医学信息学解锁25（2021）100683通过反向疫苗学、消减蛋白质组学和免疫信息学方法设计抗拉沙病毒的多表位疫苗Akinyemi Ademola Omoniyia，c，*，Samuel Sunday Adebisia，Sunday Abraham Musa a，James Oliver Nzalakb，Barnabas Danborno a，Zainab Mahmood Bauchi a，Iswat Taiwo Badmus a，Oluwasegun Davis Olatomidea，Olalekan Jerry Oladimeji a，Jens Randel Nyengaard ca尼日利亚扎里亚艾哈迈杜贝洛大学医学院基础医学系人体解剖学系b尼日利亚扎里亚艾哈迈杜贝洛大学兽医学院兽医解剖学系c奥胡斯大学临床医学系，分子形态学核心中心，体视学和显微镜科，奥胡斯大学医院病理学系，丹麦A R T I C L EI N FO保留字：拉沙病毒RIG-I多表位疫苗分子对接A B S T R A C T拉沙病毒是一种沙粒病毒，是引起病毒性出血热的最常见的人类病原体。它在尼日利亚和其他西非国家流行。尽管该疾病的负担很高，但可用的治疗方法有限，并且没有用于预防该疾病的批准疫苗。在本研究中，采用免疫信息学和反向疫苗学管道来预测多表位疫苗。鉴定了四种基本的毒力和蛋白质生成蛋白（糖蛋白前体、病毒基质蛋白、病毒RNA聚合酶使用各种免疫信息学工具，预测12个CTL、14个HTL和6个B细胞表位，并通过合适的接头与佐剂一起连接，以开发602个氨基酸长的疫苗构建体（VC）。VC被评估为非过敏性、非毒性、稳定、可溶性和高抗原性。进行VC与RIG-I、主要组织相容性复合物I类和II类的分子对接以验证与受体的相互作用。对VC-RIG-I复合物进行了动态稳定性试验，RMDS和RMSF结果表明该复合物是稳定的。使用E. 大肠杆菌作为宿主。CAI值为0.99表明疫苗在宿主中正确表达的构造。免疫模拟预测了显著高水平的IgG 1、T辅助细胞、T细胞毒性细胞、INF-γ和IL-2。这项严格的计算研究表明，通过建立一种有效的免疫记忆来控制感染。然而，无论是在体外和体内实验-还需要进一步的研究来证实所提出的疫苗的潜力1. 介绍拉沙病毒是一种沙粒病毒，历史上起源于尼日利亚东北部的拉沙村，估计每年在西非感染超过30万人，并造成超过3000人死亡[1]。拉沙热在西非国家如尼日利亚、塞拉利昂、利比里亚、贝宁、加纳、几内亚和马里流行[2]。2020年1月至4月，尼日利亚疾病控制中心报告了超过963例确诊病例和188例死亡病例，其中大多数确诊病例发生在埃多州和翁多州[3]。拉沙病毒于1969年首次发现[4]，由啮齿类宿主Mastomysnatalensis的持续感染携带[5]。感染可能涉及吸入受污染的啮齿动物排泄物和食用污染的食物[6]该病毒通过接触受感染的体液从一个人传播到另一个人[7沙粒病毒被负链RNA病毒包被[11]，基因组由两个片段组成。小片段编码糖蛋白前体（GPC），其表达于病毒的包膜上， 三聚体状态[12]和反向包裹病毒基因组的核蛋白。大片段编码病毒基质蛋白和病毒RNA依赖性RNA聚合酶[5]。GPC的翻译后修饰产生稳定的信号肽（SSP）、N-末端GP 1和跨膜GP 2 [13]。GP1与细胞受体结合，对感染的细胞间增殖很重要，而GP2介导病毒融合，在结构上类似于I类病毒融合蛋白[11]。拉沙病毒进入宿主细胞* 通讯作者。尼日利亚扎里亚艾哈迈杜贝洛大学医学院基础医学系人体解剖学系电子邮件地址：aaomoniyi@abu.edu.ng（A.A.Omoniyi）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100683接收日期：2021年4月21日;接收日期：2021年7月24日;接受日期：2021年7月28日2021年8月8日网上发售2352-9148/©2021的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊首页：www.elsevier.com/locate/imuA.A. Omoniyi等人医学信息学解锁25（2021）1006832通过受体介导的内吞作用，随后转运至内体区室，在低pH下发生融合[14，15]。肌营养不良聚糖（DG）是第一个被发现的拉沙病毒受体，在细胞外基质蛋白的保守细胞受体中普遍表达[16，17]，并在哺乳动物的大多数组织中发现[11]。DG作为单一多肽链产生，经过自动加工，产生外周α-DG，作为拉沙病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白和C类新世界沙粒病毒受体[18-20 ]。跨膜β-DG在细胞外基质与细胞骨架的粘附中起重要作用，肌肉和非肌肉组织中的细胞粘附受体[21]。据信，拉沙病毒特异性T细胞的活化在感染期间起着至关重要的作用[22，23]，因为对拉沙病毒的强烈T细胞应答对于保护免受拉沙热至关重要[5，24，25]。尽管流行地区的疾病负担很高，但没有针对拉沙病毒的预防措施。尽管在确定有前途的临床前候选药物方面取得了进展，但其中大多数在临床试验中失败。缺乏批准的疫苗和有限的治疗选择使得迫切需要开发针对拉沙病毒疫苗设计的实验方法具有挑战性和耗时性，因此免疫信息学已成为一种新的工具，用于识别疫苗开发的靶抗原[26 的 免疫信息学方法 可以缩小这增加了待测试的潜在分子的数量，从而增加了找到更好候选物的机会。据报道，基于表位的疫苗可有效阐明针对甲型流感[29]、乙型肝炎[30]和丙型病毒[31]、利什曼原虫[32]、志贺氏菌[33]和马亚罗病毒[34]。多表位疫苗是预防和治疗肿瘤或病毒感染的最终方法[35多抗原疫苗由多个MHC限制性表位组成，所述表位可被来自各种T细胞亚群的多个克隆的TCR [38]、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、Th和B细胞表位识别。这同时诱导了强烈的细胞和体液免疫应答。多表位疫苗与佐剂成分配合使用，可以增强免疫原性，提供持久的免疫应答，减少可能引发病理性免疫反应的不需要的成分松塞斯或不良影响[38这研究是使用免疫信息学驱动的筛选方法和拉沙病毒的蛋白质组学数据，以设计可引发针对拉沙病毒的保护性体液和细胞免疫应答1.1. 方法1.1.1. 拉沙病毒蛋白质组检索器对拉沙病毒糖蛋白前体（E9K9S4）、核蛋白（A0A097F4S7）、病毒基质蛋白（A0A5J6BM51）和病毒RNA聚合酶（A0A2P1JNX2）的完整氨基酸序列进行了分析。以标准FASTA格式从UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）检索[44工作的总体流程如图所示。1.一、1.2. 毒力因子应用Vaxign-ML（http://www.violinet.org/vaxign2）管道计算保护性抗原性（蛋白原性）评分，并预测候选疫苗的亚细胞定位、跨膜螺旋和粘附概率[47]。Vaxign-ML基于优化的监督机器学习模型预测蛋白原性评分，该模型具有由细菌和病毒保护性抗原组成的手动注释的训练数据该方法已通过Fig. 1. 展示整体流程。方法学策略分为六个部分：（i）拉沙病毒蛋白质组检索，（ii）表位预测，（iii）多表位疫苗构建，（iv）疫苗建模，（v）分子对接和动态模拟，（vi）计算机表达和免疫刺激。A.A. Omoniyi等人医学信息学解锁25（2021）1006833嵌套五重交叉验证和留一病原体验证，以确保无偏倚的性能评估和预测候选疫苗抵抗病原体的能力[47，48]。1.7. 毒性预测选择的CTL表位和HTL表位的非毒性性质是预测使用至XinPred （http://crdd.osdd.net/raghava/t1.3. 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位预测使用在线网络工具NetCTLv2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/）进行CTL表位（用于拉沙病毒的结构多蛋白）的预测。表位预测基于MHC-I结合肽预测、蛋白酶体C-末端切割和与抗原加工相关的转运蛋白（TAP）的转运效率。使用人工神经网络预测MHC-I结合和蛋白酶体C-末端切割，同时使用权重矩阵计算TAP转运蛋白的功效。预测CTL表位的阈值设定为默认值0.75[49].为了进一步证明预测的表位可以识别MHC分子上呈递的肽并且可以被激活并引发其效应子功能，使用默认设置将预测的CTL表位置于I类免疫原性服务器（http://tools.iedb.org/immunogenicity/）中以选择用于免疫原性的最佳表位。该工具仅验证了9-mer肽的I类免疫原性[50]。1.4. 辅助T淋巴细胞（HTL）表位预测七种人类等位基因HLA-DRB 1 *03：01、HLA-DRB 1 *07：01、HLA-DRB 1 *015：01、HLA-DRB 3 *01：01、HLA-DRB 3 *02：02的HTL表位，HLA-DRB4*01 ： 01 和 HLA-DRB5*01 ： 01 通 过 IEDB（ www.example.com ） 的 MHC-II 预 测 模 块 从 拉 沙 病 毒 蛋 白 预 测http://tools.iedb。org/mhlg/）。 的 肽亲和 每个受体都是基于 上对每个表位给出IC50评分具有更高结合亲和力的肽必须具有50 nM的IC 50值，而IC 50评分500nM和 500 nM的肽必须具有50 nM的IC 50值。<<<5000 nM指向前-表位，分别。百分位等级的得分与表位的结合亲和力成反比，即，百分位数越低，结合亲和力越高[51]。为了证明前-选定的HTL表位将具有激活Th 1型免疫应答的能力，随后通过MHCII类活化的CD4+ T辅助细胞，预测的HTL表位是使用predict选项，使IFN-γ诱导表位服务器（http://crdd.osdd.net/raghava/ifnepitope/index.php）进行。 选择基序和SVM混合物作为方法，并且IFN-γ与其他细胞因子作为预测模型[52]。干扰素主要对感染性疾病具有保护作用，并使宿主损害最小化[531.5. 致敏性预测使用算法来预测的CTL表位、HTL表位的变应原性评分，并使用变应原性蛋白的预测以高精度构建疫苗序列，并用于定位变应原性蛋白上的IgE表位（AlgPred）（http://www.imtech）。res.in/raghava/algpred/）上提供。在0.4的阈值下，这种方法获得的准确度约为85%。服务器采用六种不同的方法来预测过敏性，具有非常高的准确性[56]。1.6. 抗原性预测使用VaxiJen服务器（www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）预测预测的CTL表位、HTL表位和构建的疫苗序列的抗原性，对于选择作为靶生物的病毒，在0.4阈值该服务器仅基于用于预测给定氨基酸序列的抗原性的理化性质[57]。或用于预测表位的X性的在线工具。服务器基于表位的物理化学性质预测表位的毒性[58]。1.8. B细胞表位预测B细胞表位被其表面上与B淋巴细胞相关的受体识别和结合，并且被表征为抗原因子。B细胞表位在宿主抗体生产计划中发挥更大的作用 。 ABCpred 服 务 器 用 于 预 测 线 性 B 细 胞 表 位（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/index.html）。服务器使用人工神经网络预测拉沙病毒蛋白质组中的线性B细胞表位。它是第一个基于递归神经网络（基于机器的技术）开发的服务器，使用固定长度模式的准确率为65.9%[59]。最大的精度已获得使用一个循环神经网络（约旦网络）与一个单一的隐藏层的35个隐藏单元的窗口长度为16。此外，ElliPro在线服务器（http://tools.iedb.org/ellipro/）用于预测构象B细胞表位（默认阈值为0.5，默认最大距离为6）。ElliPro的结果是基于Thornton将突出指数（PI）得分分配给每个预测的表位。使用几个椭圆体，定义表位的3D形状，并且对于每个残基，基于每个残基的质心精确描述PI值，其位于最大有希望椭圆体的外部区域。具有较大值的残留物具有更好的溶剂可及性[60]。1.9. 多表位疫苗序列使用通过上述采用的免疫信息学方法预测的CTL、HTL和线性B细胞表位仔细构建疫苗序列。这些CTL、HTL和B细胞表位分别借助于AAY、GPGPG和KK [61]作为接头连接，并借助于EAAK接头加入佐剂[34，62]在Notepad++版本7.8中。（图 2）的情况。1.10. 理化性质和结构域鉴定使用在线网络工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）评价最终疫苗构建体的理化特性，如疫苗的氨基酸组成、理论pI、分子量、不稳定指数、半衰期（体外和体内）、脂肪族指数和总平均亲水性（GRAVY）[63，64]。另外，疫苗构建体在E.通过SCRATCH套件中的SOLpro（http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/）工具预测了大肠杆菌[64，65]。1.11. 构建疫苗预测PSIPRED是一种免费获得的网络工具（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/），用于以高准确度预测给定氨基酸序列的蛋白质二级结构，用于预测构建疫苗的二级结构。PSIPRED 4.0使用位置特异性迭代BLAST（Psi-Blast）来鉴定和选择与疫苗蛋白具有显著同源性的序列，并在使用异常严格的交叉批准策略评估其性能时获得81.6%的正常Q3评分[66，67]。A.A. Omoniyi等人医学信息学解锁25（2021）1006834图二、 最终多表位疫苗构建体的结构。描述了CTL和HTL表位以及接头1.12. 构建疫苗的三级结构预测、细化和验证使用免费在线服务器RaptorX（http://raptorx.uchicago.edu/）来预测疫苗序列的3D结构。该服务器为蛋白质结构预测和分析提供自动化工具RaptorX还预测输入序列的二级结构、接触、溶剂可及性、无序区域和结合位点[68]。为了使预测的3D模型可视化，使用Pymol软件。使用GalaxyRefine服务器（http://galaxy.seoklab.org/）精炼获得的嵌合疫苗肽的3D模型。该服务器利用CASP10精化方法重建了原始图像，tein用于3D结构的松弛。Galaxy refine是通过利用可用网络工具中的最佳蛋白质结构预测生成的给定结构的全局和局部质量的整体改进的最佳可用服务器之一[69，70]。模型验证是模型构建过程中的关键步骤，因为它可以检测预测的3D模型中的潜在错误[67]，通过在线服务器分三个阶段完成。首先，ProSA网络（prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php）计算特定输入结构的总体质量分数，并将其显示在所有已知蛋白质结构的上下文中。此外，结构的任何有问题的部分都在3D分子查看器中显示和突出显示。如果计算的分数超出天然蛋白质的特征范围，则结构可能包 含 错 误 [34 ， 71] 。 其 次 ， SAVES 服 务 器 v6.0 （ https ：saves.mbi.ucla.edu/）通过分析非键合原子-原子相互作用生成建模蛋白质的总体质量评分，并将其与可靠的高分辨率晶体学结构进行比较[34，72]。第 三 ， 对 （ www.example.com ） 进 行 PROPERTIES 分 析https://saves.mbi。ucla.edu/）生成Ramachandran图以可视化氨基酸的能量上允许和不允许的二面角psi（ψ）和phi（φ）。计算是基于范德瓦尔半径的一面店该服务器使用PROTEINS原理通过Ramachandran图验证蛋白质结构，并分离甘氨酸和脯氨酸残基的图[73，74]。1.13. 精制疫苗构建体与受体的适当的免疫应答的启动取决于抗原分子和特异性免疫受体的相互作用。分子对接是一种计算方法，其涉及配体和受体之间的相互作用，以提供具有测量结合相互作用程度的计算得分的稳定加合物[74，75]。视黄酸诱导基因RIG-I样受体（RLR）可介导抗拉沙病毒感染的高促炎反应[76，77]。因此，使用RIG-I（PDB ID：2 QFB）[78]、主要组织相容性复合物（MHC）I（PDB ID：6P 2F）[79]和II（PDB ID：1AQD）[80]的3D结构作为受体，最终的多表位疫苗抗原作为配体，而多西他赛韦（PunChem CID：121304016）[81]作为标准配体。通过使用CASTp服务器（http://sts.bioe.uic.edu/castp/calculation）预测RIG-I受体中的结合口袋。html）。在CASTp中，空隙被定义为在除去所有水不可及的杂原子后，侧蛋白质分子（模拟为1.4 μ m的球形探针），而口袋是在蛋白质表面区域的开口处具有收缩的凹穴。CASTp在提供表面可及结合口袋的识别和测量以及蛋白质分子内部不可及空腔的信息方面非常出色[82]。使用PatchDock（http：bioinfo3d.cs.tau.ac.il/PatchDock/）服务器进行精制疫苗肽与RIG-I、MCH I和MCH II受体的分子对接，而使用PyRX中的Autoblastin[83]进行与多西他赛韦的对接。PatchDock的分子对接计算包括四个基本阶段，即原子形状描绘、表面键配位以及分离和打分。PatchDock根据适当的表面形状将两个输入分子的表面分成小块。只有在识别所有这些小块之后，才能通过使用形状匹配算法[83]来实现它们的叠加。此外，FireDock（分子对接中的快速相互作用细化）网络工具（http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/FireDock/）用于优化以及重新评分刚体分子对接解决方案。它提供了最佳的十个解决方案，用于基于绑定值的最终细化[84]。PDBsum（http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html） 和 PDBePisa（https://www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/）用于生成交互的图形表示，[85，86]第85，861.14. 分子动力学模拟分子动力学（MD）的研究是必不可少的，以检查在硅分析的蛋白质-蛋白质复合物的稳定性。使用GROMACS软件（版本20.4）进行最终疫苗构建体和疫苗-RIG 1复合物的MD模拟分析[87，88]。OPLS-AA/L[89]采用SPCE水模型，在模拟过程中使用力场。十二面体盒，疫苗构建体的表面和边缘与对接的配合物 在用Na+和Cl-离子中和该体系后，使用Genion工具，对所有系统进行能量最小化。将系统平衡为100 ps等温-等容（NVT）系综，然后平衡为100 ps等温-等压（NPT）系综，保持恒定的300 K温度和1 atm压力。最后，对疫苗构建体和疫苗-受体复合物进行100 ns的MD模拟，时间间隔为2 fs。进行均方根偏差（RMSD）和均方根波动（RMSF）分析以检查蛋白质骨架的标准偏差和波动，并且进行回转半径以检查疫苗构建体的折叠紧密性1.15. 疫苗构建体候选物的计算机克隆优化使用Java密码子适配工具服务器（http://www.jcat.de/）进行反向翻译和密码子优化，以在选定的表达载体中表达多表位疫苗构建体[90]。进行密码子优化以在E. coli（K12株）宿主的密码子使用情况与E.大肠杆菌中的疫苗构建体不同于天然宿主拉沙病毒的疫苗构建体，最终疫苗构建体的序列来源于天然宿主拉沙病毒。 三个额外的选择是A.A. Omoniyi等人医学信息学解锁25（2021）1006835++=-选择以避免Rho非依赖性转录终止、原核生物核糖体结合位点和限制酶切割位点。JCat输出包括密码子适应指数（CAI）和GC含量百分比，其可用于评估蛋白质表达水平。CAI提供了密码子使用偏好的信息;理想的CAI评分是1.0，但>0.8被认为是一个很好的分数[91]。 a的GC含量 序列在30%到70%之间。超出此范围的GC含量值表明对翻译和转录效率的不利影响[92]。在大肠杆菌中克隆最终疫苗构建体的优化基因序列。colipET-30 a（）载体中，在N端和C端分别引入Nde I和Xho I酶切位点。最后，使用SnapGene工具将具有限制性位点的优化序列插入pET-30 a（）载体中，以确保疫苗表达[74]。1.16. 免疫模拟进一步验证疫苗构建体的免疫原性和免疫应答概况，使用C-ImmSim服务器（http://150.146.2.1/C-IMMSIM/index.php）进行计算机模拟免疫模拟C-ImmSim是一种基于代理的模型，它使用位置特异性评分矩阵（PSSM）进行免疫表位预测，并使用机器学习技术预测免疫相互作用。它“同时 模拟 三 隔室 的 代表三在哺乳动物中发现的不同的解剖区域：（i）骨髓，其中造血干细胞被刺激以产生新的淋巴样和髓样细胞;（ii）胸腺，其中幼稚T细胞被选择以避免自身免疫;和（iii）三级淋巴器官，如淋巴结每隔4周注射3次[94]。所有模拟参数均设置为默认值，时间步长设置为1、84和168（每个时间步长为8 h，时间步长1为注射时间0）。此外，间隔四周注射12次所设计的肽，以模拟在典型流行区中观察到的抗原的重复暴露，以探测克隆选择。2. 结果2.1. 蛋白质序列从UniProt数据库检索拉沙病毒的四种蛋白质（糖蛋白前体、核蛋白、病毒基质蛋白和病毒RNA聚合酶）的氨基酸序列，并用于预测用于设计多表位亚单位疫苗的B和T细胞表位从UniProt数据库（P60022）检索人β-防御素1，并基于其能力用作免疫相互作用的佐剂以诱导抗病毒免疫应答[95]。2.2. 毒力因子vaxign-ML分析预测了四种拉沙病毒蛋白（GPC，NP，Z和L蛋白）作为具有高蛋白原性评分的保护性抗原。GPC和Z蛋白被预测为粘附蛋白（表1）。粘附素在病毒粘附宿主细胞和使病毒进入宿主细胞中起着至关重要的作用[96]。所有预测的蛋白质都不同于人、小鼠或猪的蛋白质。表1拉沙病毒蛋白的Vaxign-ML预测和粘附概率2.3. 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位预测使用NetCTL v2.0服务器从四种拉沙病毒蛋白预测总共96个独特的CTL表位（9聚体）。其中，仅发现42个表位为抗原性、免疫原性和非致敏性的，而发现24个表位为非致敏性的（补充表1）。从这些表位中，基于高免疫原性评分选择12个非变应原性表位作为疫苗构建的CTL表位（表2）。2.4. 辅助性T淋巴细胞（HTL）表位预测从四种拉沙病毒蛋白中预测出总共123个HTL表位（15-mer），并且发现其是非过敏性的、抗原性的和非毒性的（补充表2）。 其中，只有23人被发现是IFN-γ阳性表位。其中，14个非重叠表位人等位基因HLA-DRB 1 *03：01，HLA-DRB 1 *07：01，HLA-DRB 1*015：01，HLA-DRB 3 *01：01，HLA-DRB3*02：02，HLA-DRB4*01：01和HLA-基于高百分位等级评分，选择DRB 5 *01：01、非过敏性、抗原性和非毒性作为用于疫苗构建的HTL表位（表3）。2.5. 毒性预测使用ToX inPred服务器确认所选的12个CTL和13个HTL表位的非毒性性质。从Tox-inPred获得的12个CTL表位的结果示于表1，14个HTL表位的结果示于表2.这些表位被认为是安全使用的。2.6. 多表位亚单位疫苗为了形成最终的疫苗构建体，使用EAAAK接头将佐剂蛋白（人β防御素1）与第一CTL表位连接。EAAAK接头用于产生高水平表达并提高融合蛋白的生物活性。选择的12个CTL表位通过AAY接头连接，13个HTL选择的表位也通过GPGPG接头连接。引入AAY和GPGPG接头以产生具有最小连接免疫原性的序列。最终的疫苗构建体含有602个氨基酸残基，其结构如图1所示。 二、2.7. 拉沙病毒蛋白B细胞表位预测在ABCpred服务器预测的线性B细胞表位中，选择预测为抗原、非过敏性和非毒性的16-mer长度的表位Ellipro套装用于预测构象B细胞表位。预测了总共五个不同残基长度的不连续B细胞表位其中评估了残基长度为48、47和55个残基的三个表位，得分分别为0.721、0.688和0.693（图3）。此外，在不连续表位的第一条链中，起始残基和末端残基分别为蛋氨酸和甘氨酸，残基评分分别为0.630和0.073。第二条链以丙氨酸开始，以赖氨酸结束，显示残基评分为0.444和0.955。第三条链以丙氨酸开始，以脯氨酸结束，残基分数为0.357和0.357。蛋白编码蛋白质名称蛋白原性评分粘附概率2.8. 疫苗构建体GPC糖蛋白前体病毒基质89.6 0.63376.3 0.583AlgPred服务器用于检查疫苗构建体的变应原性。构建的多表位NP核蛋白94.9 0.204L病毒RNA聚合酶89.6 0.168疫苗为0.846。从服务器获得的每个CTL和HTL表位的分数在补充表1和2中给出A.A. Omoniyi等人医学信息学解锁25（2021）1006836-表2选择用于多表位疫苗构建的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位ID肽序列综合评分抗原性免疫原性过敏性1ITEVEYLLY 3.692 0.960 0.152非过敏原2LIDGRTTY 2.943 1.073 0.229非过敏原3RTLLEFHYY 1.860 0.723 0.218非过敏原4YADLNFGEK 0.953 2.604 0.187非过敏原5ESTTNPPPY 1.136 0.793 0.019非过敏原6ALTDLGLIY 1.802 1.284 0.124非过敏原7MRMAWGGSY 0.853 0.763 0.162非过敏原8CSTTYKGVY 2.624 0.412-0.102非过敏原9MTSYQYLII 1.588 0.601-0.105非过敏原10SWDCIMTSY 1.518 1.430-0.147非过敏原11FSRPSPIGY 1.254 1.612-0.034非过敏原12VQYNLSHTY 0.844 0.923-0.124非过敏原致xicity非对Xic非对Xic非对Xic 非 对Xic 非 对Xic 非 对xic 非 对 XIC非对x ic非对Xic非对Xic非对Xic 非 对Xic表3用于多表位疫苗构建的选择的辅助T淋巴细胞（HTL）表位S/N等位基因肽Pt rank过敏性抗原性1 HLA-DRB1*15：01 EKHILPFMSDLASTK 3.30-0.55 0.5692 HLA-DRB3*01：01 ERPMFKFDLMMGYAW 0.46-0.53 0.4263 HLA-DRB1*03：01 IQSSGGSLRLKGRTC 38.00-0.41 0.6984 HLA-DRB5*01：01 ISYMCHFITKETPDR 34.00-0.57 0.5225 HLA-DRB3*01：01 QTKDPKAESSPRASL 66.00-0.81 0.6886 HLA-DRB4*01：01 AQPGLTSAVIEALPR 27.00-0.10 0.4867 HLA-DRB3*02：02 GWPYIASRTSIVGRA 0.35-0.66 0.9778 HLA-DRB5*01：01 LVELKSTQQKSILRV 14.00-0.60 0.43289 HLA-DRB4*01：01 IRRLKTEAQMSIQLI 0.68-0.46 0.50810 HLA-DRB1*03：01 RDIYISRRLLGTFTW 1.40-0.53 0.54011 HLA-DRB1*03：01 DIYISRRLLGTFTWT 3.00-0.44 0.44512 HLA-DRB1*07：01 WEDHCQFSRPSPIGY 4.70-0.53 0.89213 HLA-DRB1*07：01 NVATCGLFGLVSFLL 7.80-0.52 0.53614 HLA-DRB1*07：01 GIYNVATCGLFGLVS 9.70-0.49 0.605Pt等级：百分位数等级评分，IFN-γ：干扰素-γ。致xicityNon-to-XicNon-to-XicNon-to-XicNon-to-XicNon-to-XicNon-to-xicNon-to-xicNon-to-XICNon-to-x ic Non-to-XicNon-to-XicNon-to-xicNon-to-XicIFN-γ正 面 正面 正 面正 面 正面 正 面正 面 正面 正 面正 面 正面 正 面正 面 正面 正 面正 面 正面 正 面正 面 正面表4ABCPred服务器预测的16聚体长度的线性B细胞表位该构建体在表达后将保持稳定。脂肪族指数为74.3显示出在不同温度下的热稳定性质。 疏水性的总平均值（GRAVY）计算为负值S/序列评分抗原性抗原性N--致xicity（0.185）。该负值表示蛋白质的亲水性;因此，该蛋白质倾向于与其他蛋白质具有更好的相互作用。通过SOLpro服务器计算的溶解度为0.60，表5。2.11. 二级结构预测PSIPRED服务器用于预测疫苗构建体的二级结构。从服务器获得的结果显示，多表位疫苗含有α螺旋（32.1%）、β链（15.6%）和卷曲（52.3%）（图4）。多表位疫苗还含有小的非极性（43.7%）、疏水性（19.8%）、极性（21.9%）和芳香族加半胱氨酸（14.6%）残基。2.9. 疫苗构建体的抗原性使用VaxiJen服务器来预测我们的最终多表位疫苗的抗原性质。预测得分为0.65。结果表明，候选疫苗具有很强的抗原特性，这将有助于激发免疫反应。从服务器获得的每个CTL和HTL表位的评分见补充表1和22.10. 理化参数和溶解度的预测从ProtParam服务器获得的最终疫苗构建体的理化性质表明分子量为65.2 kDa，理论突出指数（PI）为9.51，表明疫苗构建体是碱性的。在E.大肠杆菌的不稳定性大于10 h，不稳定指数为38.9，这意味着2.12. 构建疫苗的三级结构建模、细化和验证RaptorX服务器基于多模板方法预测了所设计的嵌合蛋白的五种三级结构模型，并用于同源性模型。五个预测模型估计的RMSD范围为10.5至12.5 μ m。选择具有来自同源性建模的最佳估计RMSD的模型用于进一步细化。使用Gal- axyRefine服务器细化疫苗构建模型的三维结构，生成五个模型。基于所有改进模型的模型质量评分，基于各种参数包括GDT-HA（0.897）、RMSD（0.543）、Mol-概率（3.14）、冲突评分（59.2）、差旋转异构体评分（4.0）和Ramachandran图（93.2%），选择模型1为最佳。该模型被选为最终疫苗1 TKDPKAESSPRASLIP0.910.8703-0.57非Xic2 QRTRDIYISRRLLGTF0.810.64250.41非Xic3 DHCQFSRPSPIGYLGL0.750.9244-0.43非Xic4 LGLVDLFVFSTSFYLI0.630.4118-0.52非Xic5 RPSPIGYLGLLSQRTR0.622.0552-0.40非Xic6 EYIDRQGKTPLGLVDL0.610.98430.47非XicA.A. Omoniyi等人医学信息学解锁25（2021）1006837--表5图三. 预测的构象B细胞表位在最终疫苗结构中被描绘为有色球体。进一步的分析，从分子对接研究的基础上结合，疫苗构建体蛋白的理化性质得分。多表位疫苗候选物的选择的复合物S/理化性质结果RIG-I的结合能为-17.76kcal/mol，N1氨基酸数量2分子量65.2 kDa3理论突出指数（PI）9.51Waals力是29.81千卡/摩尔，排斥范德华力为6.35 kcal/mol，原子接触能为8.33 kcal/mol，而多表位疫苗和多西他赛韦的结合为在线数据库PDBePISA用于生成交互4带负电荷的残基总数（Asp 35对接配合物和SIX与氢的相互作用位置之间+Glu）5带正电荷的残基总数（Arg 666+赖氨酸）在RIG-I与多表位疫苗中注意到了4个键，在MCH-I与多表位疫苗中注意到了4个键，在MCH-II与多表位疫苗中注意到了11个键。化学式C2964 H4560 N782 O826 S277原子总数8表位疫苗结构分析显示，在RIG-I与多表位疫苗复合物中，Phe 913与估计半衰期（哺乳动物网织红细胞，体外）30小时Ser 349的距离分别为3.20 nm和2.28 nm，而Lys 8039估计半衰期（酵母，体内）>20小时10估计半衰期（大肠杆菌，体内）>10小时11不稳定指数38.912脂肪族指数74.313亲水性总平均值（重力）-0.18514过表达时的溶解度模型进行进一步分析。图 五、通过ProSA-web和SAVES验证疫苗构建3D模型的质量和潜在误差。在细化之后，所选模型的ProSA网络分析具有8.27的Z分数（图6A），而SAVES揭示了66.7%的总体质量因子。Ramachandran图分析表明，86.8%的蛋白质中的残基是在最有利的区域和12.4%的其他允许的区域。此外，预计0.6%的残基位于允许的区域，仅0.2%位于不允许的区域（图11）。 6 B）。2.13. 精制模型疫苗与免疫受体（RIG-I）的分子对接CASTp服务器用于确定蛋白质表面上的蛋白质结合和疏水相互作用位点。该口袋的分子表面积为3858 × 10 -2，分子表体积为4679 <$3的口部分子面积约为7014 <$2，分子周长和为109 <$2。为了评估相互作用-在精制模型和RIG-I （PDB ID：2 QFB）免疫受体之间，通过使用PatchDock服务器进行分子对接。产生了一百个模型，根据它们的蛋白质表面、几何形状和静电互补性对其进行评分。 将前10个复合物进一步提交至FireDock服务器，用于优化和重新评分受体与多表位疫苗候选物的对接溶液。最佳对接解决方案被选中，Gln368在3.71 ℃形成氢键。类似地，Asp 836而在MCH-I与多表位疫苗相比，Gln 155分别与Leu 314和Ser 326形成3.88和3.49碱基的氢键Pro 15-Lys 567和Glu 154-Ser 283在3.85 ℃形成氢键，2.39埃。最后，对于具有多表位疫苗复合物的MCH-II，Glu 3-Gln 321和Thr113-Pro398在2.86 nm处形成氢键，3.84 Glu172分别与Arg 400和Asp 401形成氢键，而Glu172分别与Arg480和Lys 532形成氢键，Glu172分别与Arg 400和Lys 532形成氢键。类似地，Lys-176-Lys、His 177-Asp 533和Glu 143-Gly 399分别在3.22 π、2.23 π和2.67 π处形成氢键。G88-Gly 477在2.90 nm处形成氢键，而Pro 170与Lys 532在2.90 nm处形成氢键。2.98（见Fig. 7）。2.14. 分子动力学模拟对多表位疫苗复合物中的受体进行了分子动力学模拟稳定性和残留流动性试验。复合物的均方根偏差（RMSD）见图8。在多表位疫苗最终模型中，发现系统在100 ns时间段内的平均RMSD为1.01 nsRIG-I受体-多表位疫苗复合物中为0.84 μ g在MHC-I -多表位疫苗复合物中为0.50 μ g，在MHC-II -多表位疫苗复合物中为0.50 μ g。2.15. 最终疫苗构建体的密码子优化和计算机克隆使用Java密码子适应工具优化疫苗构建体在E.大肠杆菌（菌株K12）的最大蛋白A.A
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