.已鉴定出发酵菌株。基因组测序的L.发酵乳杆菌菌株与一些文献记载的乳杆菌菌株如L.plantarum(467),L. rhamnosus(178)和L. paracasei(178).系统发育和比较基因组分析表明,广泛的基因丢失和横向基因转移已经发生在乳酸杆菌的共同进化。他们的家乡[7]乳酸杆菌中的某些遗传变异被预测为提供适应不同生态位的能力,并努力探索基因组进化与生态多样性之间的联系[8]。参与糖代谢的基因https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.09.0162095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)。可在ScienceDirect上获得目录列表工程杂志首页:www.elsevier.com/locate/engY. Zhao,C.张丽Yu等人工程17(2022)170171蛋白水解系统和胆盐水解被证明是乳酸杆菌菌株适应的特定生境的原因,例如人类肠道或乳制品[9]。到目前为止,研究主要集中在L。 plantarum [10],L. reuteri[11],L. rhamnosus [12]和L. casei [13],目前的证据表明,这些物种与其栖息地共同进化,如宿主物种[14]。然而,据我们所知,研究主要集中在L。发酵菌株非常有限。 对203株L.根据11个管家基因片段的序列分析,表明L.fermentum与L. 从同一地点的食物来源中分离发酵菌[15]。典型地,L.在发酵产物中发现了发酵菌,但它也是人类肠道中的一般共生体[16]。地理位置、性别、种族和宿主年龄对L. 发酵菌株需要进一步研究。越来越多的研究表明L. fermen,fermenTum可以对其宿主的健康产生积极影响[17,18]。已证明其可拮抗致病菌[19]和减轻酒精性肝病[20]、心血管疾病[21]和结肠炎[22]。L.2013年,美国食品和药物管理局(FDA)将其列为“公认安全”(GRAS)生物。动物模型的实验证据表明,L。 通过影响促炎性细胞因子的产生和抑制核因子κ B(NF-κ B)的活化,发酵菌在溃疡性结肠炎(UC)的改善中起关键作用[23]。L.在患有葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎的小鼠中,发酵菌CECT 5716显示触发肠内容物中SCFA的正常浓度的恢复并逆转微生物群生态失调[24]。相反,另一项研究报道,致病性L。从一名81岁胆囊炎男性患者的胆囊造口术吸出物和厌氧血培养物中分离出一株发酵菌[25]。Anderson等人[26日]也指示的人类口服隔离L. fermentumAGR 1487可通过增加炎性细胞(巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞)、诱导结肠髓过氧化物酶和血浆血清淀粉样蛋白A以及激活Toll样受体信号传导而在无菌大鼠中引起促炎反应这些研究表明,L。发酵是菌株特异性的。缺乏负责胆盐水解酶(BSH)活性的胆酰甘氨酸水解酶基因(BT2086)的多形拟杆菌突变体可以降低小鼠的肝脏和血浆脂质水平[27],缺乏用于合成分支SCFA的基因的生孢梭菌突变体可以在体内上调IgA相关的免疫细胞[28]。其他研究表明,bsh基因(编码胆盐水解酶)负责L。发酵菌[29]。发现编码罗伊氏素的pdu-cbi- cob(pdu,丙二醇脱氢酶基因; cbi,钴氨酰胺生物合成基因;cob,钴胺素生物合成基因)基因簇,并且钴胺素被证明有助于L.reuteri JCM 1112 [3].由于这些报道证实了乳杆菌属的功能之间的紧密关联。以及它的一些基因,即对L. 需要进一步研究抗炎性疾病的 发酵菌株。在这项工作中,105 L。从中国人类受试者的粪便样品中分离发酵菌株,并获得这些菌株的基因组草图序列。该研究的目的是为了评估是否发生在L.对不同地理区域、不同生理特性的菌株进行了比较,以揭示L.本发明的目的在于比较来自系统发生树不同分支的发酵菌株对DSS诱导的小鼠结肠炎的影响,并鉴定可能负责这些菌株提供的各种水平的抗炎保护的功能基因。2. 材料和方法2.1. 化学品和试剂DSS(36 - 50 kDa; MP Biomedicals,USA),粪便快速DNA离心试 剂 盒 ( MP Biomedicals , USA ) , TRIzol 试 剂 ( Invitrogen ,USA),QIA-快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN,德国),BCA蛋白测定 试剂 盒 (Beyotime Biotechnology, 中国 ) , RIPA 裂 解缓 冲 液(Beyotime Biotechnology,中国),超纯RNA试剂盒(CWBIO,中国)、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物I(MedChem-Express,USA),RevertAid第一链互补DNA(cDNA)合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific,USA),iTaq TM通用SYBR®绿色超级混合物(Bio-Rad,USA),用于白细胞介素(IL)-10、IL-6、IL-4、IL-1 b和肿瘤坏死因子(TNF)-α的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒 ( R D Systems , USA ) 、 抗 NF-κ B p65 和 抗 NF-κ B p65(Abcam,UK),山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗体(GenScript,China)、山羊抗小鼠IgG抗体(HL)(GenScript)和b-肌动蛋白抗体(GenScript,China)、乳酸酶联免疫吸附测定试剂盒(MLBio,China)。&&2.2. L.发酵菌株和生长条件L.通过我们实验室开发的改良LAMVAB(含万古霉素和溴甲酚绿的Lac-厌氧Man-Rogosa-Sharpe(MRS))培养基[30]分离发酵菌株(附录A中的表S1)。从中国11个省(安徽、福建、湖南、甘肃、广东、广西、江苏、江西、青海、山东、四川)、新疆自治区、宁夏自治区、内蒙古自治区、上海市和重庆市的人群粪便中共分离出105株菌株(附录A表S2)。在体外实验中,L. 在MRS琼脂上在37 °C下孵育发酵菌株18-24小时。在动物实验中,L.将悬浮于生理盐水中的5 ×109菌落形成单位(CFU·mL-1)的发酵菌株调整为每只小鼠灌胃100lL。2.3. 比较基因组分析和系统发育分析。fermentum109个L.使用PGAP v1.2.1进行泛基因组分析,并使用Python进行平均核苷酸同一性(ANI)分析。使用Glimmer v3.02预测蛋白质编码序列(CDS)。利用OrthoMCL v1.4生成了直向同源基因,并基于所有L的核心基因构建了最大似然树。发酵菌株和11个管家基因[15]。为了鉴定菌株功能基因的差异,对碳水化合物活性酶(CAZy)数据库中注释的全长CAZyme蛋白和邻苯二甲酸酯组簇(COG)蛋白数据库中的蛋白对基因组进行BLAST[31]。2.4. 动物和实验设计涉及动物的所有程序均由中国江南大学伦理委员会(JN.No.20180615b0950901(164))。BALB/c小鼠(雄性,8周龄,上海斯莱克实验动物有限公司,有限公司、中国)用于我们的体外实验,每组包括10只小鼠。在实验前使小鼠适应一周。正常组给予正常饮用水,其他组给予含4%DSS(w/v)的水,连续10天。在Y. Zhao,C.张丽Yu等人工程17(2022)170172-×····正常对照组和DSS组,每只小鼠每天口服100μL生理盐水 在四个DSS+L。 发酵组,小鼠接受100μLL. 发酵菌悬液(浓度为5 × 10 9CFU mL-1)经口灌胃给药[32]。在治疗期间,每天评估体重和血便。实验结束时,向小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液并实施安乐死[33]。记录结肠的长度,部分结肠用于组织学观察,剩余部分储存在80 °C。小鼠疾病活动指数(DAI)根据先前的研究进行评估[34]。2.5. 组织学评估如前所述,基于苏木精-伊红(HE)染色对结肠远端切片进行组织学评估由两名研究人员根据炎性浸润、杯状细胞损失和粘膜增生评估组织学评分,这两名研究人员对每个切片的细节不知情。2.6. ELISA和免疫印迹使用ELISA试剂盒(RD Systems,USA)测量小鼠结肠中IL-4、IL-6、IL-1b、TNF-α和IL-10的浓度如前所述[36],通过蛋白质印迹分析测定小鼠结肠中总p65和磷酸化p65(p-p65)的表达。使用AlphaView软件v3.4.0.0可视化蛋白质表达2.7. 小鼠结肠紧密连接蛋白的基因表达使用超纯RNA试剂盒(CWBIO,中国)提取小鼠结肠中的总RNA,并 使 用 RevertAid 第 一 链 cDNA 合 成 试 剂 盒 ( Thermo FisherScientific,美国)合成互补DNA。通过实时定量聚合酶链反应(qPCR)评价闭合蛋白、闭合蛋白-1、闭合小带(ZO)-1和ZO-2的基因表达浓度[37]。引物序列信息见表1。2.8. SCFAs分析如前所述,通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)测定结肠内容物中SCFA(乙酸、丙酸、戊酸、丁酸和异丁酸)的浓度[38]。2.9. 小鼠肠道微生物组使用粪便快速DNA离心试剂盒(MP Biomedicals,USA)提取粪便样 本中的细 菌DNA ,并 按照先前 的报道进 行16 S 核糖 体RNA(rRNA)基因序列(V3-V4区)的扩增通过Illumina MiSeq平台对DNA扩增子进行测序,并使用UCLUST v11聚类成具有97%相似性的操作分类单位(OTU)。表1用于qPCR的引物。基因前锋(50反向(50ZO-1CTTCTCTTGCTGGCCCTAAACTGGCTTCACTTGAGGTTTCTGZO-2AACGGATGCTGGAAGTTAATTCTGCTTGCTGTCTCTCAACAOccludinCACACTTGCTTGGGACAGAGTAGCCATAGCCTCCATAGCCClaudin-1GATGTGGATGGCTGTCATTGCCTGGCCAAATTCATACCTGb-肌动蛋白GGCTGTATTCCCCTCCATCGCCAGTTGGTAACAATGCCATGT2.10. 种特异性qPCR检测L.为了检测来自小鼠的粪便样品中的发酵菌菌株,使用物种特异性qPCR方法[40]。通常采用标准曲线来反映循环阈值(Ct)与细胞计数的相互作用。发酵菌称取每只小鼠的粪便样品共计0.04 g,并按照第2.9节[41]所述提取粪便DNA。2.11. L.抗性发酵菌株对胃肠道环境的影响L.发酵菌株的酸和胆盐的研究[42]。收获细菌培养溶液(6000转/分钟(rpm),2分钟)并用无菌盐水溶液洗涤。将细胞团暴露于模拟胃液(3g L-1胃蛋白酶的无菌盐水溶液,pH 3.0)中3 h,随后暴露于模拟小肠液(胰蛋白酶(1g L-1)和胆汁盐(3g L-1)的无菌盐水溶液,pH 8.0)中4 h。在0、3和7 h测定活菌2.12. 乳酸菌的乳酸生产。体外发酵如所述测定乳酸盐产生的定量[43]。L.使用MRS肉汤在37 °C下预培养两次发酵菌株48小时。通过乳酸酶联免疫吸附试剂盒(MLBio,中国)定量测定上清液中乳酸的浓度。2.13. 统计所有数据均描述为平均值±平均值标准误差(SEM)。DAI值和小鼠体重的差异分析采用单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett使用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey检验(P 0.05、P 0.01和P 0.001)分析其他生物标志物的差异分析本研究中的统计分析使用GraphPadPrism v6.0进行。3. 结果3.1. L.的遗传多样性和进化。发酵乳杆菌菌株介绍了105 L. 从健康中国受试者(41名男性,62名女性,2名未知;年龄0 -100岁)的人粪便样品中分离的发酵菌株见图10。 1(a)和附录A表S2。以3872、CECT 5716、IFO 3956和VRI 003四个附加型菌株为例,对L. 发酵菌大约是2.0 Mbp(G + C含量为50.56%~ 52.50%)。全基因组分析表明,109个L基因有11579个基因家族.发酵菌基因组和泛基因组曲线随着基因组数量的增加而急剧增加。相反,随着基因组数量的增加,核心基因的数量逐渐减少,109个基因组中有1179个核心基因(图1(b))。任何两个基因组共享的同源区域之间的全基因组ANI值通常大于97%(附录A图S1)。109 L。 发酵菌株共有1303个直向同源基因(图1(c))。系统发育分析。基于11个管家基因的发酵菌株用代表几个因素的不同形状和颜色注释,包括地理位置、性别、种族和年龄。L.具有共同特征的发酵菌株没有聚在一起,这表明L.发酵菌株和地理位置,性别,种族和年龄Y. Zhao,C.张丽Yu等人工程17(2022)170173图1.一、 对L. 从中国部分地区人群粪便样品中分离的发酵乳杆菌菌株:(a)从不同地区分离的菌株数量;(b)泛基因组和核心基因组(曲线代表泛基因组和核心基因组相对于基因组数量绘制的曲线)。(c)核心基因之间共享的同源簇的维恩图(外环中的数字表示每个菌株中特定基因的计数)。主持人(图) 2(a)和(b))。 基于1303个核心基因的系统发育分析表明,109株L. 发酵乳杆菌可分为3个分支,没有单一的选择压力因子显著影响其进化。 发酵菌株(图2(c))。三湖发酵菌株(FWXBH115、FGDLZR 121和FXJCJ 61,在图1A和1B中分别缩写为WX115、GD 121和XC 61)。1和2)和模式菌株L. 选择发酵菌CECT 5716(在图2(c)中用黑枫叶标记)来研究它们对BALB/c小鼠中DSS诱导的结肠炎的作用。3.2. L的影响。发酵物补充对DSS处理的小鼠的体重、DAI值和结肠组织病理学的DSS治疗诱导了体重减轻(图3(a))、明显腹泻和直肠出血等症状。DSS治疗还显著提高了DAI评分(图3(b))并缩短了结肠(图3(b))。 3(c))。 灌胃L. fermentumFXJCJ 61和模式菌株L. Fermentum CECT 5716显著减轻了这些症状。与L. fermentum CECT 5716,L. FWXBH115和FGDLZR 121对DSS诱导的小鼠症状几乎没有影响。在 DSS 组 中 观 察 到 隐 窝 数 量 减 少 和 炎 性 细 胞 显 著 浸 润 ( 图 3(e))。治疗L. fermentum FXJCJ61和模式菌株L.发酵菌株CECT5716显著减轻了DSS处理的小鼠中的这些病理损伤,而其他两种菌株未能提供类似的保护(图1B)。 3(f))。3.3. L的影响。发酵补充对DSS处理小鼠结肠中炎性细胞因子和NF-κB信号传导的影响与DSS组相比,L.发酵菌FXJCJ 61和CECT 5716的补充显著降低了结肠TNF-α的浓度,但不影响IL-6、IL-4和IL-1b的浓度(图1A)。4). 与模式菌株L. fermentumY. Zhao,C.张丽Yu等人工程17(2022)170174图二、系 统 发育分析。(a)基于11个管家基因的最大似然树(用各种形状和颜色注释的每个标记对应于某些特征;在树的分支中标记自举置信值; I、II和III代表三个独立的系统发育进化枝);(b)关于11个管家基因的信息;以及(c)来自109个菌株的1303个核心基因的最大似然遗传学。ATP:三磷酸腺苷; UTP:三磷酸尿苷; CTP:三磷酸胞苷。CECT5716,L. FWXBH 115和FGDLZR 121对TNF-α和IL-1b无调节作用,但增加结肠IL-6浓度。四种L.发酵菌株引发了表达的快速上调,抗炎细胞因子,如IL-10,与DSS组相比(图 4(d))。DSS治疗后结肠组织中p-p65的表达较正常组显著增加。与DSS组相比,L. fermentum FXJCJ 61和模式菌株L.发酵菌CECT 5716显著降低DSS处理的小鼠结肠中的p-p65水平。然而,L. fermentum FWXBH115和L.发酵菌FGDLZR 121对DSS处理的小鼠中p-p65蛋白的表达没有明显的影响(图1A和1B)。4(f)和(h))。3.4. L的影响。在DSS处理的小鼠L. 在DSS诱导的结肠炎小鼠中,补充发酵培养基对SCFA浓度的影响示于图1B。 五、与正常组相比,DSSL.与 65lgL-1 MRS)。L. MRS发酵液中乳酸含量最高可达75 lg L-1MRS。发酵菌FXJCJ61。Y. Zhao,C.张丽Yu等人工程17(2022)170177见图6。L的影响。在DSS处理的小鼠(n = 8)的结肠中,观察发酵培养基补充对四种紧密连接蛋白(a)ZO-1、(b)ZO-2、(c)密蛋白-1和(d)闭合蛋白的mRNA表达的影响。所有数据均表示为平均值± SEM。4. 讨论本研究分析了109个白肋金龟子群体的遗传结构和遗传规律。基于1303个核心基因和11个管家基因片段,对105个分离自中国人群粪便样品的发酵菌株(和4个从NCBI下载的参考菌株)进行了分析。系统发育分析表明,L. 发酵菌谱系与粪便供体的地理位置、性别、年龄或种族无关。来自不同地理位置的样本数量不相等可能是导致结果偏差的原因,因为来自同一地区(如江苏、广东或新疆)的样本在系统发育树中没有明显的聚类趋势本文报道了该菌的遗传结构和遗传分析。罗伊氏菌株Oh et al. [14]表明L. 虽然不同宿主的样本数不相等(人(n = 35)、小鼠(n = 35)、大鼠(n = 26)、猪(n =41)、鸡(n = 26)),但罗伊氏谱系对不同的宿主物种具有适应性(n= 26)和火鸡(n= 5))。 这与先前的一份报告一致,该报告指出,L.从食物来源分离的发酵菌株没有表现出与地理位置或食物类型的共同进化趋势[15]。以前的研究表明,只有少量的肠道微生物(如幽门螺杆菌,L。n.罗伊特湖johnsonii和L.嗜酸乳杆菌)与它们的宿主平行进化,而其他(例如,L. [医]植物casei和L. [44]没有人知道[45]。我们的结果表明,所有这些分离株都是明确的分类-可分为三个子类型。 系统发育和功能分析先前揭示,属于不同系统发育进化枝的乳杆菌物种表现出不同类型的代谢、生态位和生活方式[46]。遗传差异已被证明与菌株的某些特征相关,并导致不同的表型[31]。例如,对来自人类和其他哺乳动物肠道微生物的39种嗜粘蛋白阿克曼氏菌菌株的系统发育分析表明,基因组可归属于三个嗜粘蛋白组,其中两个嗜粘蛋白组与其宿主的肥胖相关[47]。Albertman等人[48]阐明了A. 作为假设蛋白的muciniphila是一种外膜纤毛样蛋白,其可以通过激活Toll样受体(TLR)2和TLR 4诱导IL-8、IL-1b、IL-6和IL- 10的产生来调节免疫和代谢反应。在本研究中,L. FWXBH115、FGDLZR121和FXJCJ61在1303个核心基因中分布于不同的进化分支,并随机选择用于DSS诱导的结肠炎小鼠模型的进一步研究。口服L. FXJCJ61和CECT 5716对DSS诱导的小鼠肠道炎症表现出保护作用,其形式为降低疾病活动性评分、减轻组织病理学症状(图3)、调节相关炎症因子和抑制NF-κ B的表达(图4)。有趣的是,L.在基于核心基因的分支图中属于相同进化分支的发酵菌株FXJCJ61和CECT 5716对DSS诱导的结肠炎具有相似的保护作用,但这两种菌株在基于11个管家基因的最大似然树中没有聚类(图1B)。2)的情况。这可能是由于更多的Y. Zhao,C.张丽Yu等人工程17(2022)170178图7.第一次会议。L 的 影响。( a)Shannon多样性指数;(b)肠道微生物群的PCA;(c)微生物组成柱状图(Lefse分析);(d)L.在DSS处理的小鼠中,发酵菌对属水平的粪便微生物群结构(拟杆菌属和乳杆菌属)的影响。* 表示显著差异(*P 0.05、**P 0.01和 *P0.001); ns:不显著。基于整个核心基因的系统发育分析已经指出,结肠炎小鼠中促炎细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1b和IL-4)的减少可能是UC治疗的合理目标[49]。为此,L。发酵菌FXJCJ61和CECT 5716显著降低了促炎细胞因子(TNF-α)的浓度并增加了抗炎细胞因子(IL-10)的浓度(图4)。发现T细胞衍生的细胞因子如干扰素γ(IFN-c)和TNF-α上调肠上皮TLR 4表达、介导上皮细胞死亡并与炎性肠病(IBD)结肠炎中的免疫病理学相关[50]。另一份报告指出,下调活化T细胞核因子的易位和转录活性可阻断TNF-α的产生,这可能是治疗肠道疾病的一种治疗方法[51]。此外,由T细胞、树突细胞、巨噬细胞和B细胞产生的IL-10已显示在免疫调节过程中抑制TNF-α的表达[52]。研究表明,NF-κB在上皮细胞中的持续激活可促进炎症的发生发展,TNF-α可激活NF-κB通路[53]第53段。这可能表明,这些菌株也可能对一系列炎症性疾病发挥潜在作用。在我们的工作中,L。发酵菌株FXJCJ 61和CECT 5716处理组显示NF-κ B表达下调(图4),这可以部分解释这些菌株在缓解DSS诱导的结肠炎中的调节机制。把上面提到的都考虑进去, 体内 生物指示剂,L. FXJCJ61和CECT 5716比其他测试菌株能更显著地减少DSS诱导的结肠炎。这些发现有助于这些菌株在未来的临床应用。 我们的研究结果显示了L. FXJCJ61在结肠炎治疗中的应用比较基因组分析已成为探索基因的特定功能的常规方法,例如编码细菌的转运蛋白和分解代谢酶的基因[54]。对从14名尿路感染妇女队列中分离的43株尿路致病性大肠杆菌菌株进行比较基因组分析,结果显示,系统发育树显示了不同的致病性[55]。在我们的工作中,我们比较了L。FXJCJ 61和CECT 5716,两株具有显著抗炎作用的菌株Y. Zhao,C.张丽Yu等人工程17(2022)170179见图8。比较基因组分析L.(a)FWXBH 115、FGDLZR 121、FXJCJ 61和CECT 5716之间的核心、分布和唯一基因数的Venn图;(b)FWXBH 115、FGDLZR 121、FXJCJ 61和CECT5716的基因组信息(CDS:编码序列; rRNA:核糖体RNA; tRNA:转移RNA; CRISPR:成簇的规则间隔短回文重复序列);(c)基于COG数据库的功能注释;(d)FWXBH 115、FGDLZR 121、FXJCJ 61的功能注释,和CECT 5716(显示了所有三种测序菌株和CECT 5716的与COG功能类别相关的基因数目);和(e)COG仅包含在FXJCJ61和CECT 5716中的类别Y. Zhao,C.张丽Yu等人工程17(2022)170180表2L.的定性检测 在小鼠粪便样品中的发酵菌(n = 5)。组Lg(CFU·g-1粪便)a组Lg(CFU·g-1粪便)a组Lg(CFU·g-1粪便)a正常< 6.3FWXBH115<第6.3款FXJCJ618.435 ± 0.034< 6.3<第6.3款8.122 ± 0.034< 6.3<第6.3款8.386 ± 0.033< 6.3<第6.3款8.992 ± 0.071< 6.3<第6.3款9.012 ± 0.099DSS< 6.3FGDLZR 121<第6.3款CECT5716<第6.3款< 6.3<第6.3款<第6.3款< 6.38.547 ± 0.0218.308 ± 0.031< 6.38.317 ± 0.0258.846 ± 0.036< 6.38.267 ± 0.0738.621 ± 0.049a低于检测限的值表示为6.3,其他数据表示为平均值± SEM。表3存活率。 发酵菌株在模拟胃液和模拟小肠液中培养a.菌株对照(0 h)模拟胃液(pH 4,3 h)模拟小肠液(pH 8,4 h)(Lg(CFU·mL-1))活细胞计数(Lg(CFU·mL-1))存活率(%)活细胞计数(Lg(CFU·mL-1))存活率(%)FWXBH115 9.21 ± 0.039.14± 085.33 ± 3.717.99 0.02 ±7.00± 0.57dcFGDLZR 1219.17 ± 0.129.12± 0.1187.67 ± 4.168.11± 0.0310.00 ± 1.53天FXJCJ618.96 ± 0.028.96 0.02 ±98.33 ± 3.518.34 0.02 ±24.33 ± 2.33bCECT 57169.45 ± 09.41 0.02 ±91.67 ± 7.027.9 0.06 ±3.33± 0.33ca所有数据均以平均值± SEM表示。上标字母b、c和d表示不同组之间P0.05时的统计学显著性差异(单因素ANOVA和Tukey每个处理包括一式两份样品,并将实验重复三次。见图9。L.乳酸产生的定量。体外发酵。上标字母a、b和c表示不同组之间P值小于0.05时的统计学显著性差异(单因素ANOVA和Tukey检验)。每个处理包括一式两份样品,并将实验重复三次。所有数据描述为平均值土SEM。能力,与两个非活性菌株,L. FWXBH115和FGDLZR 121。 如图8 , 有 11 个特 异 基 因 仅存 在 于 L. fermentum FXJCJ 61 和 CECT5716。这些特定的基因进行了表征,并分配到特定的途径。首先,分析了与SCFAs和乳酸产生相关的三个基因。β-木糖苷酶(COG3507)是生产单体木糖的主要酶,Yang等人[56]表明,喂食纤维低聚木糖的小鼠粪便SCFA产量增加。乙醇脱氢酶(COG1454)和乙醛脱氢酶(ALDH)参与乙醇代谢为乙酸[57]。支持这些分析,我们的工作表明,L。发酵菌FXJCJ61和CECT 5716可以有效地触发小鼠结肠中SCFA正常浓度的恢复(图5)。由于SCFA也可能在调节宿主代谢和降低癌症和糖尿病风险方面发挥关键作用[58,59],L.fermen,fermentumFXJCJ 61和CECT 5716预期对这些疾病表现出保护作用。从机制上讲,细菌发酵产生的SCFA显示通过增加分化簇4阳性(CD4+)T细胞频率和数量以及IL-10表达来调节肠道炎症[60]。丁酸盐、乙酸盐和丙酸盐已被证明能够通过增加紧密连接和降低肠上皮通透性来保护肠上皮免受炎症损伤[61在我们的实验中,L.与DSS诱导的结肠炎小鼠的水平相比,发酵菌FXJCJ 61和CECT5716增加了闭合蛋白,闭合蛋白-1和ZO-1 mRNA的表达,这可能与结肠炎小鼠的能力相关。以增加SCFAs的产生(图6)。
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