非编码基因组在癌症演变中的作用及组织特异性影响

1非编码基因组起源细胞基因时间序列32进化准不足456通过微妙的基因失调1在肿瘤演变中映射多个维度的体内2剖析影响癌症亚型演变的3非编码基因组扰动揭示了1450种癌症4QI是环境依赖性的，T-ALL亚型显示不同程度和模式的QI5非编码基因组中的工程缺失导致癌症，具有等位基因特异性肿瘤谱6与QI相关的人类癌症风险变体，了解其影响和组织特异性文章调节基因组的体内询问揭示了癌症演变图形摘要亮点d绘制癌症演变d非编码基因组扰动揭示了癌症d准功能不全依赖于环境：T-ALL亚型特异性程度/模式d基因沙漠缺失系列在具有等位基因特异性肿瘤谱的小鼠中导致癌症作者Anja Fischer，RobertLersch，Niklas de AndradeKratzig，.，艾伦·布拉德利，莉娜·拉德，罗兰·拉德对应roland. tum.de简言之Fischer等人报告了在小鼠中询问非编码基因组的筛选方法，该方法揭示了微妙基因失调在癌症演变中的广泛作用。它们表明，这种准不足在各实体中广泛存在。这些发现使人们深入了解人类癌症风险变体对肿瘤抑制的损害以及非编码突变的组织特异性影响。Fischer等人，2023，细胞基因组学3，1002762023年3月8日，作者。https://doi.org/10.1016/j.xgen.2023.100276会会开放获取文章调节基因组的体内询问揭示了广泛的癌症演变中的准不足Anja Fischer，1，2，3，21Robert Lersch，1，2，21 Niklas de Andrade Kratzig，1，2Alexander Strong，4 Mathias J.Friedrich，1，2，5JuliaWeber，1，2ThomasEngleitner，1，2RupertOüllinger，1，2Hsi-YuYen，3，6UrsulaKohlhofer，7IreneGonzalez-Menendez，7David Sailer，1，2Liz Kogan，1，2Mari Lahnalampi，8Saara Laukkanen，9ThorstenKaltenbacher，1，2Christine Klement，1，2MajdaddinRezaei，1，2TimAmmon，2，10JuanJ. GünterSchneider，5，11JuliaMayerle，12Mathias Heikenwaülder，13，14Marc Schmidt-Supprian，2，3，10Leticia Quintanilla-Martinez，7Katja Steiger，3，6Pentao Liu，4，15Juan Cadin Pastanos，16George S.Vassiliou，4，17，18Dieter Saur，2，5，19Olli Lohi，9MerjaHeinéniemi，8Nathalie Conte，4，22艾伦布拉德利，4，20，22莉娜拉德，2，19，22和罗兰拉德1，2，3，5，22，23，*1慕尼黑工业大学医学院分子肿瘤学和功能基因组学研究所，81675Munich，Germany2慕尼黑工业大学医学院转化癌症研究中心（TranslationalCancerResearch，CenterofMedicine，TechnischeUniversita？tM？ nchen，81675Munich，Germany3德国癌症联盟（DKTK），海德堡，Germany4Wellcome Trust Sanger Institute，Genome Campus，Hinxton，Cambridge，UK5德国慕尼黑工业大学医学院第二医学系，81675慕尼黑6比较实验病理学，慕尼黑工业大学医学院，81675Munich，Germany7病理学和综合癌症中心研究所，EberhardKarlsUniversita？tTu？bingen，72076Tu？bingen，Germany8东芬兰大学医学院生物医学研究所，Kuopio，芬兰9芬兰坦佩雷坦佩雷大学坦佩雷儿童、青少年和产妇保健研究中心和泰斯癌症中心医学和保健技术学院10慕尼黑工业大学医学院实验血液学研究所，81675慕尼黑，德国11哥廷根大学医学中心普外科、内脏和儿科外科，37075哥廷根，德国12慕尼黑LMU大学医院第二医学部，慕尼黑，德国13德国癌症研究中心（DKFZ），69120 Heidelberg，Germany14德国癌症研究中心（DKFZ）慢性炎症和癌症部门，69120 Heidelberg，Germany15李嘉诚香港大学医学院，干细胞与再生医学联盟，生物医学科学学院，香港，中国16Instituto de Medicina Oncolo 'gica y Molecular de Asturias（IMOMA），33193 Oviedo，Spain17Wellcome Trust-MRC Stem Cell Institute，Cambridge Biomedical Campus，University of Cambridge，Cambridge CB2 0XY，UK18剑桥大学医院NHS信托基金会血液科，Cambridge CB2 0PT，UK19慕尼黑工业大学医学院实验癌症治疗研究所，81675Munich，Germany20Cambridge Institute of Therapeutic Immunology Infectious Disease（CITIID），University of Cambridge，Puddicombe Way，Cambridge CB2 0AW，UK21这些作者贡献相等22这些作者贡献相等23主要联系人*通信地址：roland.tum.dehttps://doi.org/10.1016/j.xgen.2023.100276总结与肿瘤抑制功能的单等位基因或双等位基因缺失相反，由非编码（epi）基因组改变引起的离散基因失调的影响在这里，通过扰乱小鼠的调控基因组，我们揭示了微妙的基因表达变异在癌症演变中的普遍作用。表征1，450个肿瘤的全基因组筛选显示，这种准不足在实体中广泛存在，并显示出不同的背景依赖性，例如T-ALL亚型中不同的细胞起源相关性。我们编制了与准不足相关的非编码区目录，显示了它们与人类癌症风险变体的富集，并通过在小鼠中设计调节改变提供功能性见解因此，Bcl 11b连接的非编码区中的千碱基/兆碱基缺失触发了侵袭性恶性肿瘤，等位基因特异性肿瘤谱反映了通过模块化和细胞类型特异性增强子活性的逐渐基因失调。我们的研究构成了对癌症中准不足的系统水平理解的第一次调查，并对肿瘤演变和非编码突变的组织特异性影响提供了多方面的见解。CellGenomics 3，100276，March 8，2023？作者。1这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。会开放获取文章2Cell Genomics3，100276，2023介绍癌症演变是由改变的细胞信号状态驱动的，其由结构基因组变化或基因表达失调引起1，2遗传性癌症综合征的早期研究，如视网膜母细胞瘤，3，4将肿瘤发生与肿瘤抑制基因（TSGs）的双等位基因第一个TSG敲除小鼠提供了这种两次击中假设的实验证据，4-7，8这种现象，被称为单倍不足，可以是强制性的，并经常显示上下文依赖性。9-与TSGs类似，癌基因诱导的转化通常依赖于最佳剂量，其取决于细胞或共突变背景。10，15-微妙的失调影响细胞中的数千个基因，可能是由于干扰调控元件（RE）造成的。编码蛋白质的外显子组比非编码蛋白质（nPC）的基因组空间小50倍，其中相当大的一部分被认为是构成调控序列。[21]在肿瘤发生过程中，调控基因组经历了广泛的变化，通过结构改变（如体细胞突变或拷贝数变异）或适应性过程（如通过细胞内源性和外源性转录因子的整体染色质重塑）。然而，致癌非编码调控改变的功能注释、其组合效应和细胞类型特异性功能仍然是一个重大挑战。23同样地，虽然高达90%的基因组被转录 24（其中只有一小部分编码mRNAs），但癌症中非编码RNA（ncRNA）的整体功能研究仍处于起步阶段。nPC癌症基因组中的基因组改变是常见的，但它们的功能相关性在很大程度上尚未探索。21T-ALL是一个突出的例子，其特征是PC序列中突变数量少（平均每个肿瘤6个），25但nPC基因组中几乎有1，000个突变。[26]这些非编码突变的影响尚不清楚，除了少数例子，[27-31]但可能表明准缺陷在T-ALL演变中的可能作用。人类T-ALL是一种异质性疾病。最新的WHO分类增加了早期T细胞前体ALL（ETP-ALL，由未成熟T细胞发展而来）作为一种生物学上独特但本身异质的预后不良的亚实体。[32 - 34]然而，塑造不同T-ALL亚型顺序进化的分子原理还没有得到很好的理解。转座子系统在小鼠中用于插入诱变的应用3520这种筛选被证明在阐明驱动因子方面特别有效，这些驱动因子通常在人类癌症中不突变，但通过其他方式失调，因此难以确定。通过基因组测序方法鉴定。转座子插入也可以影响RE，20，38，从而可能导致微妙的基因失调。在这里，我们利用插入诱变的调控基因组的系统功能审讯。我们开发了筛查和分析方法，使我们能够对实体癌和造血系统癌中的准不足进行全基因组调查。我们还设计了正向筛选方法来询问体内癌症演变。使用T-ALL作为模型，这些屏幕显示了分子，细胞和时间参数的组合代码如何决定肿瘤亚型演变，并突出显示了广泛的准不足，这显示了显着的上下文依赖性，包括细胞的起源协会。结果使用T-ALL作为模型实体的编码和非编码基因组的体内询问我们以前开发了PiggyBac筛选系统，用于小鼠的基因发现20，37使用PiggyBac转座酶和ATP 2型转座子的全身突变诱导B、T或髓系中的肿瘤发生37（图S1）。为了进行亚型特异性分析，我们生成了一个大型Rosa 26PB/+; ATP 2小鼠队列（n = 256），我们监测了其癌症发展（图S1;表S1）。使用免疫组织化学表征肿瘤，并将T细胞（急性）淋巴母细胞淋巴瘤/白血病（T-LBL/T-ALL;下文称为T-ALL; n = 51）用作研究癌症中准功能不全的模型（图S1C和S2A）。所有T细胞肿瘤的定量插入位点测序（QiSeq）40揭示了170，075个非冗余转座子整合（图S2B）。为了定位受转座子插入影响的基因组区域，我们进行了基于高斯核卷积（GKC）的统计分析41使用CIMPL（常见插入位点映射平台），我们确定了1，062个常见插入位点（CIS），其中994个CIS在至少10%的样本中发现。图1A显示了前50个CIS基因，包括：（1）已知的T-ALL驱动因子（如Notchl、Pten或Bclllb），42（2）之前未与T-ALL关联但与其他血液恶性肿瘤关联的基因（例如，Cux1，Mecom，Crebbp），和（3）迄今为止尚未与造血系统癌症相关的基因。虽然后者通常研究得很少，但有些与信号传导（Sh3kbp1，Sipa1l1）或免疫功能（Slamf6，Ly6e，Mgat5）有关。此外，我们发现这些基因中的几个在T细胞发育期间受到强烈调控（Gfra1、Nck2、Prim2、Serbp1、Fam169b）（图S3），表明在T细胞谱系中的功能。CIS的完整列表和已知与人类癌症相关性的信息见表S2和S3。为了检查我们的筛选系统对nPC基因组询问的适用性，我们首先评估了PiggyBac转座的一般通过检查插入的全球分布，我们发现近一半位于基因间区域（图1B）。这与我们用睡美人进行的造血筛选（55%的插入）相当，睡美人是一种没有插入Cell Genomics3，100276，2023年3月8日3会开放获取文章图1.全基因组PiggyBac转座子筛选T-ALL编码和非编码基因组(A) 按分子类别分类的前50个CIS（如Liu et al.（42）新奇。热图指示在相应CIS中具有插入的样品的数量(B) 在蛋白质编码和非蛋白质编码基因组中独特插入的数量蛋白质编码包括外显子序列和内含子序列。(C) 曲线热图显示CIS区域（n = 1，062）与T细胞（DP阶段43）和成淋巴细胞T细胞系EL4中的H3K27ac峰的重叠显示了CIS中心周围两个方向上的4410 kb(D) 具有CIS重叠（n = 914，红色）和不具有CIS重叠（n = 20，935，蓝色）的基因处的胸腺ChIP-seq数据的曲线图显示了转录起始位点（TSS）上游2kb和转录终止位点（TES）下游2kb的区域（图例接下页）4Cell Genomics3，100276，2023会开放获取文章偏向于基因内插入这表明选择而不是整合偏好是非编码CIS的来源，从而支持调节区在肿瘤发生中的功能相关性。接下来，我们比较了PiggyBac插入谱与T细胞谱系中的表观遗传学特征，并研究了PC（外显子和内含子序列的总和;约占基因组的25%）和nPC基因组之间的差异。健康和恶性T细胞中具有H3K27ac增强子组蛋白标记的所有CIS区域的覆盖揭示了CIS中活性染色质的富集（图1C）。具体观察PC基因组，我们发现-如预期的-与不与CIS重叠的基因相比，CIS重叠基因处活性染色质标记的大量积累和抑制标记的消耗（图1D）值得注意的是，CIS中活性染色质标记的富集对于nPC基因组也是如此（图1E和S4）。因此，除了其对转录基因的偏好之外，45-最后，因为癌症驱动插入比乘客插入更可能支持克隆生长，我们检查了基因和基因间插入的测序读段覆盖谱。我们发现这些组之间没有重大差异（图1F），表明基因和调节CIS的功能相关性相当nPC CIS中表观遗传特征的注释对于GKC统计，用于识别蛋白质编码CIS的常用尺度参数范围在30和240 kb之间。由于RE的平均大小（1.5 kb）小于PC基因的平均大小（8 kb），我们推测需要调整尺度参数。用于GKC分析的不同CIS窗口大小的系统比较确实揭示了将尺度参数降低至5 k增加了调节性CIS发现的灵敏度（图2A、2B和S5;表S4）。为了注释基因间CIS的功能特性，我们开发了ARCIS（用于调控共同插入位点的注释管道）（图2C、S5和S6;详见STAR方法），我们使用其将CIS区域与来自不同T细胞发育阶段或T-ALL的表观遗传学数据（染色质可及性、组蛋白修饰和关于3D组织的信息，43表S5和S6）重叠。ARCIS输出支持快速探索性分析，允许（1）根据CIS的调控潜力（RE评分）对CIS进行排序，（2）对感兴趣的RE类别进行排序，以及（3）搜索感兴趣的RE靶基因（表S7和S8）。我们还根据ARCIS输出数据的手动检查制定了最终RE分配规则（图S6）。总体而言，这些分析创建了T-ALL中癌症相关RE的目录。图2E中显示了45个高评分RE的具体结果，其指示了每个CIS的相关RE类别和靶基因/转录物。数据S1为了探索已鉴定RE的人类相关性，我们检查了CIS同线人类区域的调节活性。为此，我们将小鼠CIS坐标转移到人类基因组，然后注释一系列表观基因组人类数据（图2C、2D 和S7;表S9）。随后的跨物种分析显示，小鼠调节CIS的同线人类区域在其调节活性中显示出高度一致性（图2D）。调控性CIS的扰动导致靶基因表达我们首先检查了基因间RE并分配了潜在的连锁基因（图2E;数据S1;表S8）。除了已知的T-ALL驱动因子（如Runx 1、Lef 1、Bcl 11b和Rasgrp 1），该列表还包括在T细胞生物学中起作用的基因（Satb 1和Rag 2）以及以前在T细胞中未描述过功能的发育基因（如Sall 3和Hoxd簇）。原则上，在调控区中的转座子插入可以积极或消极地影响靶基因的表达。可能的机制包括转录因子结合位点的破坏、3D染色体构象的干扰和拓扑学相关结构域结构（关于靶基因的推定癌症相关性的详细信息，请参见表S3我们接下来检查了基因内（内含子）RE，其难以在筛选中识别，因为常见的分析方法主要将CIS分配给重叠基因。因此，我们利用3D连接性数据43将内含子RE分配给其推定的远距离靶基因。这些分析鉴定了30个归类为内含子RE的CIS（数据S5）。它们的主要特征是：（1）在狭窄的内含子区域聚集插入峰，（2）无偏转座子方向，（3）Hi-C连接到远端基因，（4）在相关组织中通常不存在CIS基因表达由新鉴定的RE调节的基因的例子包括Pten（已知的T-ALL肿瘤抑制物49，50）、Themis和Nrp 1（到目前为止未涉及T-ALL，但在T细胞生物学中51，52）或Txn 1和Iqgap 2（到目前为止未在T细胞中研究筛选的有效性由Rnls中的窄内含子CIS区域例示，其具有与~400 kb远距离Pten启动子的Hi-C连接（图3A），并且最近被描述为是一个非限制性的内含子CIS区域。Pten增强剂。53使用全局连续测序（GR 0-seq），我们检查了该RE在人类T-ALL患者数据中的相关性（图3B），并发现了细胞类型特异性增强子活性，其中增强子RNA信号峰存在于T-ALL患者中，但不存在于HEK 293 T细胞中。因此，7-8 kb RE区的基于CRISPR-Cas9的缺失我们鉴定了影响54种nPC转录物的CIS（图2E;数据S2;表S8）。 超过 70% 的这 些ncRNA 在T 细胞 发育 期间 表达 （图S5D）。有几个与已知的T-ALL基因接近，如Myb，Myc和Ptprc。54(E) 基因间CIS区域（n = 227，红色）和对照CIS区域（蓝色，参见STAR方法）的胸腺ChIP-seq数据的曲线图显示了CIS中心上游10 kb和下游10 kb的区域(F) 蛋白质编码和非蛋白质编码插入的读段覆盖率（包括> 1，000个读段的插入; p = 0.45，Wilcoxon检验）。hem，血液学; PC，蛋白质编码; nPC，非蛋白质编码; DP，双阳性; CIS，共同插入位点。Cell Genomics3，100276，2023年3月8日5会开放获取文章图2.新方法支持系统识别和注释监管CIS(A) 使用不同尺寸参数（5(B) 监管CIS的百分比取决于使用的规模参数和分析的CIS数量（前100、300或500）。(C) ARCIS框架的示意图，用于注释CIS区域中假定的调控元件。(D) 雷达图显示与小鼠CIS和CIS同线人类区域重叠的表观基因组特征的百分比。弱增强子和活性增强子的注释来自chromHMM模型，超级增强子（SE）的注释来自dbSuper。对于H3 K27 ac ChIP-seq、GRO-seq和ATAC-seq，使用不同的读数截止值（10或50个读数）。(E) 代表不同的CIS类别。显示所有类别的方案红线表示HiC连接。对高于任意设定阈值的所有CIS区域（在至少7个样品中发现，n = 537）进行使用ARCIS框架确定了195个监管CIS，并手动验证以确定每个类别的高置信度区域。每个调控区的潜在靶基因列在右边的前45个调控CIS中。分析方法的详细描述见图S6。PC，蛋白质编码; nPC，非蛋白质编码; reg，调控; RE，调控元件。6Cell Genomics3，100276，2023会开放获取文章图3.监管CIS的功能验证(A) 鼠Pten和Rnls基因座中的插入和CIS来自双阳性T细胞的H3 K27 ac和H3 K4 me 1轨迹，以及来自T细胞进化的不同阶段（早期，HSC-DN 2a;晚期，DN 2b-DN 3）的DNase-seq和Hi-C数据如下所示（公开可获得的数据，如表S5中所列）。Rnls基因中的内含子CIS区显示与活性染色质的重叠和与Pten启动子的Hi-C连接。(B) 人PTEN基因座。图中显示了两个T-ALL患者（Jurkat和HEK 293细胞系）的CIS-同线人类区域（顶部，绿色）和GRO-seq轨迹（红色）窄调节CIS的同线区域在T-ALL患者和Jurkat细胞中显示出典型的双向增强子RNA GRO-seq信号峰值得注意的是，RNLS不在T-ALL中表达，这支持了CIS靶标不是Rnls本身而是其内含子RE的概念。(C) 具有/不具有位于Rnls基因中的潜在Pten增强子（~7 kb）的基于CRISPR-Cas9的敲除的克隆中的Pten表达每个点代表相对于Gapdh表达标准化的单细胞衍生克隆中Pten基因的相对表达。显示了针对细胞系EL 4（KO n = 26，8/26纯合，cDNAn = 18）、Jurkat（人T-ALL; KO n= 12，0/12纯合，cDNAn = 10）和HEK 293（KO n = 38，6/38纯合，cDNAn = 14）的实验。(D) 包含Zeb1和Zeb1反义转录物Gm10125的小鼠chr18区域。箭头指示插入峰的方向(E) 在EL 4细胞中具有/不具有基于CRISPR-Cas9的Gm 10125外显子2和3（~2kb）敲除的克隆中的Zebl表达（KO n = 17，9/17纯合，cDNAn = 16;Zebl启动子上游8 kb的缺失边界每个点代表归一化为单个细胞来源的克隆中的相对Zeb1基因表达Gapdh表达。*p 0.05，** p 0.01，*p 0.001，*p 0.0001，Wilcoxon检验。(F) CIS同线人类区域中癌症相关GWAS变体的数量从NHGRI-EBI GWAS目录中筛选出癌症风险变体，并针对连锁不平衡进行修剪。变体与CIS同线人类坐标重叠所有CIS尺寸（宽度）的总和用于统计计算。**p 0.01，c2检验。CIS，共同插入位点; HSC，造血干细胞; DN 2，双阴性2期;DP，双阳性期;Rel，相对。EL 4，小鼠T淋巴母细胞系; Jurkat，人T-ALL细胞系; HEK 293，永生化人胚肾细胞。Kctd 1，迄今尚未涉及T-ALL（数据S2）。我们对与Zeb1重叠的CIS进行了详细的研究，该CIS被ARCIS注释为“PC转录物加ncRNA”。插入模式的手动检查显示两个峰，相反的转座子方向，预测激活Zeb1或Zeb1反义转录物Gm10125（图3D）。人ZEB 1-ASRNA可以通过募集H3 K4甲基转移酶激活ZEB 157、因此，Cell Genomics3，100276，2023年3月8日7会开放获取文章~在小鼠EL 4细胞中杂合Zeb 1-AS缺失后观察到Zeb 1表达降低（降低39%）（图3E）。因此，两个插入簇的功能结果是诱导Zeb1表达。值得注意的是，Zeb 1在T细胞中显示出肿瘤抑制功能：Zeb 1敲除小鼠发展成熟（经典）T-ALL。然而，在我们的筛选中，Zeb 1插入（1）在未成熟的T-ALL中富集，（2）预测为致癌的，如AML。因此，这些结果表明Zeb 1在T-ALL中具有双重作用，这取决于细胞环境（T细胞定型之前或之后）。我们还验证了影响其他基因座的调控CIS，包括Ikzf 1（图S8白血病相关转录因子Ikzf1由两个CIS标记（图S8A）。一个CIS与Ikzf1本身重叠，并显示预期的基因失活型插入模式，与Ikzf1的已知肿瘤抑制功能一致（图S8B）。第二个CIS与Ikzf1上游100 kb 的 区 域 重 叠 ， 该 区 域 包 含 增 强 子 序 列 以 及 lncRNA（Gm11998），其在T细胞发育期间受到调控（图S8A）。在T-ALL细胞系中删除该区域对Ikzf 1表达产生了微妙但显著的影响（降低32%，图S8C），证实了筛选的预测。总之，这些数据表明nPC插入是功能性的，并对靶基因表达产生微妙的影响。它们的大量存在表明T-ALL中存在广泛的准不足。nPC CIS富含人类癌症风险变体人类全基因组关联研究（GWAS）中鉴定的癌症风险变体经常影响非编码序列，表明微妙的基因调控作用。为了探索假定的人类和小鼠调节改变之间的我们确实发现，调节性CIS靶点（n = 149个基因）高度显著富集了GWAS相关的人类can-cer变异（p = 0.001，泛癌变异; p = 2.983 10- 6造血系统癌症变体;c2测试;表S10）。在正交方法中，我们将小鼠CIS坐标转移到人类基因组，并使用同线人类区域分析其与癌症相关GWAS变体的重叠（表S11）。为了排除位于相同单倍型区块上的SNP，使用LDlink修剪GWAS变体列表以用于连锁不平衡。60我们发现，在与小鼠CIS同线的人类基因组区域中，泛癌GWAS风险变体的富集（每Mb 3.09个变体），与它们在人类基因组中的总体频率相比（每Mb 1.48个泛癌GWAS风险变体;p = 2.3× 10- 5，c2检验;表S11）。这种富集作用对于与小鼠基因间CIS同线的人类区域（每Mb 4.48个变体; p =0.0029; c2检验）相比，与基因内CIS同线的区域（每Mb 2.82个变体; p = 0.001; c2检验，图3F）。这些结果支持屏幕的人类相关性。小鼠基因沙漠缺失通过微妙的调节作用驱动从统计学上讲，转座子插入极不可能同时发生在同一基因的两个等位基因上或同一基因的调控区上。相同单元因此，我们假设在我们的筛选中对RE功能的干扰主要是单等位基因的。这表明，即使对基因调控非常细微的干扰也会促进恶性转化。然而，迄今为止，几乎没有证据表明这一假设在小鼠癌症模型中成立。最常见的儿童T-ALL易位是t（5;14）（q35;q32），将BCL 11B下游的基因荒漠（没有蛋白质编码基因的基因组区域）融合到TLX 3（20%-因此，BCL11BRE的劫持导致这些易位伴侣的过度表达，这已被证明是致癌的。62，63然而，尚不清楚单等位基因增强子去调试本身是否足以诱导生物体中的肿瘤（例如，通过减少BCL 11B表达）。为了解决这个问题，我们首先探索了我们筛选中的同基因小鼠区域，这揭示了Bcl11b下游基因沙漠中的几个CIS，表明Bcl11b增强子的干扰本身确实是致癌的（小鼠没有易位）。人类T-ALL中的易位断裂点几乎完全位于BCL 11B下游。该1Mb区域显示调节活性，64，65我们在人T-ALL中通过GRO-seq以高分辨率证实了这一点（图4A）。同线小鼠调控区由几个独立的CIS标记（图4B）。此外，CIS标记的推定RE与T细胞谱系中的Bcl11b启动子存在多种物理相互作用（图4B）。在人类易位坐标（和小鼠CIS位置）的指导下，我们在具有Bcl11b下游调节活性的基因沙漠中设计了两种具有千至兆碱基规模种系缺失（Bcl11bD 105kb，n = 148和Bcl11bD 1Mb，n = 49）的小鼠模型（图4 B）。我们发现，不仅双等位基因缺失，而且杂合敲除小鼠在健康组织中显示Bcl11b表达降低，尽管对于较小的突变体Bcl11bD105 kb的影响非常微妙（图4C）。在两个队列中，动物在幼年时开始出现疾病体征（表S12）。一部分动物出现了神经发育表型的症状（图S9A），如震颤，与Bcl11b在脑发育中的功能一致。66第二个主要的表型是癌症。总体而言，22%-这些数字甚至低估了基因敲除的致癌作用，因为考虑到一大部分动物在年幼时由于神经发育表型而不得不被处死。肿瘤谱包括血液系统癌症，包括T和B细胞恶性肿瘤以及一系列实体癌（图4E、S9B和S10;表S12）。值得注意的是，尽管所有基因型都显示出高度渗透的癌症表型，但各组之间的肿瘤发病差异很大：Bcl 11bD1 Mb/ D1 Mb小鼠的中位肿瘤相关生存期最低（195天），其次是Bcl 11bD105 kb/D105 kb（338天）、Bcl 11bD1 Mb/WT（466天）和Bcl 11bD105 kb/WT（640天）小鼠（图4F）。我们接下来检查了个体基因型是否产生不同的癌症表型，并发现T-ALL的强偏倚代表（图4E和4G）。Bcl 11bD1 Mb/ D1 Mb小鼠8Cell Genomics3，100276，2023会开放获取文章图4.小鼠“基因沙漠”缺失的等位基因系列显示逐渐的基因失调和不同的(A) 人BCL11B基因座。指示的是在T-ALL患者（深蓝色）和细胞系（浅蓝色）中检测到的易位断点，两个T-ALL患者（Jurkat和HEK 293细胞系）的GRO-seq轨迹突出显示具有假定的高调节活性的区域。顺式同线区以绿色指示。(B) 小鼠Bcl11b基因座。工程改造的基因间种系缺失（如通过CIS位置和人易位断点所告知的）由红色条指示显示了来自双阳性T细胞的H3 K27 ac和H3 K4 me 1轨迹，以及来自T细胞进化的不同阶段（早期，HSC-DN 2a;晚期，DN 2b-DN 3）的DNase-seq和Hi-C数据（公开可获得的数据，如表S5中所列）。(C) Bcl 11b在健康（无肿瘤）野生型和基因敲除小鼠（cnc，n = 5; 105 kb-het，n = 3; 105 kb-hom，n = 6; 1 Mb-het，n = 3; 1 Mb-hom，n = 1）胸腺中的表达。一式两份进行qPCR，并将基因表达标准化为Gapdh。数据表示为平均值±SEM（**p 0.01，Wilcoxon检验）。(D) 105 kb（36/148）和1 Mb（19/49）基因敲除小鼠的肿瘤发生率。(E) 105 kb和1 Mb基因敲除小鼠的肿瘤谱。(F) 1 Mb和105 kb基因敲除小鼠的癌症特异性存活率(G) 1 Mb和105 kb基因敲除小鼠的肿瘤类型特异性存活率。误差条表示SD。CIS，共同插入部位; HSC，造血干细胞; DN，双负期; DP，双阳性期; WT，野生型;hem，造血; het，杂合; hom，纯合子;指挥中心Cell Genomics3，100276，2023年3月8日9会开放获取文章图5.全基因组筛选揭示了个体(A) 在不同器官中进行的全基因组PiggyBac体内筛选中基因间（调节）CIS的分数（来自15个不同筛选的1，450个肿瘤）。使用各种Cre驱动线，使用全身或组织特异性转座激活进行筛选。使用缩减尺度参数进行CIS分析以鉴定基因间调控区（参见STAR方法）。PDAC，胰腺导管腺癌; HCC，肝细胞癌;ECC，肝外胆管癌; ICC，肝内胆管癌; BCL，B细胞淋巴瘤; MCL，套细胞淋巴瘤; AML，急性髓性白血病; T-ALL，T细胞急性淋巴母细胞性白血病; B，在Braf突变体背景下进行的筛选; K，Kras突变体背景; WT，野生型; Pi，Pi 3 k突变体背景。未发生实体瘤，但几乎全部为T细胞恶性肿瘤（9/10）。与其他基 因 型 （ 11/45 T-ALL ） 的 差 异 非 常 显 著 （ p = 0.0002 ，Fisher10/27只小鼠，p = 0.0089，Fisher在基因型谱的另一端，我们发现Bcl 11bD105 kb/WT动物没有发生T-ALL。几乎所有癌症（12/13）都不是T-ALL（p = 0.013，Fisher因此，在其他野生型背景上的调控DNA的缺失不仅足以诱导显著的癌症表型，而且其性质（位置、大小）和剂量（杂合性或纯合性）也深刻地影响结果（肿瘤类型和频率），表明累加效应和增强子模块性。总的来说，这些数据支持一个模型，即使是微妙的基因失调，可以显着促进肿瘤的发生。全基因组筛选揭示了实体之间广泛的为了探索细微的基因失调是否与T-ALL有广泛的相关性，我们在15个PiggyBac插入诱变筛选中检查了1，450种癌症，包括8种不同的癌症类型及其子实体（表S13）。我们发现，这些筛选中10%-为了检查功能性状在非编码CIS中的分布，我们进行了转录因子基序分析，其揭示了癌症类型特异性富集谱（图5B）。例如，T-ALL非编码CIS富含ETS转录因子（Ets 1、Fli 1、Erg）的结合基序，这些转录因子在T细胞白血病发生中具有充分描述的作用。相比之下，胰腺筛选中的nPC CIS显示了在胰腺腺泡细胞去分化和转化中具有已知功能的转录因子的基序富集（例如Fra1/ 2和Fos/Junb/Ap 1）。为了探索插入的等位基因状态，我们手动检查了两个筛选中的所有581个高覆盖率nPC插入我们仅发现22例在同一癌症中两个插入在50 kb的距离内（图5C）。这几个插入可能反映了通过局部转座子跳跃发生的相同等位基因上的独立命中（在不同的细胞克隆中），这是通常观察到的，并且比同源染色体上的插入因此，在本发明中，(B) 在两种示例性癌症类型（T-ALL、PDAC）中基因间转座子插入区域中的转录因子基序富集。对基因间插入侧翼的200 bp区域进行已知基序的Homer分析（T-ALL，n = 56，320; PDAC，57，291）。显示了前10个基序（p值范围T-ALL：1 e-267至1 e-87; PDAC，1 e-322至1 e-259）。(C) 肿瘤组织（T-ALL）和原代细胞培养物（PDAC）中高覆盖度基因间插入的距离对于每个样品（n = 48 T-ALL; n = 50 PDAC），选择高覆盖度（R1，000读数）基因间插入（n = 328 T-ALL; n = 253 PDAC），并计算这些插入之间的距离。显示了0-50 kb范围内的距离，并且每个插入的归一化覆盖度由圆圈的大小表示。仅在少数情况下观察到同一癌症中50 kb距离内的两个插入这些可能反映了相同等位基因（在不同细胞克隆中）上的独立局部跳跃事件，而不是相同细胞中的双等位基因插入。10Cell Genomics3，100276，2023会开放获取文章（图例见下页）Cell Genomics3，100276，2023年3月8日11会开放获取文章影响相同功能性RE的双等位基因插入极不可能发生，这与非编码插入具有微妙调节作用的概念一致。这一结论得到了功能研究的进一步支持，我们进行了研究基因间转座子插入在非造血肿瘤中的作用在KrasG12D突变背景下进行的胰腺筛选中（图5），一个顶级基因间CIS标记了一个具有推定调控作用的区域。功能位于核受体下游约145 kb处相互作用蛋白1（Nrip1）启动子。使用CRISPR-Cas9，我们在KrasG12D突变小鼠胰腺癌细胞中产生了该区域的4.5kb缺失敲除。使用17个野生型和敲除克隆的比较分析揭示了敲除克隆中Nrip1表达总体降低30%（图S11）。该筛选中的另一个CIS连接的调控区位于Enpp1下游80 kb处，Enpp1是一种参与抗癌免疫的 核 苷 酸 焦 磷 酸 酶 。 我 们 再 次 进 行 了 该 区 域 （ 3.5kb ） 的CRISPR-Cas9敲除，这导致Enppl的下调（图S11）。因此，两个实验系列都支持基因间转座子插入的功能相关性。我们接下来对小鼠筛选中鉴定的所有基因间CIS进行CIS坐标的小鼠到人的提升（n = 2，337）。我们观察到了大量的癌症-与基因组的其余部分相比，在同线人类CIS区域中的相关GWAS变体（p = 7.95310- 7，c2检验），支持所做发现的人类相关性。对小鼠小鼠筛选的比较揭示了个体实体和子实体在基因间CIS的发生中显示出显著差异（图5A），表明了上下文依赖性。例如，在造血系统中，未成熟AML（由形态学/IHC定义）显示出比更成熟形式低得多的调节性CIS数量（10% vs.百分之十八-19%，图5A，未成熟AML对AML_P：Fisher精确检验，p =0.045）。同样，不成熟的ETP-ALL比其更成熟的“经典”T-ALL对应物具有更少的调节CIS总而言之，这些研究暗示了准不足在癌症中的普遍作用，并表明存在实质性的背景依赖性。T-ALL亚型用于研究调控环境依赖性为了探索准不足的可能背景依赖性作用，我们研究了我们的T-ALL模型是否发展了不同的疾病亚型。人类T-ALL是一种异质性疾病。然而，在最新的WHO分类中，具有独特生物学的一个子集已被认为是一个独特的子实体：ETP-ALL的特征在于骨髓和干细胞标志物的保留32为了表征小鼠肿瘤，我们分析了转录组并确定了T-ALL、成熟T细胞淋巴瘤（MTL）和健康胸腺的免疫表型（图S12）。基于IHC的分析显示了CD 4阳性和阴性肿瘤，表明队列中的T-ALL异质性（图S12）。基因表达数据的基于模型的聚类鉴定了三个主