帕金森病基础数据计划：遗传风险多巴胺能神经元的iPSC分化研究

资源帕金森病基础数据计划：实现从遗传图谱到机制的有效翻译图形摘要亮点d来自95名具有不同遗传风险的PPMI参与者的分化为DA神经元的iPSC来源于人类iPSC的DA神经元为遗传风险d数据见https://www.ppmi-info.org和www.foundinpd.org作者Elisangela Bressan，Xylena Reed，Vikas Bansal，...，Andrew B.Singleton，Peter Heutink，CornelisBlauwendraatvikas. dzne.de（V.B.），steve.gladstone.ucsf.edu（S.F.），cookson@mail.nih.gov（M.R.C.），kjensen@tgen.org（K.V.K.- J.），davidwcr@usc.edu（D.W.C.），singleta@mail.nih.gov（A.B.S.），heutinkpeter@gmail.com（P.H.），cornelis.nih.gov（C.B.）简言之Bressan等人 报告了帕金森病基础数据计划（FOUNDIN-PD）的第一个数据发布，其中包括95个诱导多能干细胞（iPSC）系的多层分子数据集，这些细胞系具有分化为多巴胺能（DA）神经元的不同遗传风险背景，多巴胺能神经元是帕金森病（PD）中主要受影响的细胞类型。Bressan等人，2023，细胞基因组学3，1002612023年3月8https://doi.org/10.1016/j.xgen.2023.100261会会开放获取资源帕金森病基础数据计划：实现从遗传图谱到机制的有效翻译埃里桑格拉·布雷桑，1，13赛琳娜·里德，2，3，13维卡斯·班萨尔，1，13，*伊丽莎白·哈钦斯，4梅勒妮·M。科布，5米歇尔G。Webb，6Eric Alsop，4Francis P. Grenn，2Anastasia Illarionova，1Natalia Savytska，1Ivo Violich，6StefanieBroeer，1Noe' mia Fernandes，1Ramiyapartan Sivakumar，6Alexandra Beilina，2Kimberley J.比林斯利，2乔斯博格豪森，2卡罗琳B。Pantazis，2，3Vanessa Pitz，2Dhairya Patel，2Kensuke Daida，2Bessie Meechoovet，4Rebecca Reiman，4Amanda Courtright-Lim，4Amber Logemann，4Jerry Antone，4Mariya Barch，5RobertKitchen，7Yan Li，8克利夫顿湖美国基因组研究中心，Patrizia Rizzu，1Dena G.2Brooke E.Hjelm，6岁迈克·纳尔斯，2，3，11J.拉斐尔吉布斯，2史蒂芬芬克拜纳，5，12，*马克R。库克森，2，14，*肯德尔范凯伦詹森，4，14，*大卫W。克雷格，6，14，*安德鲁B。辛格尔顿，2，3，14，*彼得·休丁克，1，14， * 科内利斯·布劳文德拉特2，3，14，15，*1德国神经退行性疾病中心（DZNE），德国图宾根2美国国立卫生研究院国家衰老研究所神经遗传学实验室，美国马里兰州3阿尔茨海默氏症和相关痴呆症中心4美国亚利桑那州凤凰城翻译基因组学研究所神经基因组学分部5系统和治疗中心，格拉德斯通研究所，旧金山，加利福尼亚州，美国6南加州大学凯克医学院翻译基因组学系，1450 Biggy Street，Los Angeles，CA，USA7马萨诸塞州总医院，心血管研究中心，查尔斯顿，MA，美国8蛋白质/肽测序设施，国立神经病学、疾病和中风研究所，国立卫生研究院，Bethesda，MD，美国9美国健康科学统一服务大学美国基因组中心，美国马里兰州10美国马里兰州贝塞斯达健康科学大学解剖学、生理学和遗传学系11Data Tecnica International，华盛顿特区，美国12美国加州大学旧金山分校神经学和生理学系13、作者贡献相等14资深作者15引线触点* 通信：vikas. dzne.de（V.B.），steve. gladstone.ucsf.edu（S.F.），cookson@mail.nih.gov（M.R.C.），kjensen@tgen. org（K.V.K.- J.），davidwcr@usc.edu（D.W.C.），singleta@mail.nih.gov（A.B.S.），heutinkpeter@gmail.com（P.H.），cornelis. nih.gov（C.B.）https://doi.org/10.1016/j.xgen.2023.100261总结帕金森病基础数据计划（FOUNDIN-PD）是一项国际合作，为帕金森病（PD）提供基础资源FOUNDIN-PD在一组分化为多巴胺能（DA）神经元（PD中主要受影响的细胞类型）的诱导多能干细胞（iPSC）系中生成了多层分子数据集这些细胞系来源于帕金森病进展标志物倡议研究，该研究包括携带单基因PD变体、具有中间效应的变体和通过全基因组关联研究鉴定的变体的PD参与者和未受影响的我们从iPSC衍生的DA神经元生成了遗传、表观遗传、调节、转录组和纵向细胞成像数据，以了解疾病相关遗传变异和邻近分子事件之间的分子关系这些数据表明，iPSC衍生的DA神经元为PD遗传风险建模提供了有价值的细胞背景和基础图谱。我们已经将这些数据整合到FOUNDIN-PD数据浏览器中，作为了解PD分子发病机制的资源介绍在过去的十年中，我们对帕金森病（PD）遗传结构的理解已经大大扩展。对罕见的单基因型PD和帕金森综合征的研究表明，多个基因含有致病的多基因。站 。 1 此 外 ， 在 越 来 越 大 的 样 本 量 中 ， 全 基 因 组 关 联 研 究（GWAS）的迭代应用已经确定了90种独立的PD风险变异，累积贡献了16%-2.PD的主要病理特征之一是多巴胺能（DA）神经元的进行性变性。细胞基因组学3，100261，2023年3月8日1这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。会开放获取资源2Cell Genomics3，100261，2023黑质和α-突触核蛋白聚集体的积累3此外，先前的工作已经强调PD的遗传风险可能在DA神经元中起重要作用。二、四在临床水平上，单基因和特发性PD患者的发病和进展年龄存在很大的差异，即使是携带相同损伤性变体的患者这种变化可能是由环境和遗传因素的组合引起的5因此，在本研究中，我们选择关注PD背景下的遗传风险有趣的是，GWAS确定的几个PD遗传风险因素也影响LRRK2或GBA1突变携带者的总体风险，6，7这是PD最常见的遗传原因。此外，多个GWAS提名的基因座包括涉及单基因形式的PD的基因（例如，SNCA和LRRK2），突出了单基因和散发性疾病之间的明确病因学联系。因此，了解已知遗传风险因素和突变的分子机制将为疾病风险、发病、进展和疾病修饰物的生物学提供可操作的见解。虽然近年来遗传发现的步伐急剧加快，但我们表征指定基因和风险基因座的相关功能和功能障碍的能力并没有与此相匹配。以包含罕见致病突变的基因生物学为中心的研究揭示了导致疾病的分子机制的重要见解;然而，证明GWAS识别的风险位点如何导致疾病是具有挑战性的。这在很大程度上是由于这些风险信号的复杂性以及缺乏大规模的参考数据来解释这些风险位点的分子结果。由于人类基因组的复杂结构，在解开GWAS基因座时出现了一个重要问题，这意味着由GWAS鉴定的修饰基因座和风险基因座通常指定基因组区域而不是特定基因。增加了这种复杂性，疾病的影响大小是适度的，细胞背景往往是未知的，遗传介质一般不太可能是蛋白质编码。大量的实验工作为这些变异的分子后果提供了清晰的见解，但尚未显示其他风险因素对这些分子紊乱的影响，这对于理解为什么这些风险因素的一些携带者会发生疾病而其他人则不会。在传统的细胞和动物模型中研究GWAS基因座的生物学是非常具有挑战性的，因为大的连锁不平衡（LD）块导致许多高度相关的变体。此外，通过GWAS鉴定的变体通常是非编码的，并且将这些变体与致病基因相关联是困难的。低效应量和由此产生的表型的不确定性进一步混淆了适当模型的识别。因此，大量已知和待发现的风险基因座需要替代策略来理解潜在的生物学。基于人诱导多能干细胞（iPSC）的细胞模型的开发为解决遗传风险因素的集体影响和定义用于大规模建模这些变体的相关细胞背景提供了独特的机会值得注意的是，iPSC模型不太可能能够模拟爆发性疾病的过程，这些过程可能需要数十年才能在生物体老化的背景下发展。然而，它们仍然可以用于鉴定可以在含有特定风险因子或突变的细胞中捕获的近似分子信号携带不同突变和遗传风险因素组合的帕金森氏进展标志物倡议8（PPMI;www.example.com）iPSC系的收集https://www.ppmi-info.org/虽然PPMI iPSC资源还不足以调查遗传风险和修饰因素的所有可能组合，但它可以阐明PD中主要遗传风险因素的不同组合所导致的分子后果。分子、细胞和基因组方法可以量化表观遗传、调节、转录组、蛋白质组和细胞改变，这些方法有可能为我们提供描述协调的分子和细胞变化的图谱当在来自不同遗传背景的细胞中生成这样的图谱将iPSC方法与定量分子测定相结合，可在疾病相关细胞背景下大规模评估目标基因和风险基因座，并为深入了解PD发病机制提供了前所未有的机会。为了创建这个地图集，我们成立了帕金森病基础数据计划（FOUNDIN-PD; https：//www. foundinpd.org/）上提供。在这里，我们专注于大量iPSC系的生产，使用标准化方法将其驱动为DA神经元细胞类型，从中收集了大量遗传，表观遗传，调控，转录组和细胞数据（图1）。所有iPSC系均来源于PPMI内的受试者。我们在这里描述的生产和表征的第一个版本的FOUNDIN-PD数据。我们认识到，虽然第一阶段比迄今为止在PD中进行的任何其他系统性iPSC研究都要大，但它只是一个试点。这一阶段的数据将在检查高风险效应时最直接有用。作为该资源的一部分，我们还创建了一个数据访问和分析门户，并提供证据证明该系统代表了研究PD相关风险等位基因的相关细胞背景。这代表了一个大型的多组学iPSC衍生的DA神经元数据集，它将作为一个独特的资源服务于社区。最后，我们讨论了这些数据为FOUNDIN-PD的下一阶段揭示的机遇和结果FOUNDIN-PD概述FOUNDIN-PD的基础是对所有细胞系使用一致的方法从驱动至DA神经元状态的95个iPSC细胞系产生分子读出（图1;表S1）。这些线可作为PPMI的一部分，PPMI是一项具有里程碑意义的纵向研究，收集了来自11个国家33个地点的1，400多名个体的数据 ， 并 包 含 丰 富 的 临 床 ， 成 像 和 生 物 标 志 物 数 据（https://www.ppmi-info.org/）。从PPMI iPSC收集中，我们包括来自健康对照（HC）、特发性PD（iPD）患者和携带已知疾病相关突变（单基因）的个体的细胞系。Cell Genomics3，100261，2023年3月8日3会开放获取资源图1. 帕金森病基础数据计划（FOUNDIN-PD）显示了试验类别、时间点和各试验中包含的样品数量（n）。蓝色图标代表初始数据发布中包含的检测试剂盒，浅蓝色图标代表正在进行的检测试剂盒，将在稍后阶段发布。所有供体的基因组序列数据都是可用的，因此我们不仅能够鉴定出LRRK2（p.G2019S，n =25，和p.R1441G，n = 1）、GBA1（p.G2019S，n =（p.N370S，n = 20）和SNCA（p.A53T，n = 4）（下文中，我们将这些变体分别称为LRRK 2+、GBA 1+和SNCA+），而且还包括具有高和低多基因风险评分的那些（图S1;表S1）。 这95个iPSC系使用具有微小修改的完善的方案9分化成DA神经元（图2A;protocols.iohttps://doi.org/10.17504/protocols.io）。BFPZJMP 6）10和自动化机器人细胞培养系统。11分化方案先前已建立，并用五个内部细胞系进行了验证，其中三个独立的细胞系为：接种产生的神经元富集培养物的平均值为90%TUJ1+（范围：73%免疫细胞化学法（ICC）鉴定为98%。超过60%（范围：56%-这被认为是令人满意的分化效率，因此，应用相同的方案来分化95个PPMI iPSC系。将PPMI系分五批分化（每批10至30个细胞系）直至第25或65天，随后收获细胞用于ICC和分子测定。MAP 2+和TH+细胞的定量显示，平均而言，80%会开放获取资源（图例接下页）4Cell Genomics3，100261，2023A BC D EF GH图2. 第65(A) 多巴胺能神经元分化方案的示意图(B) 左：代表性ICC图像，显示TH+（多巴胺[DA]神经元）和MAP 2+（神经元）细胞与DAPI（细胞核）共染色。比例尺：50mm。右：通过ICC检测的TH+（DA神经元）和MAP 2+细胞的百分比，并标准化为细胞核总数数据表示为每30个成像视野中阳性细胞的百分比每个点代表一个细胞系（n = 95）。会开放获取资源Cell Genomics3，100261，2023年3月8日5结果显示，在20%（范围：52%-当用两种独立的TH抗体通过ICC评估时，iPSC系中TH+细胞相对于培养物中所有细胞的平均比例是相似的，并且MAP 2+细胞相对于所有细胞的比例的估计也与所使用的MAP 2抗体无关（图S4A）。为了测量使用我们的自动化系统的分化方案的稳健性和可重现性，我们在每个批次中包括对照线作为技术重复（n = 5）。在所有五个不同批次中，使用ICC从对照细胞系获得的MAP 2+和TH+细胞的百分比是一致的（图S4B），并且在批次之间未鉴定出神经元或MAP 2+和TH+神经元的百分比的显著差异（两者均为p > 0.2）。使用RNA测序定量FOUNDIN-PD数据中的基因表达为了进一步表征iPSC衍生的神经元，我们生成了丰富的数据类型，包括遗传、表观遗传、调控、转录组和细胞成像数据（图1）。为了充分表征本研究中使用的iPSC分化方案产生的细胞类型的同一性，我们对大多数第65天细胞系进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）（n = 79，4个对照重复，占全部包括的iPSC的84%）。总共保留了416，216个高质量细胞，每个样品13平均5，015个细胞（范围：584至9，640）。首先使用无监督方法（Louvain算法）对细胞进行聚类，然后基于在聚类的差异表达基因中发现的典型细胞类型标志物进行注释（表S2;图S5）。在所有样本中鉴定了7种不同的广泛细胞类型，并定义为表达RFX4、HES 1和SLIT 2的早期神经元祖细胞13（131，251个细胞，占总数的32%）;表达DLK 1、LGALS 1和VCAN的晚期神经元祖细胞14（113，425个细胞，占总数的27%）;表达TH、ATP 1A 3、ZCCHC 12、MAP 2、SYT 1和SNAP 25的DA神经元12（96，623个细胞，占总数的23%）;表达TPH 1、SLC 18 A1、SLC 18A2和SNAP 25的未成熟DA神经元13（41，267个细胞，占总数的23%）。T0 P2 A和MKI 67的增殖底板祖细胞（PFPPs）14、15（总共18，984个，总共5%）;表达KRT 19、KRT 8和COL 17 A116的神经上皮样细胞（总共8，979个，总共2%）;和室管膜样细胞。表达MLF1、ST0ML3和FOXJ115的细胞（总共5，687个，占总数的1%）（图2C）。总体而言，TH、MAP 2和SNCA的表达在神经元细胞类型中明显富集（图2D）。接下来，我们评估了培养的DA神经元与人组织DA神经元的表达特征有多相似，以及我们培养的DA神经元如何与先前公开的DA神经元数据集进行比较我们使用稍微修改的DA神经元分化方案和一组不同的iPSC细胞系，将我们鉴定的细胞类型群体与来自人死后黑质12和人iPSC衍生的DA神经元亚型的13在我们的数据中鉴定的DA神经元群体显示出与在人死后黑质中发现的TH+神经元簇的最高相关性（Spearman还使用来自本研究的DA神经元和来自人死后黑质的TH+神经元的树状图聚类来鉴定这种相关性（图S6A和S6 B）。在我们的未成熟DA神经元和Agarwal等人的TH+神经元簇之间观察到第二高的相关性。12（斯皮尔曼此外，未成熟神经元和DA神经元均与Fernandes和合作者13鉴定的iPSC衍生的DA神经元亚型（DAn 1-在两个iPSC衍生的神经元数据集之间检测到的另一相似性是在我们的未成熟DA神经元（FOUNDIN-PD;表S2）和先前公开的DAn 2中的多巴胺能标志物的表达。为了验证scRNA鉴定的神经元细胞类型，我们将基于ICC的DA神经元（TH+细胞）和总体神经元（MAP 2+细胞）的估计值与从scRNA-seq数据获得的阳性细胞百分比我们发现ICC和scRNA-seq数据之间具有高度相关性（对于TH，Pearson相关性R = 0.8562，p 0.0001和R = 0.8916，p 0.0001 [Freeze]和MAP 2;图 2F和2G）。用第二种TH（Millipore）抗体获得了类似的结果（图S7）。尽管细胞系之间的分化效率（每种细胞类型的百分比）存在差异（图2H），但基于批次、表型 、 募 集 类 别 、 遗 传 性 别 或 PD 连 锁 基 因 型 （ GBA1+ 、LRRK2+ 、 SNCA+ ） ， 未 鉴 别 出 一 致 的 细 胞 类 型 富 集 （图S8）。此外，使用鉴定的DA神经元簇的基因水平scRNA-seq数据（图S9）和总TH和MAP 2水平，在技术重复（n = 4）之间观察到非常高的(C) 均匀流形近似和投影（UMAP）显示了在第65天鉴定的细胞簇（n = 416，216个单细胞，n = 79 + 4个对照重复细胞系）。显示了细胞类型及其各自的百分比(D) 每种细胞类型的细胞百分比和TH、MAP 2和SNCA的平均表达水平从蓝色到红色的点色标分别对应于较低和较高的表达点的大小与给定细胞类型中表达该基因的细胞的百分比成正比PFPP，增殖底板祖细胞; Prog，祖细胞。(E) Spearman相关性检验显示FOUNDIN-PD DA神经元类型和死后黑质人脑的基因表达高度相关。ODC，少突胶质细胞; OPC，少突胶质细胞前体细胞。通过使用Agarwal和合作者的数据鉴定的细胞类型的UMAP参见图S6A。12（F和G）ICC和scRNA-seq中TH+（Pel-Freez）和MAP 2+细胞百分比之间的相关性（R，Pearson相关系数; p <0.0001）。每个点代表一个细胞系（n =83）。(H) 细胞系的细胞类型百分比显示iPSC系间分化效率的变异性每种颜色代表scRNA-seq UMAP中注释的细胞类型，每个条代表不同的细胞系。scRNA-seq中总共包括83个细胞系HC，健康对照（n = 8+对照系的3个重复）;前驱期（n = 2）;特发性PD（iPD; n = 29）;单基因PD（LRRK 2+、GBA 1+或SNCA+; n = 41）。颜色是指（C）中的簇：黄色，DA神经元;橙色，未成熟的DA神经元;浅蓝色，神经上皮样细胞;橄榄色，PFPP;绿色，晚期神经元祖细胞;蓝色，早期神经元祖细胞;靛蓝色，室管膜样细胞。会开放获取资源（图例接下页）6Cell Genomics3，100261，2023A BC DE F G官网�i图3.批量RNA-seq和神经元分化效率预测(A) 批量RNA-seq的主成分分析（PCA）显示通过时间点（第0、25和65天）的聚类。（会开放获取资源Cell Genomics3，100261，2023年3月8日7（图S4），这表明，虽然在不同品系之间的分化效率存在差异，但这可能不是由分化方案引起的，而是由于每个个体品系的固有特征为了评估分化过程中多个时间点的基因表达差异，我们在第0天（n = 99）、第25天（n = 98）和第65天（n = 96）生成了批量RNA-seq，每个时间点包括对照线的五个技术重复。批量RNA-seq的主成分分析（PCA）显示出通过时间点的明显聚类（图3A）。根据scRNA-seq数据，我们还观察到批量RNA-seq数据中每个时间点的基因水平表达的技术重复之间的非常高的相关性（R > 0.9）（图S10对所有时间点的批量RNA-seq数据的进一步评价显示，在第25天和第65天，与神经元样特征相关的清晰的转录富集特征，包括突触组装、神经递质转运和动作电位（表S4）此外，特定的目的基因，如MAP 2和TH（图3B和3C），以及GBAl、SNCA、LRRK 2和SYNl（图S11同时，iPSC相关基因如POU5F1（图3D）、NANOG和TDGF1（图S11E和S11 F）在相对于第0天的较晚时间点显示出显著降低的表达，这与iPSC分化和生长的途径特征降低相关，包括体干细胞群体维持和细胞群体增殖的正调控（表S5）。接下来，我们使用第0天的批量RNA-seq基因表达数据来预测DA神经元分化效率。我们将DA神经元分化效率定义为第65天scRNA-seq数据集中DA神经元的分数，使用类似于Jerber和合作者描述的方法。使用逻辑回归，鉴定了十个基因，其具有非零系数并预测良好的神经元分化效率，曲线下面积（AUC）为0.93和0.87准确度（95%置信区间[0.78，0.93]）（图S12重复5倍交叉验证实现了平均AUC为0.85，SD为0.03。在具有非零系数的这10个基因中，5个与神经元分化效率显著相关（假发现率[FDR]1%;图 3E其中HNRNPH3、SRSF5和HSD17B6与神经元分化效率呈正相关。此外，随着iPSC分化为DA神经元，这些基因的表达显著降低（从第0天至第65天调整p 0.05;图3 J），表明它们在iPSC中的高表达可能代表增加的分化潜力。先前的研究已经表明 SRSF5 与 神 经 元 分 化 效 率 相 关 （ R = 0.25 ， 调 整 的 p =0.013）15，并且SRSF5结合多能特异性转录物，并且与多能特异性因子的细胞质mRNA水平正相关。17有趣的是，HNRNPH3也是一种已知的RNA结合蛋白，这表明RNA结合的调节可能是神经元分化的重要途径。其余两个相关基因（AMWIM 8和ARSA）与神经元分化效率呈负相关，并且其总体表达在分化期间显著增加（从第0天至第65天调整p <0.05;图3J）。建立iPSC衍生的DA神经元的调控图谱为了鉴定iPSC和分化的DA神经元中基因的表观遗传和调控特征，我们生成了DNA甲基化，使用测序（ATAC-seq;批量和单细胞）、HiC测序和跨几个时间点的小RNA-seq数据在第0天（质量控制[QC]后n = 97，包括5次技术重复）和第65天（QC后n =82，包括3次技术重复）生成来自批量培养物的DNA甲基化生成这些数据以评估可能调节基因转录的表观遗传模式的变化。甲基化数据显示两个时间点之间存在明显分离（图S13）。另外，标记基因如MAP 2和TH显示从第0天的iPSC到第65天的DA神经元的甲基化显著降低（图S14ATAC-seq是评估全基因组染色质可及性的常用技术。从第0天（n = 99）、第25天（n = 97）和第65天（n = 94）的培养物生成批量ATAC-seq，每个时间点包括对照线和5个技术重复。与其他测定一样，所有样品的PCA显示样品按时间点聚类（图4A）。在每个时间点从所有样品合并的峰组显示启动子附近的开放染色质富集（距转录起始位点0有趣的是，我们在更分化的细胞中观察到合并峰组的进化序列保守性增加，其中所有峰组的最低PhastCons评分19在第0天，最高在第65天（图S15B）。为了提供我们的分化细胞中染色质可及性的细胞类型特异性视图，我们在第65天为样品的子集（n = 27 + 2次重复）生成单细胞ATAC-seq（scATAC-seq）。质量控制后，保留了139，659个细胞，每个样品平均4，816个细胞（范围：944至11，649）。我们鉴定了与scRNA-seq数据中类似的广泛细胞类型（图4B）。然而，scRNA-seq和scATAC-seq数据集之间的未成熟DA神经元和祖细胞类型的百分比不同在特定的感兴趣基因处观察到细胞类型特异性染色质可及性。例如，在第25天和第65天，在本体ATAC-seq中在TH的启动子处鉴定出明显的峰，当在scATAC-seq 中 检 查 时 ， 该 峰 仅 出 现 在 DA 神 经 元 簇 中 （ 图4C）。总的来说，ATAC-seq读段在表达基因的启动子处富集，但重要的是要注意，（E-I）与神经元分化效率显著相关的基因。HNRNPH3、SRSF5、HSD17B6与ARSA呈显著正相关，而ARSWIM8与ARSA呈显著负相关。(J) 与神经元分化效率相关的基因表达水平。所有5种基因在第0天和第65天之间的表达均存在显著差异（校正后p <0.05）。会开放获取资源8Cell Genomics3，100261，2023一C图4. 第65天iPSC衍生的神经元中的染色质可及性(A) 所有批量ATAC-seq样品的PCA显示按时间点的聚类。(B) 第65天scATAC-seq数据的UMAP显示139，659个细胞（来自29个样品）的聚类和与scRNA-seq中相似的广泛细胞类型（图2C）。(C) TH基因座处的染色质可及性数据显示在第25天和第65天在批量ATAC-seq中鉴定的时间点特异性峰和在第65天在scATAC-seq中鉴定的细胞类型特异性峰该图是使用FOUNDIN-PD浏览器（https://www.foundinpd.org）生成的。在bulk或scATAC-seq中，并非该区域中的所有基因在其启动子处都具有峰，这反映了细胞类型特异性。还已知ATAC-seq反映这一点，我们观察到的峰在推定的调节区上游TH的祖细胞和DA神经元的人口，这表明这些序列可能发挥了作用，在启动TH的表达。在第25天和第65天在本体ATAC-seq中在MAP 2启动子处鉴定的峰也作为在scATAC-seq中鉴定的所有细胞类型中的更广泛的神经元标志物出现，除了神经上皮样细胞，其为非神经元细胞类型（图S16）。HiC-seq是一种用于鉴定三维染色体相互作用（染色体环）的方法已知这些环通过使增强子与其同源启动子的物理相互作用参与调节基因转录20，21这些数据对于将远端风险基因座/变体与调控区域和基因联系起来特别有用。在第0天（n = 9）和第65天（n = 8）生成批次1亚组的HiC-seq数据，因为需要大量细胞作为该测定的输入HiC染色体环显示两个时间点的明显分离，并且标志物基因MAP 2在HiC环图案中显示明显差异（图S17和S18）。B会开放获取资源Cell Genomics3，100261，2023年3月8日9图5.多巴胺能神经元(A) 表达突触蛋白I驱动的GFP的多巴胺能神经元（PPMI 4110）的延时成像。在分化的第55-56天开始分析一个神经元（绿色箭头）在整个成像期间存活。第二个神经元（红色箭头）在96小时死亡比例尺：60mm。(B) 累积死亡风险曲线显示了8天自动成像期间所有批次-1细胞系的神经元存活率(C) 累积死亡风险曲线显示，在8天自动成像期间，与健康对照系相比，与GBA 1PD系不同的多巴胺能神经元变性增加（*p0.0001;基于来自GBA 1系的891个神经元和来自健康对照[HC]志愿者的647个神经元）。为了补充其他基因表达和调控数据，我们进行了小RNA测序以研究各种类型的小RNA，包括microRNA（miRNAs; Piwi相互作用 RNA [piRNAs] ， tRNA 片 段 ） 和 其 他 小 于 50 bp 的 非 编 码RNA，它们通常参与基因沉默和基因表达的转录后调控。在第0天（n = 99）、第25天（n = 98）和第65天（n = 96）生成小RNA-seq，每个时间点包括具有五个技术重复的对照线。在所有时间点之间均观察到分离（图S19）。当在34种不同组织中检查时，在第0天至第65天之间显著上调的miRNA富集了在CNS组织中高度表达的那些22（图S20）。iPSC衍生的DA神经元为了评估上述各种分子读数与神经元表型之间的关系，我们进行了纵向成像和单细胞分析。基于细胞的成像可以是用于表征表型的分子分析的有价值的补充方法。为了进行纵向单细胞分析，在分化的第25天将分化成DA神经元的95个iPSC系中的10个（批次1）将冷冻的神经元解冻，接种在96孔培养皿中，再成熟25天，并在第24天用慢病毒转导以在突触蛋白I（SYN1）启动子的控制下表达GFP。50. 为了将我们的分析集中在被认为与PD最相关的细胞亚群上，我们从SYN1启动子表达GFP以将标记基因表达限制在相对成熟的神经元。荧光在转染的一天内变得可见，并且机器人显微镜23用于对细胞每24小时一次，持续约10天。显示GFP荧光的细胞具有相对成熟DA神经元的特征性形态学特征（图5A）. GFP形态信号用于明确地识别单个神经元，并从一个成像时间点到下一个时间点跟踪每个细胞由于其跟踪单个细胞的能力，机器人显微镜可以监测表型是否以及如何随时间变化，并获得表型终点的累积测量值，从而更好地控制变异性并增加队列之间表型比较的灵敏度。在整个实验过程中，可以跟踪活的神经元6天内的代表性神经元存活示于图5A中。细胞死亡被检测为信号的突然丧失，指示膜完整性的丧失（图5A）。总共分析了10个细胞系中的2，992个细胞。使用Kaplan-Meier存活模型分析了数百个神经元的信号完全丧失所需的时间（死亡时间），24并生成了累积死亡风险曲线（图5B）。来自携带GBA1突变的个体的细胞系与HC细胞系的比较表明GBA1细胞系的死亡风险显著增加（图5C）。测试iPSC衍生的DA神经元的背景拟合以建模PD相关遗传风险我们在我们研究的iPSC系中鉴定了广泛的遗传风险谱（表1;图S1）。除了来自GBA1、LRRK2和SNCA中已知破坏性变体的遗传风险贡献外，还有一个重要的共同风险因素可以通过多基因风险评分进行量化，如先前使用GWAS所示。GWAS的一个局限性是，如果没有额外的基因表达或功能数据，它们通常用于基于GWAS统计推断细胞类型相关性的方法是基因组注释的多标记分析（MAGMA）。该方法依赖于具有单细胞表达数据的无偏遗传风险图的收敛性;会开放获取资源10Cell Genomics3，100261，2023图6.使用scRNA-seq表达数据剖析遗传风险(A) 基于scRNA-seq数据的基因组注释的多标记分析（MAGMA）基因集富集显示与两种多巴胺能神经元细胞簇显著相关。颜色表示与图2C中相同的细胞类型。(B) 以rs11950533作为索引变量的基因座28的LocusZoom图关联数据来自最新的PD GWAS。2(C) 显示在DA神经元细胞簇中rs11950533处的基因型与CAMLG(D) PD GWAS2关联结果与scRNA-seq表达数量性状基因座（eQTL）分析之间的相关性的LocusCompare图。来自风险基因座的基因表达在单个细胞类型中的富集先前使用小鼠和人脑表达数据的分析表明，DA神经元是PD相关遗传风险的关键细胞环境。2，4来自该研究的scRNA-seq表达数据的分析揭示了相对于其他细胞类型，两种鉴定的DA细胞类型（未成熟和DA神经元）中PD连锁风险基因座内基因表达的显著富集（图6A;表S6）。结合上述比较，这些数据表明，该模型类似于人脑神经元，并提供了适合于PD中复杂遗传风险建模的细胞背景为了确定每个GWAS基因座标记的潜在致病基因和分子机制，我们将全基因组测序与分化细胞中的scRNA-seq数据相结合，以鉴定每个广义细胞类型中的表达数量性状基因座（eQTL）。使用这种方法，我们在KANSL 1和LRRC 37 A区域中复制了反映H1/H2MAPT单倍型的已知eQTL（图S21在进一步探索eQTL结果时，我们特别关注了PD中最近GWAS的90个风险变体2该数据集中的多个变体显示出显著的eQTL关联，我们的DA神经元scRNA-seq中至少一种定义的细胞类型（表S7）。例如，具有rsl 1950533作为前导变体的基因座含有至少25个基因（图6B），并且基于PD GWAS浏览器优先化工具，基于皮质脑eQTL数据27和PD GWAS信号之间的高度相关性，对4个基因（CAMLG、JADE 2、TXNDC 15和SAR 1B）进行优先化（图S22在当前FOUNDIN-PD scRNA-seq表达数据中，鉴定了CAMLG的eQTL（图6C），其显示与PD GWAS信号的高度相关性（图6D）。然而，对于JADE 2、SAR 1B或TXNDC 15没有鉴定到eQTL信号（图S23对CAMLG批量RNA-seq eQTL信号和PD风险信号交叉的检查显示，在第0天的iPSC状态下未检测到该eQTL，但在第65天变得可检测到（图S25）。这表明CAMLG表达的调节效应信号或轨迹可能与向DA神经元的分化相对应。因此，基于FOUNDIN-PD数据，CAMLG应进一步优先作为功能随访的候选药物，以确认CAMLG与PD风险之间的相关性。DA神经元的PD风险和scRNA eQTL信号也与其他独立的PD风险基因座包括TBC1D5，会开放获取资源Cell Genomics3，100261，2023年3月8日11PRCP 、CCAR 2、ARIH2和CCDC 58。在这些 基因中，与FOUNDIN-PD资源中检测到的其他细胞类型相比，PD疾病风险和DA神经元表达效应的这种交叉似乎特异于TBC1D5 （图S26）、CCAR 2（图7B）和ARIH2（图S27）的DA神经元，而PRCP和CCDC58（图S28和S29）和CAMLG（图S30）显示在多种细胞类型中抑制PD风险信号的信号。对另外的FOUNDIN-PD资源如单细胞ATAC峰的检查揭示了与其他细胞类型相比在DA神经元中升高的峰的实例，并且其含有（图7C和7 D）在基因座处具有PD风险指数变体的高LD中的变体。对于TBC1D5、CCAR2和ARIH2，信号交叉对DA神经元更特异，但是，当检查大量RNA（图7E）数据时，信号不存在。FOUNDIN-PD数据门户为了使研究人员能够快速轻松地访问数据，基因和区域级别的数据视图可通过基于Web的门户网站（https://www.foundinpd.org）集成多组学数据类型（图1）。所有用户都可以通过注册一个单一的登录Google帐户来访问区域（5 Mb）或基因的摘要级数据。单一整合视图允许通过基因组坐标可视化基因组数据，其中具有可用于scRNA-seq、scATAC-seq、bulk RNA-seq、bulk ATAC-seq、甲基化阵列、HiC-seq和小RNA-seq等的轨迹。该门户是交互式的，允许动态查看按LRRK 2/GBA 1/SNCA状态、性别和诊断划分的数据的要素/分区。轨迹可以通过触摸或鼠标进行动态缩放和平移，并且可以重新排序或从视图中隐藏。用户可以通过CSV下载支持图形的数据并导出屏幕快照。通过https：//www. ppmi-info.org/还将具有可视化个人级别数据的能力。另外的表型细节是可用的，并且用户可以例如动态地绘制表达与SNP基因型或受试者上可用的许多其他变量的关系。该门户网站包含若干其他接入点的链接，包括用于 个 人 层 面 数 据 的 PPMI-INFO 和 一 个 GitHub 网 站 （ https ：github.com/FOUNDINPD），该网站提供分析和标准操作程序。最后，通过嵌入式c