肝癌早期诊断新技术综述及非蛋白质生物标志物

·工程7（2021）1369研究肿瘤诊断与治疗新技术综述肝细胞癌早期诊断的新的非蛋白质生物标志物加桑湾Abou-Alfaa，b，Liu，Lin Wuc，Augusto VillanuevadaMemorial Sloan Kettering Cancer Center，New York City，NY 10065，USAbWeill Medical College ， Cornell University ， New York City ， NY10065，USAcBerry Oncology Corporation，Beijing 102200，Chinad美国纽约市西奈山伊坎医学院Tisch癌症研究所医学系肝病科、血液学/内科肿瘤学科、肝癌项目，NY 10029阿提奇莱因福奥文章历史记录：收到2020年2020年11月16日修订2021年2月24日接受2021年7月24日在线提供保留字：肝细胞癌早期检测生物标志物液体活检A B S T R A C T早期发现肝细胞癌（HCC）对于降低高危患者的HCC死亡率至关重要。然而，仍然缺乏用于早期HCC检测的高度敏感和特异性的监测生物标志物。近年来，已经做出了很大努力来研究在循环中可检测的肿瘤源性分子特征，例如循环肿瘤脱氧核糖核酸和循环肿瘤核糖核酸，以探索它们作为许多肿瘤类型中的非侵入性生物标志物候选物的潜力。本文就这些新方法及其在早期肝癌检测中的应用©2021 THE COUNTORS.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。1. 介绍肝细胞癌（HCC）占肝癌的90%，是世界范围内最常见和最致命的癌症之一，在许多国家新发病例仍在迅速增加。 HCC的主要危险因素是慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染、丙型肝炎病毒感染、酒精使用障碍和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。不同原因的肝硬化使患者易患肝癌，年发病率为2%在2000-2014年期间，HCC患者的5年净生存率在5%-30%的范围内如果在早期发现并治疗HCC， 5年生存率可提高至70%[3]。由于许多HCC患者在早期阶段是渐进的，几乎一半的患者在晚期被诊断[4]，此时治愈性治疗的窗口非常窄。因此，在监测项目的背景下，早期HCC检测已被证明可以降低高危患者的HCC死亡率[5]。目前仍缺乏用于早期HCC检测的目前，HCC监测*通讯作者。电子邮件地址：abou-alg@MSKCC.ORG（G.K. Abou-Alfa）。取决于影像学检查和血清学检测。根据美国肝病研究协会[6]和欧洲肝病研究协会的建议，有或无血清甲胎蛋白（AFP）的腹部超声是HCC监测的主流指南2018[7]。当AFP的临界值为20μgL~（-1）时，有限的敏感性范围为41%至65%，特异性AFP对早期肿瘤的敏感性更低，仅为32%另一方面，超声检测早期HCC的效果不佳，灵敏度为63%[9]。最近一项针对10000多名患者的前瞻性荟萃分析发现，超声和AFP检测的合并灵敏度为63早期肝癌[10]。 其他血清蛋白靶点，如AFP-L3和脱-c-羧基-凝血酶原（DCP）（也称为前凝血酶原，由维生素K缺乏或拮抗剂-II）诱导紧张也已被作为早期HCC检测的生物标志物进行了探索[11]，但在队列研究中尚未确定其临床效用已经开发了一种名为GALAD（即，性别、年龄、AFP-L3、AFP和DCP）的诊断模型，涉及上述三种血清蛋白生物标志物以及年龄和性别，HCC早期和晚期TNM（其中T描述原发肿瘤的大小，N描述是否影响区域淋巴结，M描述是否存在远处转移）阶段的曲线下面积（AUC）分别为0.95和0.98[12]。2020年初，https://doi.org/10.1016/j.eng.2021.02.0202095-8099/©2021 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可从ScienceDirect获取目录列表工程杂志首页：www.elsevier.com/locate/engG.K.阿布-阿尔法湖Wu和A. Villanueva工程7（2021）13691370≤×××美国食品和药物管理局授予突破性器械称号GALAD评分，以支持HCC的早期诊断[13]。近年来，除了血清蛋白之外，在循环中可检测到的肿瘤衍生分子特征已被研究为许多肿瘤类型中的潜在生物标志物。在这篇综述中，我们总结了目前对这些新方法的研究及其在早期肝癌检测领域的应用如表1[14-26]所示2. 循环肿瘤脱氧核糖核酸循环肿瘤DNA（ctDNA）是指由于细胞死亡（通过细胞凋亡或坏死）而释放到血流中的肿瘤来源的DNA片段这些片段携带肿瘤特异性改变，包括单核苷酸变异（SNV）、插入/缺失（In/Del）、结构变异和表观遗传改变，因此具有作为生物标志物的潜力。使用ctDNA进行癌症早期检测的最大挑战是它仅占总循环无细胞DNA（cfDNA）的少数据估计，早期癌症的cfDNA中ctDNA的百分比低于1%，并且可能低至0.01%[27]。许多技术进步试图解决这个问题，例 如 在下 一 代 测序 （ NGS ） 中 使用 数 字 液 滴聚 合 酶 链式 反 应（PCR）或独特的分子标识符[28]。在HCC中，有证据表明超深度测序可以在早期阶段检测患者血液中的组织突变[29]。DNA甲基化通常是指5-甲基胞嘧啶（5 mC）修饰，这是基因表达的表观遗传调节因子，通常导致基因沉默。肿瘤抑制基因的DNA甲基化增加是许多肿瘤的早期事件，使DNA甲基化成为早期检测的潜在生物标志物。与每个样品中可用的有限数量的DNA突变事件和位点不同，DNA甲基化发生在多个靶区域和每个靶向基因组区域内的多个改变的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）位点[30]，因此提供了比DNA突变更多的潜在靶标一些研究小组已经开发了甲基化检测技术，并探索了它们在早期HCC检测中的有用性。2015年，Wen等人[14]开发了一种甲基化CpG串联扩增和测序（MCTA-Seq）方法，可以检测cfDNA全基因组中的高甲基化CpG岛，灵敏度为0.25%等位基因频率。利用这项技术，他们分析了一个由27名HCC患者、17名肝硬化患者和28名正常人组成的小队列，在血液中检测小HCC（3 cm）的19种高性能标志物，其中4种（G蛋白信号调节因子10（RGS 10）、ST 8 α-N-乙酰神经氨酸α-2，8-唾液酸转移酶6（ST 8 SIA 6）、RUNX家族转录因子2（RUNX 2）和波形蛋白（VIM））与肿瘤中的高甲基化一致由这些生物标志物组成的分类器模型对来自36名HCC患者和17名肝硬化患者和38名正常人的对照受试者的血浆样品实现了94%的灵敏度和89%的特异性值得注意的是，所有15名AFP阴性HCC患者都被成功鉴定，这表明将来有可能将这些DNA甲基化生物标志物与AFP相结合2017年，Xuet al.[15]对来自由1098名HCC患者和835名正常对照组成的更大队列的cfDNA样本进行了甲基化分析，以通过靶向亚硫酸氢盐测序鉴定使用所谓的甲基化相关区块作为单位来量化CpG为 了 确 定 甲 基 化 水 平 ， 该 小 组 构 建 了 由 十 个 甲 基 化 标 记 物（ cg10428836 、 cg26668608 、 cg25754195 、 cg05205842 、cg11606215 、 cg24067911 、 cg18196829 、 cg23211949 、cg17213048和cg 25459300），AUC为0.944（95%置信区间（CI），0.928联合诊断评分（cd评分）与肿瘤负荷、治疗反应和分期高度相关。然而，本研究中的大多数HCC病例的肿瘤处于晚期，这限制了这些结果外推另一种基于DNA甲基化的检测方法也报告了高于90%的灵敏度和特异性[16]，这可能优于目前推荐的HCC监测工具循环无细胞基因组图谱（CCGA）联盟也观察到了检测率和肿瘤分期的正相关性，该联盟针对50多种癌症（包括肝癌）血浆DNA中超过100 000个甲基化区域进行了亚硫酸氢盐测序[31]，表明DNA甲基化生物标志物在早期检测中具有亚最佳效用5-羟甲基胞嘧啶（5 hmC）是另一种类型的表观遗传标记。它是一种稳定的脱甲基产物，通过10-11易位家族二氧合酶氧化5 mC产生增强子、启动子和基因体中的5hmC修饰影响基因表达。2017年两个不同实验室报告的检测cfDNA、hMe-Seal和5 hmC-Seal中5 hmC修饰的技术涉及5 hmC的选择性化学标记，然后进行富集和测序[33，34]。2019年，Cai等人[17]使用5 hmC-Seal技术分析了1204例HCC患者、392例慢性乙型肝炎（CHB）感染/肝硬化（LC）患者和958例健康个体/良性肝脏病变患者cfDNA样本中的全基因组5 hmC。他们专注于基因体中5 hmC的变化，开发了一种32基因分类器，用于区分早期HCC（0/A期，巴塞罗那临床肝癌（BCLC））与非HCC，AUC为88.4%（95%CI，85.8%-结构变异是癌症的标志几个研究小组已经开发了评估ctDNA中拷贝数变异（CNV）的方法，用于HCC的早期检测。2015年，Xu等人[35]基于0.1 - 0.2的低深度全基因组测序（WGS），分析了31例HCC和8例慢性肝炎/肝硬化患者血浆样本的小型队列中的CNV。通过CNVZ评分分析，他们确定了几个差异变量（例如，HCC中1q、7q和19q的增益）和一些较小的微分变量（例如，4q、13q丢失，17q、22q增加）区域，基于此，他们提出了CNV评分方法，该方法在31名HCC患者中的26名（83.9%），或在肿瘤尺寸高达50 mm的16名HCC患者中的11名值得注意的是，所有8个慢性肝炎或肝硬化样本的评分均为阴性。虽然单独的CNV分析不足以早期发现HCC，但它可以作为模型构建的参数。在2020年，Tao等人[18]进行了一项更深的低深度WGS（5），以分析包含384份HBV相关HCC和无癌症HBV患者血浆样本的较大队列中的CNV。他们使用机器学习开发了一个模型，209例患者，AUC为0.893，早期（BCLC 0-A期）为0.874，晚期（BCLC B-D期）为0.933。在两个队列（76和99例患者）中验证了模型的性能，这两个队列仅由0-A期HCC和HBV感染患者组成，AUC分别为0.920和0.812。此外，研究人员发现，对于早期检测，降低测序深度会降低G.K.阿布-阿尔法湖Wu和A. Villanueva工程7（2021）13691371表1HCC早期检测的候选生物标志物。候选分子生物标记技术性能验证群组EDRN相参考DNA甲基化（5mC）19个标记10个标记（cg10428836，cg26668608，MCTA测序针对性HCC与非HCCAUC为0.944（95% CI，0.92836例HCC/17例LC/38例正常383例HCC/275例正常22[14个][第十五条]cg25754195、cg05205842、cg11606215、cg24067911、cg18196829、cg23211949、cg17213048和cg25459300）亚硫酸氢盐测序六个标记（HOXA 1，EMX 1，AK 055957，ECE1、PFKP和CLEC11A），通过B3GALT 6标准化特卡斯HCC的AUC为0.96（95% CI，0.93与非HCCHCC敏感性为95%（88%75% 0期和93% A期，特异性92%（86%95例HCC（4例0期，42例A期）/51例LC/98例健康2[16个]5hmC修饰32个标记5 hmC-密封AUC为88.4%（95% CI，85.8%HCC与非HCC的AUC为84.6%（95% CI，80.6%队列2 HCC与对照队列1：220例早期HCC/129例CHB或LC/256例控制队列2：24例早期HCC/180控制2[17个]CNV全球低深度WGS队列1队列2队列1：38例早期HCC/38例HBV队列2：51例早期HCC/48例HBV2[18个国家]片段大小全球低深度WGSHCC与非HCC90例HCC/32例健康/67例HBV/36例LC2[19个]miRNA7种标志物（miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26 a、miR-27 a和miR- 801）qPCRBCLC 0期、A期、B期和C期相对于非HCC的AUC分别为0.888、0.888、0.888、0.888和0.888。0.901和0.881HCC与健康、CHB和肝硬化的AUC196例HCC/66例健康/72例CHB/z 56 LC2[20个]八种标记物（miR-206、miR-141- 3 p、miR-433- 3 p、miR-1228- 5 p、miR-199a-5 p、miR-199 b-5 p、miR-199 c-5p），miR-122-5p、miR-192-5p和miR-26a-5p）qRT-PCRHCC与非HCC的AUC为0.879，HCC与健康人的AUC为0.893，HCC与肝硬化103 HCC/78 LC/60健康2[21日]7种标志物（miR-29 a、miR-29 c、miR-133 a、miR-143、miR-145、miR-192和miR-505）qPCR队列1的AUC为0.817（0.769队列2中HCC与非HCC相比为0.884（0.818-HCC与CHB/LC的敏感性和特异性分别为74.5%和89.9%; HCC与非活动性HBsAg携带者的敏感性和特异性分别为85.7%和83.3%，敏感性分别为29.6%、48.1%、48.1%，队列3中，临床诊断前12、9、6和3个月内HCC发生率为55.6%队列1：153例HCC/60例健康/68例CHB/71例LC队列2：49例HCC/48例健康/42例IHC队列3（巢式病例对照研究）：27例HCC/ 135例对照（CHB或LC）2,3[22日]lncRNA三种标志物（LINC 00152、RP 11 -160 H22.5和XLOC 014172）qRT-PCRlncRNA组的AUC不可用当与AFP100 HCC/100 CHB/100健康2[23日]病毒暴露特征对应61株病毒的独特表位使用VirScan进行血清学分析基线时AUC为0.91，诊断时为0.98前瞻性风险队列：44例HCC/129例无癌3[24日]多分析DNA突变、HBV整合、cfDNA浓度、蛋白标志物、性别和年龄PCR测序和CLIA17% PPV前瞻性AFP/超声阴性队列：24例HCC/307例6岁后无癌8个月3[25日]5hmC、末端基序、片段化和核小体足迹5hmC测序和低通WGSHCC与LC的HCC与非HCC的LC/116健康2[26日]DNA：脱氧核糖核酸; cfDNA：游离DNA; 5mC：5-甲基胞嘧啶; 5hmC：5-羟甲基胞嘧啶; MCTA-Seq：甲基化胞嘧啶磷酸鸟嘌呤（CpG）串联扩增和测序; CNV：拷贝数变异;BCLC：巴塞罗那临床肝癌; HBsAg：乙型肝炎表面抗原; EDRN：早期检测研究网络; TELQAS：靶富集长探针定量扩增信号; CI：置信区间; WGS：全基因组测序; LC：肝硬化;CHB：慢性乙型肝炎; IHC：非活动性HBsAg携带者; CH：慢性肝炎; qPCR：定量聚合酶链反应; qRT-PCR：定量逆转录酶聚合酶链反应; PCR：聚合酶链反应; RNA：核糖核酸;miRNA：microRNA; lncRNA：长链非编码RNA; CLIA：化学发光免疫分析仪; PPV：阳性预测值; HOXA 1：同源框A1; EMX 1：空气门同源框1; ECE 1：内皮素转换酶1;PFKP：磷酸果糖激酶; CLEC 11 A：含11 A的C型凝集素结构域; B3 GALT 6：β-1，3-半乳糖基转移酶6.G.K.阿布-阿尔法湖Wu和A. Villanueva工程7（2021）13691372灵敏度，这表明可能需要足够的测序深度来实现模型的稳定性能。3. 碎片组学cfDNA由于无核小体区域的核酸内切酶消化而高度片段化。cfDNA的片段化不是随机的，并且可以携带组织或肿瘤特异性标记。片段组学是指cfDNA片段化模式的分子特征分析，包括血浆DNA大小、终点和核小体足迹[36]。 cfDNA的这些分子特征可以容易地从WGS数据分析为了了解HCC的cfDNA片段的大小分布，2015年，Jiang等人[37]对90名HCC患者、67名CHB患者、36名乙型肝炎相关肝硬化患者和32名健康对照者的cfDNA大小谱进行了全基因组分析。他们发现，HCC患者的cfDNA更易变，长度异常短或长短的优先携带肿瘤相关的拷贝数畸变。研究人员还发现，HCC患者血浆中的线粒体DNA这些分子比血浆中的核DNA短得多。2019年，Cristiano等人[38]评估了cfDNA在整个基因组中的片段化模式，发现健康个体的图谱反映了白细胞的核小体模式，而癌症患者的片段化图谱发生了改变研究发现，使用全基因组片段化特征的机器学习模型在7种癌症类型中的检测灵敏度为57%至99%以上，特异性为98%，总体AUC为0.94。不幸的是，这项研究没有包括肝癌样本。为了探索cfDNA片段末端位置的效用，2018年，Jiang et al.[19]研究了是否存在与早期HCC检测相关的优选血浆DNA末端坐标形式的ctDNA信号研究HCC和CHB患者血浆中的DNA末端特征，他们在基因组中鉴定出数百万个肿瘤相关血浆DNA末端坐标。90例HCC患者的血浆样本中肿瘤与非肿瘤相关的优选末端的比率与非HCC参与者（32例健康对照、67例HBV携带者和36例LC）相比显著增加，区分HCC患者与对照的AUC为0.88血浆DNA末端坐标比体细胞突变更容易检测为血浆中的特定癌症特征。为了探索片段末端信息的效用，2020年，该小组进一步研究了HCC的50末端基序，发现HCC患者血浆DNA末端基序的多样性显著增加[39]。特别是，血浆DNA基序CCCA的丰度在HCC患者中比没有HCC的患者低得多通过将异常末端基序与其他癌症类型的末端基序进行比较，研究人员观察到，来自同一器官（如肝脏，胎盘和造血细胞）的血浆DNA末端基序的分布通常聚集在一起，表明这些标记携带组织来源信息。虽然4-mer末端基序的优先模式被确定为HCC，其在区分HCC和LC中的作用尚不清楚。cfDNA反映核小体足迹。 在积极转录基因、启动子区和下游基因体不含核小体，导致定位读数的频率降低。从健康个体中的cfDNA推断的核小体间距与淋巴细胞和骨髓细胞的表观遗传特征最强相关[40]。Ulz等人[41]证明，cfDNA中转录起始位点周围的核小体占据可能导致不同的读取深度覆盖模式，表达和沉默的基因。最近，Chen等人[26]探索了用于肝癌检测的cfDNA中的核小体足迹以及其他基因组特征，并发现单独的核小体足迹可以在区分HCC与LC时达到0.973的AUC。4. 循环肿瘤核糖核酸（RNA）循环microRNA（miRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）也是癌症的潜在良好生物标志物。miRNA是一类长度为约22个核苷酸的内源性小的非编码RNA转录物，而lncRNA是长度超过200个核苷酸的较长的非蛋白质编码转录物。miRNA和lncRNA都是基因表达的重要调控分子，因为它们参与多个细胞过程，并且它们的失调与包括癌症在内的多种疾病有关。miRNA和lncRNA可以在健康和患病个体的循环中发现，并且循环RNA在HCC早期检测中的研究比ctDNA的研究早得多。有几十篇关于miRNA作为HCC生物标志物的研究出版物;一些有识别目标从微阵列或NGS谱分析，而其他人已经测试了来自文献搜索的miRNA候选物。用于定量miRNA靶标的方法通常是定量逆转录酶聚合酶链反应（qRT-PCR）测定。早在2011年，Zhou等人[20]就进行了一项研究，包括三个独立的队列，包括934名参与者（健康，CHB，肝硬化和HBV相关的HCC）。研究人员首先用靶向137个样本中723个miRNA的微阵列分析了血浆miRNA表达，然后，他们通过定量聚合酶链反应（qPCR）评估了miRNA组的表达。在407份样本的训练队列上建立的逻辑回归模型显示，在390份样本的验证队列中，AUC为0.888，这与疾病状态无关，BCLC 0、A、B和C期的AUC分别为miRNA组在区分HCC患者与健康对照（AUC 0.941）方面显示出比区分CHB患者（AUC 0.842）和硬化患者（AUC 0.884）更好的性能。2014年，Tan et al.[21]进行了一项类似的研究，667份样本（261例HCC患者，233例肝硬化患者和173例健康对照），其中使用来自HCC患者和对照的合并血清样本通过NGS进行miRNA表达的初步筛选该小组鉴定了八种miRNA（hsa-miR-206、hsa-miR-141- 3 p、hsa-miR-433- 3 p、hsa-miR-1228- 5 p、hsa-miR-199 a-5 p、hsa-miR-122 - 5 p、hsa-miR-192- 5 p和hsa-miR-26 a-5 p），并且具有逻辑回归模型的小组对于训练（357）和验证具有0.887和0.879的AUC(241)这与Zhou等人[20]的面板相似。与Zhou等人[20]的组不同，该miRNA组在区分HCC患者与健康对照（AUC = 0.893）和肝硬化患者（AUC = 0.892）方面具有几乎相同的能力。然而，目前尚不清楚该面板是否独立于HCC分期。2015年，Lin等人[22]报告了一项研究，测试了他们确定的预测临床前HCC的面板。在使用HCC、与HBV感染相关的肝硬化患者、非活性乙型肝炎表面抗原（HBsAg）携带者和健康对照的回顾性队列进行发现和验证阶段之后，他们提出了7种miRNA组（miR-29 a、miR-29 c、miR-133 a、miR-143、miR-145、miR-192和miR-505）的血清miRNA分类器（Cmi）。该小组区分HCC与CHB合并LC患者的敏感性为74.5%，特异性为89.9%，HCC患者的敏感性为85.7%，特异性为83.3%，G.K.阿布-阿尔法湖Wu和A. Villanueva工程7（2021）13691373非活性HBsAg携带者组。该报告包括27例病例的巢式病例对照研究，发现Cmi检测HCC的敏感性分别为29.6%、48.1%、48.1%和55.6%，临床诊断前12、9、6和3个月与循环miRNA的研究相比，循环lncRNA作为HCC生物标志物的研究较少，队列也更例如，在2017年，Yuan等人[23]使用qRT-PCR测试了从文献中选择的10种候选循环lncRNA，并在20名HCC患者和20名对照的训练集中鉴定了4种lncRNA，在HCC患者和对照各100名的验证集中 进 一 步 缩 小 到 3 种 （ LINC 00152 、 RP 11 -160H22.5 和 XLOC014172）。三种lncRNA与AFP的组合可以区分HCC患者与慢性肝炎患者或健康对照，AUC分别为0.986和0.985。5. 病毒暴露特征肝细胞癌是一种病毒相关的恶性肿瘤，病毒感染可能会影响宿主免疫力，从而决定癌症的发病。因此，由病毒-宿主相互作用产生的独特病毒暴露特征可以反映可能改变发生HCC的风险的级联事件。 为了验证这一假设，Liu等人[24]使用合成人病毒组VirScan对来自马里兰大学国家癌症研究所（NCI-UMD）病例对照研究的899名个体的病毒感染史进行了血清学分析。他们开发了一种病毒暴露特征，并在一个纵向队列中验证了结果，该队列有173名长期随访HCC发展的高危患者。在验证队列中，病毒暴露特征与高危个体的HCC状态显著相关，基线时AUC为0.91，诊断时AUC为0.98。该病毒特征在临床诊断之前识别HCC患者，并且优于AFP。6. 多种分析物由于癌症固有的分子异质性，早期检测生物标志物可能需要涵盖多个分子维度以实现竞争性能。例如，Cohen等人[42]开发了一种名为Cancer-SEEK的血液测试，通过评估cfDNA和39种循环蛋白的突变水平来检测8种常见癌症类型用61个扩增子组检测突变，每个扩增子查询常见癌症中16个频繁突变基因之一内的平均33个碱基对。CancerSEEK对肝癌的敏感性高达98%，总体特异性大于99%。然而，CancerSEEK的灵敏度取决于癌症的阶段，并且包括很少的HCC早期样本。此外，同一组的一项随访研究报告了使用仅血液检测检测不同肿瘤类型的阳性预测值相对较低[43]。对于肝癌的早期检测，已经报道了使用多种分析物的不同方法。Qu等人[25]开发了一种HCC筛查试验，包括DNA突变、HBV整合、cfDNA浓度、蛋白质标志物、性别和年龄。该试验稳健地将HCC与非HCC患者分开，在训练集中的灵敏度为85%，特异性为93%，在验证队列中的阳性预测值为17%。Chen等人[26]通过整合cfDNA的四个基因组特征开发了HIFI方法：5hmC修饰、末端基序、片段化和核小体足迹。该方法在检测LC中HCCs的准确性很高，在一个测试集中的敏感性为95.42%，特异性为97.83%，与人口统计学和临床特征特征包括年龄、HBV状态、7. 观对于早期HCC检测的更好工具的需求怎么强调都不过分。近年来，在生物医学中液体活组织检查应用的更广泛背景下，许多新的分子方法已经针对检测释放到血流中这些新的尝试为HCC的早期检测提供了光明，因为尽管可以进行直接比较，但这些分子生物标志物显示出比AFP更好的AUC。由于HCC的异质性和早期循环中肿瘤特异性遗传物质的比例相对较低，仅由一种类型的生物标志物组成的早期检测模型在灵敏度和特异性方面具有局限性虽然多维参数的组合几乎没有被探索过，但它有望显著提高早期检测率。多维参数还可以包括传统工具，例如临床病理指标、蛋白质生物标志物和分子成像。用于早期检测的生物标志物开发通常需要五个阶段[44]。如早期检测研究网络（EDRN）指南所列，这些研究包括：临床前探索性研究、临床疾病的临床测定开发、回顾性纵向储存库研究、前瞻性筛选研究和癌症对照研究。本文总结的大多数早期检测方法仍处于第2阶段，其中使用临床样本评估区分HCC与非HCC的能力几项研究已经进展到3期，其中评估了生物标志物检测临床前疾病的能力所有这些都是回顾性的，因为没有基于这些测试进行转诊;因此，临床有用性需要在前瞻性筛选研究中进一步测试。应该注意的是，本文综述的新工具是用于早期检测，而不是诊断，因为早期检测试验阳性的患者应该接受明确的诊断程序（例如，磁共振成像和活组织检查）。考虑到这一点，在开发和临床使用用于早期检测HCC的尖端技术方面存在几个具有挑战性的问题(1) 目标人群。目标人群包括具有HCC风险的个体，包括患有LC、慢性肝炎病毒感染、酗酒、NAFLD或HCC家族史的个体这些人应该每六个月进行一次这些测试，就像目前的AFP/超声波一样。(2) 多种尖端技术和生物标志物组合的选择和成本效益。可以基于增加的检测值以及每种技术/生物标志物的成本来选择多种技术和生物标志物的组合还应考虑到技术发展带来的成本降低(3) 接受高危个体进行多种生物标志物检查。是否接受高危人群进行多种生物标志物检测主要取决于检测工具的检出率、个体遵守道德操守准则加桑湾Abou-Alfa、Lin Wu和Augusto Villanueva声明他们没有利益冲突或财务冲突需要披露。G.K.阿布-阿尔法湖Wu和A. 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