胃癌发生发展的生物信息学综合分析及差异表达基因和microRNA分析

医学信息学解锁25（2021）100630生物信息学综合分析揭示胃癌发生发展的Homa Akhavana，Sina Ramezani b，Zinat Shams c，Saied Hosseini-Asla，*a伊朗Ardabil，Ardabil医科大学消化疾病研究中心基因组学研究部b伊朗拉什特吉兰大学生物系c伊朗德黑兰哈拉兹米大学生物科学系A R T I C L EI N FO保留字：胃癌GC差异表达基因生物信息学分析差异表达基因microRNAA B S T R A C T胃癌（Gastric cancer，GC）是世界上第三大恶性肿瘤，但其发病机制尚不清楚。本研究旨在通过全面的生物信息学分析，为GC肿瘤发生提供新的见解，并为患者的临床管理确定潜在的关键基因。下载mRNA（GSE26942、GSE 66229和GSE 54129）和miRNA（GSE 26595）微阵列数据集，并使用R软件获得差异表达基因（DEG）和差异表达miRNA（DEmiR）。应用FunRich数据库分析DEGs的功能和富集途径。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络使用STRING进行评估，并通过Cytoscape软件进行可视化。验证了关键基因的价值。有516个DEG在三个表达谱数据集中重叠，并预测了DEmiR的靶点。DEG主要富集在与细胞凋亡和调节核碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢相关的生物过程中。通路分析显示DEG在P53信号通路、肿瘤通路、PI 3 K-AKT信号通路、小细胞肺癌、肿瘤中的MicroRNA和凋亡中富集。我们鉴定了5个基因（CEMIP，CLDN1，SERPINE1，PMEPA1和LIFR），这在所有三个数据集中是常见的，并预测了DEmiR的靶点，在预测总体生存率方面具有良好的性能。此外，我们构建了miRNA-mRNAs网络，揭示了参与GC发生和发展的miRNAs和基因，包括hsa-miR-421、hsa-miR-193 a-3 p、hsa-miR-576- 5 p、hsa-miR-1246、CTC 1、RGMB、E2 F6、IGF 1、JARID 2和PHKA1。本研究的发现提高了对GC分子机制以及已鉴定的DEmiRs在GC中的作用的理解通过与DEG的相互作用，可以为GC的诊断和治疗提供潜在的靶点1. 介绍胃癌（GC）是世界范围内的主要恶性肿瘤之一，是第五大（5.7%）最常诊断的癌症和第三大（8.2%）癌症相关死亡原因[1]。2020年，胃癌确诊人数超过100万人，死亡人数约769，000人[2]。虽然近年来已经取得了显着的进展，目前的标准治疗晚期胃癌患者仍然不令人满意。晚期乳腺癌的5年生存率胃癌根治术联合化疗后胃癌发生率为20[3、4]。由于胃癌早期症状少，诊断往往被延误，部分患者仍有不寻常的全身复发模式[5]。目前，最常见的基于血清的肿瘤生物标志物为早期 检测 的 GC， 包括 酶原 和甲胎蛋白（AFP）、糖类抗原（CA）、CA 19 -9、CA 24 -2、CA 72 -4、CA 50、CA 125、癌胚抗原（CEA）等，但敏感性和特异性均较差。因此对于确定可用于诊断GC和预测复发的分子机制和生物标志物至关重要。高通量微阵列技术的最新进展可用于揭示人类疾病的分子机制。主要的公共数据库，如基因表达综合数据库（GEO）和癌症基因组图谱（TCGA）是功能强大的公共数据库 使用 找到 和 分析 差异表达基因（DEG）对应于各种癌症的致癌和进展[6基因表达谱分析结合生物信息学分析已被用来鉴定DEG和信号通路与人类肿瘤发生和肿瘤分级相关的* 通讯作者。电子邮件地址：saied. arums.ac.ir（S.Hosseini-Asl）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100630接收日期：2021年4月19日;接收日期：2021年5月27日;接受日期：2021年5月在线预订2021年2352-9148/© 2021作者。出版社：Elsevier Ltd这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：www.elsevier.com/locate/imuH. Akhavan等人医学信息学解锁25（2021）1006302=GC [7]. Yong等人利用GEO、Oncomine和其他数据库检查了PPP2CA在结直肠癌中的表达，并表明PPP2CA具有致癌基因作用，可用作结直肠癌进展中的预后生物标志物[10]。Wang等人通过生物信息学分析和体外实验证实SERPINH1是参与GC发育调控的核心基因，并促进GC细胞的迁移、细胞周期和增殖[11]。Liu等人使用GEO，生物信息学分析，以检查与GC的侵袭和转移相关的DEG。之后，分析GC组织以验证生物信息学结果，即高水平的BGN表达与GC临床病理特征相关，包括微血管癌栓、淋巴结转移和血管浸润[12]。microRNAs（miRNAs）是一大类小的非编码RNA，~22个核苷酸，通过与靶mRNA的3′非翻译区（3′UTR）结合，导致基因表达的转录后抑制，作为基因表达的关键调节因子 [13，14]。据报道，差异表达的miRNA（DEmiR）与多种肿瘤类型的发生和进展相关，例如GC [15]，例如，对GC的研究揭示了miR-106 a和miR-17的一个成员在GC中的上调 [16]。尽管对DEGs和DEmiRs的研究已经进行了很多，并报道了它们在分子功能、生物学过程和不同途径中的一些功能，但DEGs和microRNA如何通过分子途径相互作用仍存在疑问。因此，分析DEG和DEmiR，阐明它们之间的相互作用网络对于理解GC的病因和发病机制的分子机制为了预测和治疗的目的进行进一步的研究。在本研究中，我们通过分析三个GC mRNA微阵列数据集和一个microRNA数据集来鉴定差异表达的基因和microRNA。本研究的目的是通过生物信息学分析来区分胃癌的关键基因和miRNAs，寻找新的胃癌诊断、治疗的分子标志物2. 材料和方法2.1. 微阵列数据从GEO数据库下载三个基因表达数据集（GSE 26942、GSE 66229和GSE 54129）和一个miRNA表达数据集（GSE 26595）[17，18]。GSE26942数据集包括205个GC和12个正常胃组织样本mRNA表达数据集;GSE 66229包括300个GC组织和100个非癌组织样本mRNA表达数据集;GSE 54129包括111个GC和21个正常胃组织样本mRNA表达数据集，GSE26595包括60个GC组织和8个非癌组织。2.2. DE-microRNA和DEG使用R软件（版本3.5.1，www.r-project.org/）处理所有数据，并应用LIMMA包（用于微阵列数据的线性模型）来鉴定GC组织样品和对照样品之间的DEmiR和DEG为了检测DEmiR，p值<在筛选中获得0.01和logFC>1的截断标准。对于DEG，阈值为P值0.05和logFC> 0.01。<2.3. 差异表达miRNAsMultiMiR软件包（http://multimir.ucdenver.edu/）用于预测miRNA的靶标[19]。使用MultiMiR软件包通过miRTarBase、TarBase和miRcode预测miRNAs的靶基因，仅选择在所有三个数据库中预测的靶基因进行以下分析。应用维恩图（Venn diagram）获得miRNA-靶标关系，并与微阵列分析，以确定DEmiR和DEG之间的相互作用2.4. 功能富集分析FunRich（http://funrich.org/faq），这是一种用于预测所选靶基因的分子功能、生物学过程、细胞组分和途径的分析工具[20]。 统计截止值FunRich软件中的富集分析照常设置为0.05，研究中的缺省量2.5. 蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络是使用 搜索工具 相互作用基因的检索和 蛋白（STRING）数据库（https://string-db.org）[21]，然后使用Cytoscape软件[22]进行可视化。应用分子复合物检测（MCODE）插件从PPI网络中筛选中心基因的模块，其中度截止=2，最大。深度=100，k-核心=2，节点评分截止值=0.2 [23]。2.6. 关键基因基因表 达谱交互 分析（ Gene E X pression Profiling InteractiveAnalysis，GEPIA）是专门用于分析RNA-seq数据的网络服务器，其用于基于来自TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer. gov/）。GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn）和Kaplan-Meier迭代法（KM迭代法）工具（http://kmplot.com/analysis/index.php? pbackground）用于验证关键基因在GC进展中的作用以及正常胃和GC样品中的转录水平，以预测关键基因在GC患者中的预后价值[24，25]。2.7. 预测miRNA-mRNAs网络的构建利用MultiMiR软件包预测DEmiR的靶基因。利用CytoHubba软件包构建预测miRNA-mRNAs的调控网络，找出调控程度最高的前10个mRNA和miRNAs。3. 结果3.1. DEG和DEmiR共鉴定了15种DEmiR，其中与非癌性胃组织相比，9种miRNA在GC组织中显著上调，6种miRNA在GC组织中显著下调（表1）。在通过miRTarBase、TarBase和miRcode数据库搜索后，预测DEmiR的总共1716个靶基因。鉴定了DEmiR与所选DEG的重叠靶标，并构建了VennDiagram以显示这些重叠基因（图1），详情见补充资料。在三个数据集（GSE 26942、GSE 66229和GSE 54129）中的至少一个数据集和DEmiR的预测靶标中的516个常见DEG中，包括4个上调基因（CEMIP、CLDN1、SERPINE1和PMEPA 1）和一个下调基因（LIFR）的5个基因在所有三个数据集和DEmiR的预测靶标中是常见的。我们确定hsa-miR-421和hsa-miR-193 a-3 p是靶向这5个基因的主要DEmiR。此外，在三个数据集中，获得了57个未被预测为DEmiR靶点的常见DEG。火山图见补充图S1。3.2. 鉴定的靶基因的功能和途径富集分析为了进一步了解GO的功能和机制，将DEG导入在线富集分析工具FunRich中，对GO进行H. Akhavan等人医学信息学解锁25（2021）1006303==表1与正常胃组织相比，胃癌组织中miRNAs表达显著上调和下调。8.12E-5763.3. 副部长的PPI网络和模块分析采用STRING数据库确定516个重叠DEG之间的PPI对，并通过Cytoscape软件构建PPI网络并进行可视化。Cytoscape MCODE应用于PPI网络内的屏幕模块。从Cytoscape中的MCODE插件中获得了一个重要的模块，它包含28个节点和162条边（图3）。生物学通路分析显示这些基因在Trail信号通路、胰岛素通路、1类PI3K信号通路、Arf 6信号通路事件和EGF受体信号通路中显著富集。3.4. 五个关键基因验证CEMIP、CLDN1、SERPINE1、PMEPA1和hsa-miR-1246 1.7471389.95E-09hsa-miR-196b 2.0337512.13E-06-07052.22E-050.001918LIFR获自KM patient（图4）。曲线显示五个基因的过表达与GC患者总生存时间的减少显著相关。此外，使用GEPIA进行基因表达验证（图5）。结果表明，与非癌胃组织中的那些相比，CEMIP、CLDN1、SERPINE1和PMEPA1的mRNA表达水平在GC组织中显著上调，而与正常样品相比，LIFR在GC样品中下调。关键基因的表达信息见补充图S2。3.5. 预测miRNA-mRNAs网络的构建根据预测的12个DEmiRs的miRNA-mRNA关系，得到DEmiR-mRNA调控网络。DEmiR-mRNA调控网络见补充资料。 前4个miRNAs与更高度包括hsa-miR-421hsa-miR-193 a-3 p（下调，程度=125）、hsa-miR-576- 5 p（上调，程度= 101）和hsa-miR-1246（上调，程度= 236）。44）。排名前6位的基因包括CTC1、RGMB、E2F6、IGF1、JARID2和PHKA1。4. 讨论在本研究中，mRNA和miRNA表达谱整合，以评估基因（DEGs）和miRNA（DEmir）表达的变化在GC中。通过分析包含676例GC组织样本和141例正常胃组织样本的4个基因表达谱，共发现15个DEmiR（9个上调和6个下调的miRNA）和516个DEG。DEG功能富集分析的结果显示，DEG基因在细胞凋亡、核碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢调控等生物学过程中富集。研究表明，对于癌细胞增殖至关重要的合成，Fig. 1. 文氏图分析显示了三个数据集（GSE 26942、GSE 66229和GSE 54129）中失调基因的重叠和预测的miRNA靶（multiMir.结果）。不同的颜色意味着不同的数据集。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版分析和GC中的KEGG途径。在GO分析的生物过程（BP）项中，结果表明基因在细胞凋亡和核碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢的调节中显著富集（图2A）。细胞成分方面，DEG主要分布于细胞核，细胞质（图2B）。此外，细胞组分分析显示DEG富含蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（图2C）。KEGG通路分析表明，DEG主要与P53信号通路、癌症中的通路、PI 3 K-AKT信号通路、小细胞肺癌、癌症中的MicroRNA和细胞凋亡相关（图1B）。 2 D）。受肿瘤抑制因子和癌基因调控[26KEGG通路分析表明DEG参与P53信号转导信号通路、PI 3 K-AKT信号通路、小细胞肺癌、癌症中的微小RNA和细胞凋亡。P53是一种肿瘤抑制基因，并作为DNA损伤和其他细胞应激的细胞应激哨兵[30]。TP 53突变随着正常胃粘膜GC的进展而增加[31，32]。磷酸肌醇3-激酶（PI 3 K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路是许多癌症形成和进展的关键信号通路之一[33]。研究人员已经证明了PI 3K/Akt/mTOR通路在细胞生长、转移、化疗代谢抗性和存活中的促进作用[34]。更有趣的是，PIK3CA的过表达可通过PI3K1Akt信号传导的异常激活增强胃癌的转移[35]。类似地，靶向阻断该通路可通过下调MMP-2和Ki-67 的 表 达 来 抑 制 胃 癌 生 长 和 转 移 [34] 。CEMIP 、 CLDN1 、SERPINE1、PMEPA1和LIFR3个数据集的DEG之间共有基因，miRNAslogFCP.Valueadj.P.Val高度表达hsa-miR-4251.1102983.97E-1.88E-06miRNAs06hsa-miR-10a1.2422391.15E-0.00012905hsa-miR-981.2730054.58E-0.001665hsa-let-7d*1.369433053.43E-0.0006hsa-miR-4211.397872054.72E-0.008625hsa-miR-1.458824060.000185hsa-miR-135b2.3445723.24E-8.66E-05低表达miRNAs hsa-miR-2042.47754079.82E-144.03E-11hsa-miR-363-1.770336.83E-060.000175hsa-miR-29c*-1.618821.76E-1.56E-05hsa-miR-193a-3p-1.579463.57E-060.000116hsa-miR-20b-1.40715.51E-050.000868hsa-miR-193b-1.398066.12E-0.000929H. Akhavan等人医学信息学解锁25（2021）1006304图二. GO和KEGG GC中重叠DEG的分析和DEmiR的预测靶标：（A）生物过程，（B）分子功能，（C）细胞组分，和（D）KEGG途径分析。图三. 蛋白质相互作用（PPI）网络。PPI网络由28个节点和162条边组成，由重叠的 DEG构成。DEmiR的靶点，并由hsa-miR-421和hsa-miR-193 a-3 p调节。随后，生存分析的5个基因的表达和患者术后生存的关系表明，这些基因与胃癌患者的总生存率目前细胞迁移诱导蛋白（CEMIP）是一种Wnt相关蛋白，富集于肺肿瘤来源的外泌体、乳腺和脑转移外泌体中，通过产生促转移环境促进BrM [36]。CEMIP的过表达与肿瘤的不受控制的增殖和侵袭以及远处转移、分化和癌症患者的低生存率有关。CEMIP的上调还保护恶性肿瘤免受低葡萄糖和低氧的严格微环境的影响[37]。已经报道了CEMIP在各种癌细胞中的过表达，例如胃癌、肺癌、宫颈癌、肾癌和结肠直肠癌[38，39]。CLDN1是维持正常上皮细胞所必需的一种完整的细胞膜蛋白H. Akhavan等人医学信息学解锁25（2021）1006305见图4。 基于5个关键基因表达的胃癌患者的Kaplan-Meier总体生存分析(A)CEMIP，（B）CLDN1，（C）SERPINE 1，（D）PMEPA 1，(E)LIFR。特别是屏障形成、信号转导和细胞极性[40]。CLDN1的下调可导致紧密连接的破坏和与上皮细胞中肿瘤表型的发展相关的细胞间粘附的丧失[41，42]。Singh等人报道了CLDN1保护结肠癌细胞免于失巢凋亡，失巢凋亡是当细胞从细胞外基质（ECM）分离时发生的一种凋亡形式[43]。失巢凋亡是维持组织发育和稳态的重要机制。CLDN1具有作为致癌基因和肿瘤抑制基因的双重作用，并且它是各种癌症（包括胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌和乳腺癌）中卵巢[44对结肠癌和卵巢癌的一些研究已经报道了CLDN1通过激活CLDN1受体在转移过程中的作用。金属蛋白酶，增加迁移和减少细胞凋亡。胃癌中CLDN1的表达升高与转移、肿瘤侵袭、不良结局、淋巴结转移和TNM分期相关[42，50，51]。SERPINE1是通过抑制尿激酶纤溶酶原激活物（uPA）和组织纤溶酶原激活物（tPA）的主要抑制剂的uPA系统的关键调节剂[52]。SERPINE1在不同类型的肿瘤中起着至关重要的作用，不仅作为致癌基因，而且在某些癌症中作为新的预后因子，包括膀胱癌、食管癌、人黑色素瘤、细胞肺癌、口腔癌、结肠癌、直肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠癌、结肠癌、鳞状细胞癌和头颈癌[53它还研究表明，SERPINE1的下调通过激活p53信号通路对胶质瘤肿瘤细胞的表型具有肿瘤抑制作用，并在体外抑制鼻咽癌的迁移和细胞侵袭[60，61]。与正常组织相比，GC组织中的SERPINE1表达上调，SERPINE1的过表达与GC患者的不良预后和不良临床特征显著相关[62]。PMEPA 1是一种Ib型跨膜蛋白，参与转化生长因子β（TGF-β）信号通路。TGF-β是体内平衡的重要调节剂，并在肿瘤发生时抑制肿瘤进展。肿瘤发生的早期阶段[63]。TMEPAI蛋白可调节上皮组织的分化和细胞增殖，提示其在恶性肿瘤的发生发展中起重要作用。此外，在GC患者的恶性组织中已经确定了PMEPA1的显著上调，并且其较高的表达与不良预后相关[64，65]。白血病抑制因子（LIF）是一种细胞因子，参与多种疾病，包括癌症、致癌物、分化和调节细胞增殖[66]。LIF和LIFR表达与肿瘤分化、肿瘤分期、淋巴管浸润、pTNM分期、淋巴结和GC细胞转移相关[67]。已经确定靶向CREBZF的hsa-miR-421在GC的发展中可能发挥重要作用，并且该miRNA的敲低导致GC中CREBZF表达的表达增加[68]。人内皮细胞的研究显示SERPINE 1是miR-421的靶基因[69]。miR-193 a家族在许多恶性肿瘤中的失调已被报道，越来越多的证据显示其在癌症路径中的关键作用。#21472;的方式[70先前的几项研究表明，miR-193 a-3 p是一种在不同癌症中的肿瘤抑制因子，包括甲状腺癌、乳腺癌、肺癌、肝细胞癌和结肠直肠癌[73此外，研究表明，与邻近正常组织相比，胃癌中miR-193 a-5 p显著降低[79，80]。miRNA-mRNAs网络的发现这些miRNAs和mRNAs可能在胃癌的发生发展中起关键作用。已经表明，在人胃癌细胞系中上调的hsa-miR-1246可能在GC的进展中起重要作用，并且血清中的外泌体miR 1246可以作为早期诊断GC的生物标志物[81，82]。转录因子E2F家族调节H. Akhavan等人医学信息学解锁25（2021）1006306图五、使用GEPIA验证GC和胃脑组织中的mRNA表达水平CEMIP（A）、CLDN1（B）、SERPINE1（C）、PMEPA1（D）和LIFR（E）。这五个方框图基于408个GC样品（以红色标记）和211个正常样品（以灰色标记）。*P 0.05被认为具有统计学显著性。<. (For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版基因在各种细胞过程中的表达，如细胞周期控制、DNA损伤反应、分化和凋亡[83，84]。E2F家族成员E2F6的表达与男性患者良好的总生存期显著相关，可作为新的预后标志物用于提高GC的生存率和预后准确性[85，86]。胰岛素样生长因子（IGFs）可刺激分化和细胞增殖，并在癌症中具有致病作用[87具体而言，Li等人报告了GC患者血清IGF 1水平显著升高[90]。然而，尽管如此，关于hsa-miR-576- 5 p、CTC 1、RGMB、JARID 2和PHKA 1在GC中的调控机制和预后价值的研究本研究存在以下局限性，在今后的研究中应注意。 第一，缺乏实验性，临床验证其次，考虑到我们在项目的几个步骤中使用了可用的在线工具和默认选项，研究了不同背景下（如性别，年龄，肿瘤分期和吸烟习惯）确定的不适用。此外，DEG限制为logFC> 1 LogFC 1 P值0.01，DEM限制为logFC> 1 LogFC 1 P值0.0001。&&&&5. 结论在本研究中，我们鉴定了几个与胃癌发生发展密切相关的基因和miRNAs，包括CEMIP、CLDN 1、SERPINE 1、PMEPA 1、LIFR、hsa-miR-193 a-3 p和hsa-miR-193 a-3 p。miR-421此外，还需要进一步的研究来评估hsa-miR-576- 5 p、CTC 1、RGMB、JARID 2和PHKA 1对GC发病率的影响，并提高我们结果的可靠性和可重复性。这些结果为胃癌的诊断和治疗提供了重要的信息，胃癌患者竞合利益作者声明他们没有利益冲突需要披露。致谢这份手稿以前没有出版过，也没有考虑在其他地方出版作者感谢H. Akhavan等人医学信息学解锁25（2021）1006307参加过这项研究工作的人附录A. 补充数据本文的补充数据可在https：//doi网站上找到。org/10.1016/j.imu.2021.100630。引用[1] 2018年全球癌症统计数据：GLOBOCAN估计全球185个国家36种癌症的发病率和死亡率。201 8 ;68（6）：394-424。[2] 2020年全球癌症统计数据：GLOBOCAN估计全球185个国家36种癌症的发病率和死亡率。20 2 1 ;71（3）：209-49.[3] Mokadem I等，胃腺癌术前化疗和手术后复发：一项多中心研究。2019;22（6）：1263-73。[4] NashimotoA，et al.日本2002年胃癌治疗情况：2009年年度报告JGCA全国登记处。2013 ;16（1）：1-27.[5] Okines A，et al.胃癌：ESMO诊断、治疗和随访临床实践指南。2010年;21.，v5 0 -v54。[6] LiT，et al.胃癌中具有预后价值的hub基因的筛选生物信息学分析2018;16（1）：1-12。[7] Wang K等人，全基因组测序和综合分子分析确定胃癌中的新驱动突变。2014;46（6）：573-82.[8] 姜鹏，刘晓生.大数据挖掘产生了关于癌症的新见解。2015;47（2）：103-4。[9] Akbani R，et al. 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