碳水化合物涂层对 L-天冬酰胺酶动力学和结构的保护作用的动态仿真

医学信息学解锁25（2021）100689研究碳水化合物涂层对L-天冬酰胺酶结构和动力学的保护作用动态仿真Sajad Moradia，Parisa Moradi b，Mohabbat Ansari a，Rasool Khosravi b，Negin Farhadian c，Nasim Batooiea，Mohsen Shahlaeid，*a纳米药物递送研究中心，健康技术研究所，Kermanshah医学科学大学，Kermanshah，伊朗b伊朗克尔曼沙阿医科大学药学院卫生研究所药物科学研究中心c伊朗克尔曼沙阿医科大学卫生研究所药物滥用研究中心d医学生物学研究中心，保健技术研究所，克尔曼沙阿医科大学，伊朗A R T I C L EI N FO保留字：L-天冬酰胺酶热应激药物释放系统多糖基聚合物分子动力学模拟A B S T R A C T左旋门冬酰胺酶是治疗白血病的重要药物之一，应用广泛.与其他蛋白质药物一样，这种酶在体外储存/运输和体内存在困难，这可以通过用各种可生物降解材料制备的药物递送系统来辅助。在这项研究中，五种常见的碳水化合物生物聚合物的相互作用和温度稳定效果进行了研究，使用计算分子动力学模拟。为此目的，在300和363K两个温度下研究了游离态和与果胶、海藻酸钠、透明质酸、菊粉和壳聚糖复合的L -天冬酰胺酶蛋白。分子模拟结果表明，温度的升高导致L-天冬酰胺酶动力学和结构的不稳定。在所研究的多糖中，透明质酸和菊粉对蛋白质结构的保护作用最强。相比之下，壳聚糖和海藻酸钠在热应激下维持蛋白质结构的能力较低。最后，根据本研究的结果，建议透明质酸和菊粉多糖可以是制备L -天冬酰胺酶的药物制剂的良好候选物，以防止其在较高温度下的结构变性。1. 介绍癌症作为人类最致命的疾病之一，是环境因素和遗传疾病促进的过度控制的细胞分裂的结果[1]。尽管化疗是治疗各种癌症的常用方法，但由于其非特异性、高细胞毒性和严重的副作用，化疗的使用仍然面临着严峻的挑战，需要更好的替代方案和进展。尽管开发了新的治疗剂和设备，但包括癌症在内的太多疾病的完美治疗仍然存在问题[2]。药用酶被用作各种疾病的有效药物，如癌症和心肌梗死[3]。天冬氨酸酶（L-ASNase）是一种有效的抗癌药物，对人和动物的某些淋巴瘤和白血病有较好的审判与其他药物联合使用，L-ASNase用于治疗急性淋巴细胞白血病（主要在儿童中）， sar-昏迷，霍奇金单核细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、淋巴肉瘤和黑色素肉瘤化疗[4]。这种酶属于淀粉水解酶的同源家族，并将L-天冬酰胺转化为天冬氨酸和氨[5]。近年来，人们对其抗癌潜力给予了极大的关注[6]。与其他蛋白质一样，由于其固有的不稳定性、多功能代谢特性和有限的胃肠道摄取，L-ASNase在药物储存/运输期间和治疗期间都存在特定问题[7]。在蛋白质类药物常见的变性剂中，杂质、pH和热应力是导致其结构不稳定的最主要原因。然而，控制pH值和在实验室中进行更多的纯化是可以实现的，相反，* 通讯作者。药物化学系，药学院，Kermanshah医学科学大学，67346-67149，Kermanshah，伊朗。电子邮件地址：mohsenshahlaei@yahoo.com，mshahlaei@kums.ac.ir（M。Shahlaei）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100689接收日期：2021年5月8日;接收日期：2021年7月27日;接受日期：2021年8月1日2021年8月11日在线提供2352-9148/©2021的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：www.elsevier.com/locate/imuS. Moradi等人医学信息学解锁25（2021）1006892=环境温度不是这样可预测的，这使得热应激对于蛋白质药物制剂是最具挑战性的条件[8，9]。因此，重要的是要保护这些药物免受环境损害，以保持药物的结构及其对身体的适当作用。处理这些问题的最常见的方法之一是使用药物递送系统和制剂。这些系统从各种可生物降解的材料（如天然和合成聚合物和脂质）中获得帮助，在药物周围创建智能网络，此外还增加了药物在血液中的循环时间，保护它们免受内部和外部压力[10，11]。现在使用各种药物递送方法以更好地将药物转移到疾病部位，并且在这种情况下，聚合物由于其期望的物理化学和生物学性质而被广泛使用[12]。除了克服上述问题之外，聚合物药物递送系统还能够通过增加药物生产率或减少其副作用来改善其货物的治疗功效[12]。生物高分子材料具有良好的生物相容性、生物降解性和生物安全性，是目前人类生活中应用最广泛的材料它们在制药科学中广泛用作许多商业药物的保守剂和/或质量剂赋形剂[13，14]。碳水化合物生物聚合物是生物体中最丰富的多糖，在其体内发挥功能和结构作用[15]。真菌体内天然甲壳素的脱乙酰衍生物，节肢动物和一些其他生物称为壳聚糖（CS），因为其分子上具有净正电荷以及优异的生物安全性，目前用于各种药物研究[16]。藻酸盐（AG）是从褐藻中提取的该聚合物由以下组成：β-D-甘露糖醛酸（M）与α-L-古洛糖醛酸（G）的（1→ 4）-连接，由于其容易被安全的Ca++阳离子凝胶化，因此被广泛用于药物递送系统的制备[17]。菊糖（Inulin，IN），另一种天然-聚合多糖是由β-（2→1）键连接的葡萄糖部分终止的重复聚果糖组成。它被美国食品和药物管理局（FDA）视为安全（GRAS）[18]。透明质酸（HA）的非硫酸化阴离子糖胺聚糖是一种聚合碳水化合物，广泛用于开发各种药物配方。HA是二糖由交替的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺通过β-（1→4）和β-（1→3）糖苷键连接而成的聚合物[19]。另一种药用多糖，果胶（PT）由α-（1→4）D-半乳糖醛酸的糖苷键，主要存在于植物的细胞壁它在制药和食品工业中用作增稠剂、胶凝剂和稳定剂[20]。计算方法是当今研究各种分子和原子现象的最有用的方法之一，其中一些现象是无法通过实验研究的。这些方法也受益于它们的时间和成本效益，现在用于生物医学。逻辑和药学科学广泛[21其中，经典的对接和分子动力学模拟方法是适用于高分子量聚合物，目前用于评估不同蛋白质在配体存在下的稳定性[26，27]。鉴于开发蛋白质类药物新剂型的重要性，本研究采用分子动力学模拟方法，研究了壳聚糖、海藻酸钠、菊粉、透明质酸和果胶 等5 种常见 碳水化合物 生物聚合物对 L- 天冬氨 酸酶（L-ASNase）为了这个目的，蛋白质在300和363 K的两个温度下在存在和不存在生物聚合物的情况下进行模拟，然后比较在每个条件下蛋白质结构的变化。2. 方法蛋白质坐标文件以PDB格式（PDB ID：400h）从Brookhaven蛋白质数据库（http://www.rcsb.org/pdb）获得[28，29]。方案1. 方法学示意图MD模拟的示意图在方案1中表示。将四个六聚体多糖分子随机插入以一个蛋白质分子为中心的模拟框中。为了制备多糖的坐标文件，首先通过ACD/Labs Chem-sketch工具绘制其二维结构[30]。然后，将准备好的文件转移到Avogadro版本1.1.1中进行3D几何优化[31]。从PRODRG服务器获得关于多糖的拓扑结构的信息[32]。 所有模拟均使用GROMACS软件版本5.1.5（www.gromacs.org）和gromos 53 a6力场[33时间步长为2 fs，持续100 ns。蛋白质的N-末端和C-末端被处理为在自然生理pH下的正质子化和负去质子化残基进行模拟分别对300和363 K下的游离蛋白质和363 K下的蛋白质-多糖复合物在8nm3水介质中进行了计算，采用SPC/E模型，在X，y，z三个方向上都考虑了周期性边界条件然后通过加入不同量的Na或Na+中和该体系。Cl抗衡离子基于蛋白质和多糖的最终电荷。能量最小化计算使用最陡的下降算法由emtol 100 kJ mol-1 nm-1。的压力和分别在NVT和NPT集合中使用Parrinello-Rahman和Nose-Hoover算法进行温度调节[36，37]。温度在300和363 K下调节，压力也在2 fs的时间步长中在1 bar下耦合。静电和范德华相互作用都测量到1 nm的截止距离。通过LINCS算法[38]将所有键长限制为平衡值。最后，在蛙跳算法中进行生产运行100 ns。应该注意的是，首先通过在343、353和363 K的几个初步模拟确定破坏蛋白质结构的最低温度。这些模拟是在上述其他人的相同条件下进行的。通过对RMSD、RMSF、PCA、Rg和DSSP的分析，证实了在100 ns的模拟时间内，363 K是可以观察到蛋白质不稳定迹象两 维 相互作用 之间 蛋白 和 配体通过LigPlot程序版本4.5.3（位于英国剑桥郡的欧洲生物信息学研究所）进行评估[39]。使用VMD 1.8.6软件（伊利诺伊大学香槟分校）绘制模拟输出坐标文件[40]。使用PRO-Rank v.3.5软件对蛋白质结构进行Ram- achandran分析。3. 结果和讨论为了研究高温下多糖对L-天冬氨酸酶结构和动力学的影响，S. Moradi等人医学信息学解锁25（2021）1006893Fig. 1. 聚合物和蛋白质在三个不同模拟时间的相互作用的快照。t= 0 s; t= 50 ns和t= 100 ns。蛋白质用红色的丝带表示，聚合物分子用球和棒表示，用绿色表示。(For关于这一图中颜色的解释，请读者参阅本文的网络版模拟结果表明，所研究的聚合物均能与蛋白质相互作用，并影响蛋白质的动力学和构象。在三个时间步长的模拟中，蛋白质与生物聚合物相互作用的示意图如图1所示。然后对轨迹进行了详细分析，其结果解释如下。3.1. RMSD模拟过程中的RMSD在MD轨迹中，平衡度是系统平衡的重要指标之一。事实上，它显示了每个粒子的位置相对于其原始位置在任何时间点的偏离程度。在模拟过程中，一个或一组原子的RMSD值越大，它们与初始位置的偏差就越大，波动就越大。在这些值中，蛋白质结构越不稳定。事实上，RMSD图的斜率和振幅表明了MD模拟过程中的模型。斜率越接近零，图中的振荡越低，系统在模拟过程中越稳定和平衡[41]。在300和363 K两个温度下对游离和多糖结合蛋白质结构中的C-α进行RMSD分析，结果见图2。可以看出，在300 K的常温下，游离蛋白质的RMSD值在大约30 ns后达到平衡状态，只有轻微的波动，并且图的斜率大约接近于零（图2Aa）。在363K时，可以看到RMSD图的更高的波动和突变以及更陡的斜率，这是该温度下蛋白质结构不稳定性的指标。该结果与已发表的高温下蛋白质不稳定性的实验数据一致[42，43]。如可见于图 对于L-天冬氨酸酶-藻酸盐复合物，波动更严重，图的斜率更陡，如表S1所示，RMSD的标准差和平均值也S. Moradi等人医学信息学解锁25（2021）1006894图二. （A）300（a）和（b）343 K时游离蛋白质的RMSD。(B)（a）LAsp -藻酸盐复合物（b）LAsp -壳聚糖复合物（c）LAsp-透明质酸复合物（d）LAsp-菊粉复合物（e）LAsp-果胶复合物在343 K下的蛋白质-聚合物复合物的RMSD高于300 K时游离L-天冬氨酸酶的然而，在363 K下的两个值都低于300 K，表明藻酸盐能够在蛋白质结构中提供一定的稳定性。在363 K下蛋白质与壳聚糖和果胶复合的情况下，平均值和标准偏差高于300 K下游离蛋白质的平均值和标准偏差（图2和表S1）。根据从模拟获得的数据（图1）和表S1的结果，观察到RMSD图显示当使用菊粉和透明质酸时波动较小，并且在高温下RMSD值低于蛋白质。当使用菊粉时，蛋白质的行为最初在300 K下更类似于游离蛋白质的行为，并且如图2所示，它在图中具有较低的斜率。但随着时间的推移，曲线的斜率会增加。在透明质酸的情况下，该图在短时间内达到相对稳定的斜率，并且如表S1所示，在300和363 K下都具有比游离蛋白更低的标准偏差和更低的平均值L-天冬酰胺酶由308个氨基酸组成，其中α和β-天冬酰胺酶都含有存在β结构。除了它们的构象的多样性之外，由于氨基酸倾向于发生在α或β结构中，这影响了配体与每一个的相互作用，所以聚合物有可能优选与蛋白质的不同部分相互作用。为了更精确地研究聚合物对这些结构的影响，分别对每个α和β链进行RMSD分析。模拟过程中蛋白质α链RMSD的平均值和标准差报告见表S1和图S1。从图中可以看出，如表S1A和S1B以及表S1所示，α链的RMSD变化的总体趋势与整个蛋白质的RMSD变化一致。但总的来说，可以说蛋白质的α结构受温度变化的影响最大。基于表S1和图S2中报告的标准偏差和平均值，通常可以说， 多糖对L-天冬酰胺酶的保护作用更强。在壳聚糖的情况下，在300和363 K时，游离蛋白质的波动和平均RMSD增加。在藻酸盐和果胶的情况下，平均蛋白质波动在300 K时增加，但在363 K时相对于游离蛋白质降低。在这两个温度下的波动相对于游离蛋白质在含菊糖体系中，蛋白质的平均波动和标准差在两个温度下几乎没有变化，但蛋白质的平均值在两个温度下都有所下降。在透明质酸聚合物的情况下，标准偏差和平均值均降低，并在300 K下变得接近游离蛋白质的值。与其他多糖相比，它对含有透明质酸的系统也具有相对稳定的斜率图。RMSD分析给出了整个系统原子在模拟时间内波动的平均估计，但没有说明蛋白质的哪些部分比系统的其余部分具有更多或更少的波动。因此，RMSF用于量化蛋白质结构中每个残基的波动。3.2. RMSFRMSF（波动的均方根）计算Cα标准品 偏差 在 平均位置 生产阶段。根据表S1和图3RMSF值的结果，可以得出结论，温度升高会增加蛋白质中大多数氨基酸的波动，表明系统不稳定。蛋白质氨基酸的波动也会影响蛋白质的正确结合。S. Moradi等人医学信息学解锁25（2021）1006895图三. 游离蛋白质（A）在300 K（a）和（b）在363 K的RMSF。（a）LAsp -藻酸盐复合物（b）LAsp-壳聚糖复合物（c）LAsp -透明质酸复合物（d）LAsp -菊粉复合物和（e）LAsp -果胶复合物在363 K下与不同聚合物复合的蛋白质的RMSF（B）（红色条表示β结构，蓝色条表示α结构）。（有关此图例中颜色的解释，请读者参阅本文的Web版本底物的活性位点，并导致酶的失活。加热蛋白质的标准偏差和平均值分别比常温蛋白质0.042和0.098，表明蛋白质在高温下的蛋白质结构不稳定。与游离蛋白质相比，在添加壳聚糖、果胶和海藻酸钠的情况下，两者的标准偏差均为0.114，0.161和0.111和平均值0.220，0.221，和0.219增加在大多数氨基酸在两个温度。用菊粉和透明质酸作稳定剂，在363 K时，大部分区域的波动强度都有所下降，标准差分别下降0.110、0.105，平均值分别下降0.182和0.188在RMSF分析中，分别研究了多糖对α和β的每个二级结构的影响。在图3中，红色条代表β折叠，蓝色条代表α螺旋。如图所示，多糖对β结构中氨基酸的总体积极作用大于α螺旋。从该图中还可以看出，α螺旋比β折叠更容易受到热应力的影响。3.3. 碰撞的距离和次数为了保证多糖和蛋白质之间的紧密相互作用，研究了模拟过程中蛋白质和多糖的质心之间的平均距离以及它们之间的原子碰撞次数。如图4A中所示，与聚合物的平均蛋白质距离从聚合物聚合的开始降低。模拟，并保持几乎不变，直到最后，表明多糖接近蛋白质从一个较长的距离，并通过形成一个紧密的相互作用，它如图6B所示，标准化碰撞数的增加强烈表明多糖分子与蛋白质结合并最终形成最终稳定的复合物。这些碰撞基于每种多糖中的原子数进行归一化。因此，聚合物与L-天冬氨酸酶的碰撞次数越高的可能性是由于多糖中的原子数越高而被排斥。壳聚糖与蛋白质的碰撞次数较多可能是由于分子带相反的电荷，它们之间的静电吸引力较大，因为壳聚糖是带正电荷的多糖，而蛋白质L-天冬氨酸酶带负电荷。3.4. 主成分分析主成分分析（PCA）或基本动力学检测MD轨迹中所有原子运动之间的相关性。PCA分析通过将MD模拟期间的原子运动投影到前几个PC上来[44图 S3，将所有系统中蛋白质的本征值相对于本征向量的数量作图。结果表明，蛋白质的运动主要发生在少数几个特定的方向上，只有少数几个特征向量具有较大的特征值S. Moradi等人医学信息学解锁25（2021）1006896见图4。（A）（a）LAsp -藻酸盐复合物（b）LAsp -壳聚糖复合物（c）LAsp -透明质酸复合物（d）LAsp -菊粉复合物（e）LAsp -果胶复合物的蛋白质和聚合物的质心之间的平均距离。(B)（f）LAsp -藻酸盐复合物（g）LAsp-壳聚糖复合物（h）LAsp-透明质酸复合物（i）LAsp-菊粉复合物（j）LAsp-果胶复合物中蛋白质和聚合物的原子之间的归一化碰撞数。（主成分）在相空间和大多数的内部运动的蛋白质被限制在小尺寸。给出它们的本征值的数值（图S3），可以得出结论，在几乎所有的系统中，只有前三到四个光子晶体解释了总运动的基本动力学。应当指出，主成分的特定矢量的数值越大，该方向上的移动和波动的比例就越大。在透明质酸复合物体系中由第一特征向量解释的总方差的比例大于其余复合物，然后将解释的比例降低到300 K下的游离蛋白水平。也就是说，这两个系统具有相同数量的显著主成分。蛋白质运动的二维分析结果在不同的系统中得到，并报告在图1中。 五、可以看出，在常温下游离蛋白质的情况下，簇更靠近在一起，并且它们之间的边界不清楚，表明相空间中原子运动的范围较低。随着温度的升高，更多的相空间被跨越，团簇变得更加清晰，表明原子运动范围的增加。在热条件下，蛋白质的基本动力学模式也与正常状态下的模式有所不同。由于蛋白质运动的主要成分是其准确功能的关键因素，这些运动的两个方向和/或域的变化可以使其结构不稳定并导致蛋白质故障。因此，很明显，在较高的温度下，蛋白质运动的主要成分发生相对严重的变化，这表明其结构和正确功能的不稳定性。当在363 K下使用多糖时，运动轨迹的形状在300 K时，聚合物的分子量与游离蛋白的分子量更接近，表明聚合物在保持蛋白质运动与正常状态相似方面表现出更好的性能。根据主成分的2D投影产生的图，可以得出结论，当蛋白质与透明质酸复合时，其行为与300 K下的游离蛋白质最相似。此外，如图8所示，在363 K下，L-天冬酰胺酶-壳聚糖体系产生的簇的形状和位置与游离蛋白非常相似，这意味着壳聚糖在热条件下固定蛋白质运动的能力较差应力3.5. 溶剂可及性表面积溶剂可及表面积（SASA）分析是一种计算工具，其说明蛋白质可以与其环境（溶剂）相互作用的程度，并且自然地与蛋白质与其环境（溶剂）相互作用的程度成比例。暴露在环境中。热应激可以改变蛋白质的结构，如果它被显着改变，蛋白质的功能受到影响。SASA分析的结果报告于表S1和图6中。 在300 K时，游离蛋白的SASA随温度的升高波动增大，而蛋白质的SASA随温度的升高变化（图6A）。这可能是蛋白质结构中相对严重的开放压缩的标志，这可能导致溶剂分子与蛋白质的疏水核心之间的更多接触。随着时间的推移，该事件可导致蛋白质结构变性。在添加多糖和蛋白质与聚合物之间形成复合物之后，并且在进行模拟之后，观察到不同水平的变化（图6B）。在透明质酸和菊糖复合物中，在300 K下，图的平均值和标准偏差与游离蛋白更一致，并且图没有显示出强烈的波动，表明多糖与蛋白的有效结合及其高保护作用。但在藻酸盐、壳聚糖和果胶的情况下，平均分析结果分别较高，这可能是由于蛋白质结构的更多展开和溶剂可用表面的增加，这与下文将描述的回转半径分析的结果完全一致。3.6. 回转半径回转半径（Rg）可以被认为是蛋白质压缩的函数。实际上，蛋白质的Rg被定义为蛋白质原子到所有原子位置的质心的均方根距离。Rg分析的结果报告于表S1和图7中。如图7Aa所示，结果表明，在300 K下，在游离蛋白中，Rg从1.77开始下降到1.72，然后在300 K结束时固定到1.73S. Moradi等人医学信息学解锁25（2021）1006897图五、 L-天冬酰胺酶在相空间中沿着（a）300 K下的游离LAsp和（b）363 K下的LAsp的前两个主特征向量的运动的投影- 藻酸盐复合物（d）LAsp-壳聚糖复合物（e）LAsp-透明质酸复合物（f）LAsp-菊粉复合物（g）LAsp-果胶复合物对于c至g，T= 363 K。仿真这些结果除了表明蛋白质中存在一定程度的压缩外，也是系统平衡的另一个证据。在363 K时，Rg增加到1.82，并继续高波动，表明蛋白质的间歇性压缩，实际上这可能导致结构不稳定。这也与SASA分析完全一致，并且如上所述，蛋白质开放的这种严重波动可导致水分子与蛋白质的内部疏水部分之间更强的分子接触，这可在较高温度下使蛋白质结构永久变性。如图7B所示，与藻酸盐、壳聚糖和果胶复合的蛋白质的旋转半径图这表明多糖对蛋白质结构不具有这样的高温保护作用。透明质酸和菊粉存在时蛋白质的Rg相关图与正常组织中游离蛋白质的Rg相关图一致条件同样如表S1所示，当添加菊粉和透明质酸时，Rg值的变化与300 K下游离蛋白质的结果更一致。该分析的结果与其他结果一致，再次证实了这些生物聚合物在高温下对蛋白质结构3.7. 二级结构1983年，Kebsch和Sander开发了一种称为DSSP的方法，该方法仍然是用于确定蛋白质二级结构的最广泛使用的技术之一。二级结构元素由氢键模式决定。该方法被认为是测定蛋白质二级结构的标准方法[47]，并在此研究了所有研究系统中的L-天冬酰胺酶结构。DSSP分析结果见表1和图2。8.第八条。S. Moradi等人医学信息学解锁25（2021）1006898见图6。蛋白质的溶剂可及表面积（SASA）（A）游离LAsp在300 K（a）和（b）在363 K。（c）LAsp-藻酸盐复合物（d）LAsp-壳聚糖复合物（e）LAsp-透明质酸复合物（f）LAsp-菊粉复合物（g）LAsp-果胶复合物的复合体系（B）中蛋白质的SASA结果。研究二级结构稳定性的一种方法是评估这些结构中氨基酸的数量。从图8A中可以清楚地看出，将温度升高至363 K已经减少了这些结构中残基的总数，这是蛋白质在较高温度下结构失稳的明显迹象。同样，与先前的RMSD和RMSF分析一致，表1中报告的结果证实α螺旋X二级结构比β折叠更受热应力的影响。然而，在模拟过程中，α螺旋和β折叠中氨基酸数量的变化量较低，表明所研究的多糖对热应激具有良好的保护作用。通过检测表1和图2所示的L -天冬酰胺酶蛋白中α螺旋结构中氨基酸数量的变化， 8、有人发现玻尿酸酸能够比其他聚乙烯更好地保持这些结构，并防止它们在高温下展开。但果胶对蛋白质结构的影响较小，导致α螺旋结构中的氨基酸数量减少。还研究了模拟过程中L-天冬酰胺酶蛋白中β-折叠结构的氨基酸数量的变化，结果报告于表1和图8中。结果表明，与其他多糖相比，羟丁酸和果胶能够保持这种结构并防止其在高温下降解。3.8. 调查角度φ和φ二级结构也是由分子的局部旋转决定的。S. Moradi等人医学信息学解锁25（2021）1006899图7.第一次会议。在L-天冬氨酸酶的分子动力学模拟过程中（A）（a）300 K下的游离LAsp和（b）363 K下的游离LAsp的回转半径的变化。（B）（a）LAsp- 藻酸盐复合物（b）LAsp-壳聚糖复合物（c）LAsp-透明质酸复合物（d）LAsp-菊粉复合物（e）LAsp-果胶复合物对于见图8。氨基酸数量的变化涉及L-天冬酰胺酶的（A，B）α螺旋（C，D）β折叠（a）300 K下的游离LAsp和（b）363 K下的游离LAsp（c）LAsp -藻酸盐复合物（d）LAsp -壳聚糖复合物（e）LAsp -透明质酸复合物（f）LAsp -菊粉复合物（g）LAsp -果胶复合物对于复合物体系T=363 K。主要的蛋白质骨架由两个角度φ和φ决定。这些角度的合适或不合适可以通过在角度φ和φ的空间中绘制的二维图来描述，称为Ramachandran图[48]。在不允许的区域中具有φ和φ的角度的肽键的概念意味着，蛋白质已经离开了正确的二级构象。使 用 该 分 析 ， 在 对 不 同 多 糖 进 行 分 子 动 力 学 模 拟 后 ， 绘 制Ramachandran图（图S4），并检查蛋白质在300和363 K下的结构变化，并确定哪些多糖在大多数情况下具有更多的肽键S. Moradi等人医学信息学解锁25（2021）10068910表1在300和363 K下游离蛋白质中不同二级结构的氨基酸平均数，以及含有蛋白质聚合物的系统中的300 K363 KLAsp-藻酸盐复合物（363 K）363 KLAsp-透明质酸复合物（363 K）LAsp-菊粉复合物（363 K）LAsp-果胶复合物（363 K）线圈59.271.179.28067.665.562.93380.422B-Sheet73.776.267.372.470.677.973.0B桥5.24.95.42.84.13.26.2弯曲34.244.558.438.649.846.064.2反过来33.226.224.525.526.331.129.1A-HeliX88.270.759.986.877.972.939.25-HeliX00.50.30.00.00.22.03-HeliX0.90.42.60.90.50.50.6表2Ramachandran分析的结果。区域300 K363 KLAsp-藻酸盐复合物（363 K）363 KLAsp-透明质酸复合物（363 K）LAsp-菊粉复合物（363 K）LAsp-果胶复合物（363 K）残留物在大多数百分之九十一点四71.1%百分之七十三点二百分之六十八点二百分之七十一点八百分之七十二点九百分之六十七点三有利地区残留物百分之八点二百分之二十五点七22.9%百分之二十九点八百分之二十四点九24.1%百分之二十九点四允许的区域残留物大量0.0%0.8%百分之一点二百分之一点二二点四厘百分之二点零百分之一点二允许的区域不允许的残留0.4%百分之二点零百分之二点零0.8%百分之一点二百分之一点二百分之二点零区域有利区域和对蛋白质结构的更好影响。从表2中报告的结果以及与其他分析完全一致的结果可以看出，温度从300 K增加到363 K，有利区域中的残基的百分比值显著降低。这是蛋白质在热应力下结构不稳定性的另一个可靠证据，这需要适当的配方设计，以便在更高的温度条件下保存。最佳的多糖在最有利的区域中具有最高数量的氨基酸，并且如表2所示，透明质酸、藻酸盐和菊粉具有最有利的效果，并且在300 K下相对于游离蛋白质具有最高量的结构保留。此外，在果胶和壳聚糖的情况下，建立了最小量的保存。3.9. 多糖对蛋白质活性部位的影响在蛋白质L-天冬酰胺酶中，两个配体L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺试图竞争结合到活性位点。当L-天冬酰胺与活性位点结合时，就会看到L-天冬酰胺酶所期望的效果，即破坏癌细胞。然而，体内的L-谷氨酰胺也倾向于与蛋白质结合，如果结合，就会发生药物诱导的副作用。因此，使用Autodock Vina软件，研究了天冬酰胺和谷氨酰胺与从300和363 K下的蛋白质模拟获得的游离蛋白质的结合，以及在363 K下用每种多糖进行的蛋白质模拟的输出文件（表S2和图3B）。S5和S6）。计算了每种底物与酶之间的结合能，观察到来自L-天冬酰胺酶-壳聚糖复合物模拟的蛋白质对两种配体的亲和力最高，而来自L-天冬酰胺酶-果胶复合物的蛋白质对两种配体的亲和力最低.但也许更重要的是酶与L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的结合能之间的比率.如表S2所示，在不同的蛋白质-多糖复合物中，衍生自含有菊粉和透明质酸的复合物的蛋白质更倾向于L-天冬酰胺而不是L-谷氨酰胺。因此，可以预期，药物L-门冬酰胺酶与菊糖和透明质酸偶联可能具有较少的副作用。4. 结论治疗性蛋白质在运输和储存过程中都可能受到热应激。这些压力可以使蛋白质结构不稳定并损害其治疗功能。为了解决这些困难，已经开发了各种递送系统和制剂，其中天然和合成聚合物是主要成分。采用计算分子动力学模拟方法，研究了海藻酸钠、壳聚糖、菊粉、果胶和透明质酸5种生物相容性碳水化合物对L-天冬酰胺酶高温稳定性的影响。在这些模拟中，蛋白质结构在高温（363 K）和多糖的存在或不存在下的变化进行了比较，从蛋白质模拟在300 K。总的来说，根据所有结果，可以说透明质酸和菊粉在保护蛋白质免受高温方面更有效。这两种聚合物在较高温度下稳定蛋白质结构的更好结果可能是由于聚合物与蛋白质的更适当的相互作用。这可能与它们的分子结构如氢键供体和受体、疏水和亲水基团的数量和空间性质、静电相互作用调节剂的数量和位置等有关，这些化学性质决定了分子间相互作用的数量和质量，直接影响聚合物对蛋白质的作用结果还表明壳聚糖产生一定程度的不稳定性，这可能是由于无法产生理想的有效的互动。对于结合分析，从含透明质酸的系统获得的蛋白质提供与其底物的最合适的结合构象。最后，根据本研究的发现，建议透明质酸可作为保护性聚合物用于制备L-门冬酰胺酶释放系统。竞合利益作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作S. Moradi等人医学信息学解锁25（2021）10068911确认这项工作得到了伊朗克尔曼沙阿医学科学大学的支持。授权编号[97510]。附录A. 补充数据本文的补充数据可在https：//doi网站上找到。org/10.1016/j.imu.2021.100689。引用[1] Lowenfels AB，Maisonneuve P.胰腺癌的流行病学和风险因素。最佳实践研究临床胃肠病学2006;20：197-209。[2] 阿加瓦尔湾靶向癌症治疗。 Nature Publishing Group; 2010.[3] Wellner D，Greenfield RS. L-苏氨酸脱氨酶作为一种可能的抗肿瘤剂。癌症治疗报告1979;63：1089[4] 作者：Jaskolski M. L-天冬酰胺酶催化中心的结构、动力学和静电学：对反应机理的影响，第690卷。伦敦：伦敦伯克贝克学院晶体学系和维纳斯互联网有限公司;2004. p. 165比84[5] MillerM，Rao JM，Wlodawer A，Gribskov MR.一个左撇子的交叉涉及到酰胺水解酶催化：具有结合的l-天冬氨酸的欧文氏菌-天冬酰胺酶的晶体结构。FEBS Lett1993;328：275-9.[6] [10]杨文军，杨文军. 生产，古尔巴尔链霉菌L-天冬酰胺酶的分离纯化及性质研究BrazJ Microbiol 2010;41：173-8.[7] Chi EY，Krishnan S，Randolph TW，Carpenter JF.蛋白质在水溶液中的物理稳定性：非天然蛋白质聚集的机制和驱动力。药物研究2003;20：1325[8] Frokjaer S，Otzen DE.蛋白质药物稳定性：制剂挑战。Nat Rev DrugDiscov2005;4：298-306.[9] Krishnamurthy R，Manning MC.稳定性因素：在制剂开发中的重要性。《现代制药与生物技术》 2002;3：361-71。[10] 作者：J. A，J. A，J. 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