3D生物打印：制造组织和器官的新途径

× ××工程5（2019）777研究3D生物打印-综述3D生物打印：制造组织和器官的新途径张斌a，b，#，高磊a，b，#，马良a，b，罗毅臣a，b，杨华勇a，b，刘伟，崔占峰ca浙江大学流体动力机电一体化系统国家重点实验室，浙江杭州310058b浙江大学机械工程学院，浙江杭州310058c英国牛津大学工程科学系生物医学工程研究所，牛津OX3 7DQ阿提奇莱因福奥文章历史：收到2018年2019年1月9日修订2019年3月25日接受在线预订2019年保留字：三维生物打印固体组织中空组织芯片组织工程药物筛选A B S T R A C T三维（3D）生物打印是一种快速发展的技术，已广泛用于组织工程，疾病研究和药物筛选。它提供了以逐层方式沉积各种类型的生物材料、细胞和生物分子的前所未有的能力，具有精确控制的空间分布。这项技术有望在未来解决器官短缺问题在这篇综述中，我们首先介绍了三种3D生物打印策略：基于喷墨的打印（IBP），基于挤出的打印（EBP）和基于光的打印（LBP）。生物材料和细胞，通常被本文还系统地介绍了生物3D打印技术在构建软骨、骨、皮肤、肌肉、血管网等具有实体或中空结构的含细胞人工组织和器官方面的最新进展，并综述了利用生物3D打印技术构建器官芯片的研究进展。最后，对生物3D打印技术的研究现状和存在的问题进行了展望。©2019 The Bottoms.Elsevier LTD代表中国工程院出版，高等教育出版社有限公司。这是一篇CC BY-NC-ND许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1. 介绍器官短缺是一个全球性的危机，由于对器官移植的需求迅速增加和器官供体供应不足[1，2]。在美国，只有不到三分之一的等待名单上的患者接受了移植器官[3]，而只有1104的1106106人（不到1%）遭受在中国，每年都有来自终末期器官衰竭的患者接受器官移植[4]。由Langer和Vacanti[5]首次引入的组织工程方法已成功应用于研究和临床领域，例如构建合成膀胱[6]。尽管取得了这些进展，但功能性人工组织/器官的构建需要更高的空间复杂性、更好的细胞间相互作用和血管化，这是传统组织工程方法无法实现的在过去的几十年中，动物模型和二维（2D）细胞培养验证方法已广泛用于疾病研究和药物发现[7]。然而，动物模型很难模仿人类的潜在机制，*通讯作者。电子邮件地址：liangma@zju.edu.cn（L. Ma），yhy@zju.edu.cn（H. Yang）。#这些作者对这项工作做出了同样的伦理问题，而2D培养方法未能再现微环境并正确再现器官水平的生理学[7]。因此，出现了对更精确的三维（3D）体外模型的需求，并引入了器官芯片的概念[8]。3D生物打印技术已经展示出前所未有的能力来应对这些挑战。该技术已应用于制造具有实心[9-12]或中空结构[13-16]的人工组织构建体以及芯片上器官[17-20]，如图11所示。 1 [12，14，20，21]。通过3D生物打印，细胞，生物材料和生物活性分子以逐层方式定位在精确的空间控制下[22]。利用这种技术，可以设计具有特定几何形状和异质性的3D组织构建体，因此可以在结构和功能方面模拟其体内对应物[23]在这篇文章中，我们回顾了3D生物打印的应用。首先，我们考虑最流行的3D生物打印策略和生物墨水。接下来，我们描述了3D生物打印技术在各个领域的应用，包括制造固体组织和中空组织，以及开发器官芯片。最后，我们总结了该领域的挑战，并对该技术的未来应用提供了展望。https://doi.org/10.1016/j.eng.2019.03.0092095-8099/©2019 THE COMEORS.由爱思唯尔有限公司代表中国工程院和高等教育出版社有限公司出版。这是一篇基于CC BY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。目录可在ScienceDirect工程杂志主页：www.elsevier.com/locate/eng··778B. Zhang等人/工程5（2019）777Fig. 1. 3D生物打印技术的应用。(a)3D生物打印机（图片由Christopher Barnatt提供，©2011）;（b）固体组织的3D生物打印;（c）中空组织的3D生物打印;（d）芯片上器官的3D生物打印。(b)复制自Ref。[12]经Springer Nature许可，©2016;（d）转载自Ref.[20] 版权所有：Springer Nature，©2016。2. 生物打印策略和生物墨水2.1. 生物打印策略基于喷墨的打印（IBP）[24，25]、基于挤出的打印（EBP）[10，12]和基于光的打印（LBP）[16，26]是三种最常用的生物打印策略[21]，如图1所示。图 2 [21，27 -29]。表1比较了它们的优缺点，并列出了这些策略的应用领域[10，12，16，18，242.1.1. IBPIBP，也称为按需滴印[34]，向喷嘴施加热力[35]或声学[34]力，以便将液滴喷射到电子控制台上（图2（a））。第一个基于喷墨的生物打印机是通过修改商业惠普喷墨打印机开发的[36，37]。IBP的一个缺点是生物墨水必须处于液体形式，然后固化以形成固体构造[21]。因此，该方法只能沉积具有低粘度（3.5-12 mPa s）和低细胞密度的生物油墨由于液滴喷射后的固化延迟，IBP在垂直方向（Z轴）上的分辨率尽管如此，IBP广泛用于打印皮肤[25]、软骨[30]、骨[38，39]和血管[31，40]，因为其打印速度快、产量高、精度高、成本相对较低。2.1.2. EBPEBP沉积糊状生物材料珠而不是液滴来构建组织。与IBP相比，EBP更适合于具有更高粘度[41]和更高细胞密度（> 108细胞mL-1）的生物墨水[21]。因此，EBP有助于构建细胞密度与天然组织相当的工程组织熔融固化聚合物和细胞支持性水凝胶均可用于EBP中以构建组织和器官[42]。熔融沉积成型（FDM，图2（b）），这是一种EBP，熔融多种聚合物，如聚己内酯（PCL）[12]，聚氨酯（PU）[43]和聚乳酸（PLA），图2. 三种生物打印策略(a)具有热致动器或压电致动器的IBP;（b，c）EBP，包括（b）用于沉积熔融固化聚合物的FDM，和（c）用于细胞支持性水凝胶的DIW;（DMD：数字光调制器;UV：紫外线; AOM：声光调制器。（[21] 经Springer Nature许可，©2014;（e）转载自Ref.[28]经John Wiley and Sons许可，©2013;（f）转载自参考文献。[29]与Springer Nature许可，©2013。B. Zhang et al. / Engineering 5（2019）777-794779表1三种3D生物打印策略的比较将它们挤出以形成指定的几何图形。直接墨水书写（DIW）（图2（c））具有沉积无细胞或载有细胞的水凝胶的能力。研究人员通过设计同轴喷嘴[32]和开发多通道系统[12，43，44]扩展了EBP的能力。同轴喷嘴已广泛应用于工程微通道[45]和血管网络[32]。多通道打印系统能够制造具有高度结构和功能复杂性的组织和器械，例如软骨和骨骼[12，46，47]、肌肉组织[10，43]和肝毒性评估平台[18]。提高分辨率和减少剪切应力引起的损伤[48]是开发EBP系统的主要2.1.3. LBPLBP，包括激光辅助打印（LRP）和立体光刻（SLA），其特征在于其在所有生物打印策略中的优越速度[49]，高分辨率[50]以及缺乏材料粘度的限制[21]。基于激光诱导前向转移（LIFT）技术的激光诱导前向转移技术已用于制造皮肤样结构[51]（图2（d））。Koch等人[52]进行了参数研究，以获得最佳激光波长和脉冲持续时间。SLA方法投射光-主要是紫外（UV）光-以逐层方式光聚合水凝胶[41]。可光交联的水凝胶选择性固化以产生特定的图案和几何形状，其由数字微阵列器件（DMD）确定[53]。因此，SLA也被称为数字光处理（DLP，图2（e））。它有助于构建具有高度结构复杂性、灵活性和可扩展性的结构[26，50，53]。已经使用DLP方法开发了宽范围尺度（50-双光子聚合（2PP）提供了一种用于制造具有亚微米分辨率的3D结构的选择[29，54]（图11）。 2（f））。因此，该技术用于开发微流体装置中的精细3D结构，并复制亚微米天然样微环境[55，56]。然而，2PP的分辨率水平也阻碍了其制造速度和构建相对较大的组织类似物的能力。生物打印的最新进展集中在开发多喷嘴生物打印机。Kang及其同事[12]开发了一种具有四个墨盒模块的集成组织器官打印机（ITOP），并通过工程化下颌骨和颅骨，软骨和骨骼肌验证了其可行性。林德和同事们[20]利用了能够用四个可单独寻址的喷嘴图案化六种功能性生物墨水的生物打印机。依次或同时沉积细胞、细胞相容性水凝胶、机械强度高的聚合物和可溶性因子的能力将显著提高生物打印过程的效率，并促进具有高度结构异质性和功能复杂性的组织和器官的构建。此外，结合诸如静电纺丝的技术可以增强聚合物的聚合性。生物打印系统创建具有多种生物材料、规模和功能的组织/器官的能力。2.2. 生物墨水生物墨水-包括可打印的生物材料，细胞和其他生物制品-是用于3D生物打印的材料，用于开发组织结构和类器官。生物材料为细胞粘附、迁移、增殖和分化提供适当的微环境和结构支持。理想的生物材料应在可生产性、细胞相容性、降解特性、机械性能和可承受性方面具有良好的组织特异性[21]。细胞在基于支架的打印过程中嵌入生物材料中[57]，或者在“无支架”打印中以细胞球状体或组织链的形式直接打印这些细胞经历自组装过程以在天然样细胞外基质（ECM）中形成功能组织。表2描述了3D生物打印中使用的常见生物墨水[102.2.1. 生物材料三种类型的生物材料-熔融固化聚合物，水凝胶和脱细胞细胞外基质（dECM）-用于组织的3D生物打印和机关[42]，作为示在[10][12][15][16][20][43][45]复合材料具有独特特征的ALS也被研究。熔融固化聚合物通常在机械上坚固耐用，可用作组织工程中的结构支撑熔融固化聚合物的实例是PCL、PU和PLA。PCL是一种理想的支撑材料，因为与其他熔融固化材料相比，其熔点低（60 °C）[19]，有利于减少温度诱导的细胞损伤。基于这一特征，Lee和Cho[19]开发了一种使用PCL作为外壳材料制造肝芯片器件的使用ITOP系统，Kang et al.[12]打印的PCL在耳软骨重建和下颌骨再生中提供支撑支架，如图3（a）所示。在另一项研究中，PCL柱用于稳定3D打印的肌肉类似物，并在诱导骨骼肌细胞排列方面发挥重要作用[12]。类似地，在芯片上的心脏设备的制造中，另一个打印熔融固化聚合物PLA以形成覆盖物，以隔离暴露的线和含有细胞和培养基的孔（图3（b））[20]。PU也是一种良好的生物材料。如图3（c）所示，Merceron etal.[43]在印刷载有细胞的生物墨水之前印刷PU此外，Hsieh等人[58]合成了一类温敏性水性可降解PU分散体，并将神经干细胞嵌入其中。该分散体在约37°C下在没有交联剂的情况下经历凝胶化战略优势缺点应用参考文献IBP高速、高通量、高精度、低粘度、有限的Z分辨率和低细胞密度皮肤[25]和低成本软骨[30]骨[二十四]血管[31]EBP适用于高粘度物料，高泡孔密度，低分辨率，剪切应力引起的损伤血管[32个]和自由形态的结构软骨和骨[12个]肌肉[10]肝脏芯片[18]LBP高分辨率、复杂图案、高形状保真度，仅适用于感光材料，光致血管网络[16]并且没有粘度限制对细胞的损害和高成本皮肤[33]芯片上器官[26]780年Zhang等人/工程5（2019）777表2用于3D生物打印的生物墨水。生物墨水型优势缺点生物墨水应用参考文献熔融固化聚合物机械坚固耐用，可用作结构支撑支架需要高温或有毒溶剂，低细胞相容性PCL腕骨、骨骼和肌肉肝脏芯片[12个][十九]解放军芯片心脏[20]PU神经组织[58]肌肉[第四十三章]天然衍生天然细胞粘附性，可提供天然机械强度胶原肝脏芯片[十九]水凝胶类ECM微环境而且很难修改软骨[59]HA软骨[第六十章]海藻酸软骨[第六十一章]血管结构[第六十二章]明胶肝脏芯片[十九]琼脂糖血管网[15，63]壳聚糖软骨和骨[六十四]皮肤[第六十五章]纤维蛋白皮肤[11]肌肉[第四十三章]合成水凝胶易于操作的机械性能以及温度敏感性和光交联性生物活性与加工性GelMAPEG血管网，肝脏芯片软骨[16，26][47，66]血管网[第六十三章]Pluronic血管网[第六十七章]F-127软骨和骨[12个]肌肉[12个]dECM保留诱导组织的ECM成分打印后形状保真度较差-肌肉[10]形成骨[第六十八章]细胞球状体和高细胞密度该过程包括生成-软骨[第四十六章]组织束无需提供介质或支持和加载血管网络[第十五条]材料球体、沉积和构造处理是耗时的神经移植[69，70]HA：透明质酸; GelMA：甲基丙烯酸酯明胶; PEG：聚乙二醇。在植入载有细胞的PU结构后，斑马鱼模型受损神经系统的功能得到了拯救，这表明这种生物材料在3D生物打印神经组织的未来应用中具有潜力。然而，熔融固化聚合物的印刷需要高温或有毒溶剂，这使得这种类型的材料比其他选择的细胞相容性更差。此外，在打印过程中难以将这些聚合物与细胞支持性水凝胶是可以吸收和保留大量水含量的聚合物物质[57]。水凝胶分为天然衍生的水凝胶和合成衍生的水凝胶。它们经历物理[73]、化学[26，63]或酶促交联[11，43]以形成凝胶状结构。天然来源的水凝胶可以为细胞活性提供天然ECM样微环境。在3D生物打印中最常用的天然来源的水凝胶是胶原蛋白、透明质酸（HA）、藻酸盐、明胶、琼脂糖、壳聚糖和纤维蛋白。胶原蛋白已用于构建肝芯片以封装细胞[19]，并用于以各种浓度打印空间异质性软骨构建体[59]（图3（d））。此外，HA[60]和藻酸盐[61]用于为软骨细胞提供龛位Ouyang及其同事[71]对HA进行了改性，以便可以使用双重交联来改善其长期稳定性，如图3（e）所示。由于其经济性和易用性，藻酸盐可以打印形成血管导管[45]（Fig. 3（f）），并与RGD偶联以提供干细胞打印的温和条件[74]。 明胶在低温下保持凝胶状状态，但随着温度的升高（37 °C）很容易液化。这一特征允许明胶应用于肝芯片的开发[19]。天然衍生的水凝胶也用于构建具有分支结构的血管网络（图11）。 3（g））[15]、皮肤组织[11]和肌肉结构[43]。 虽然天然来源的水凝胶已经被广泛应用于各种组织工程领域，其机械强度低仍然是其主要限制。与天然来源的水凝胶相比，合成来源的水凝胶可以更容易地改性以改善其机械性能和细胞粘附特性。甲基丙烯酸化明胶（GelMA）、聚乙二醇（PEG）和Pluronic F-127是这类的三个实例。GelMA和PEG在光引发剂的存在下均可光交联[57]。GelMA广泛用于LBP和EBP[75]。例如，朱[16]利用GelMA水凝胶产生具有梯度通道宽度的复杂血管网络，并通过精确和快速定位三种类型的细胞来开发肝脏模型（图3（h））[26]。PEG可用作牺牲材料，在其去除时不影响细胞活力[66]，如图3（i）所示。基于PEG的水凝胶，如聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）、聚（乙二 醇 ） 甲 基 丙 烯 酸 酯 （ PEGMA ） 和 聚 （ 乙 二 醇 ） - 四 丙 烯 酸 酯（PEGTA），已被开发用于软骨和骨工程[47，76]，以及用于血管网络的构建[63]。普朗尼克F-127对温度敏感，在低温下会发生液化。它已被用作用于软骨、骨和肌肉工程的牺牲材料[12]，以及用于构建可灌注的内皮化血管通道[67]（图11和12）。3（j，k））。水凝胶生物打印的主要问题是生物活性和可加工性之间的更高的浓度和交联密度通常会导致更好的适印性和形状保真度[77]。然而，它们也导致较小的孔径和较低的细胞活力。因此，低浓度的水凝胶被用作生物打印的细胞包封材料[63，78]Yin等人[77]开发了一种新的两步法印刷低浓度GelMA（5%）和明胶（8%）的复合材料，并获得了与高浓度GelMA（30%）相似的可加工性，具有更好的细胞相容性。这是一个潜在的策略，打印水凝胶具有良好的可打印性和细胞相容性。B. Zhang et al. / Engineering 5（2019）777-794781图3.第三章。 用于3D生物打印的生物材料。（(b) 由PLA印刷的盖子，用于绝缘暴露的电线和含细胞的孔;（c）PU支架提供孔和空间，然后由载有细胞的生物墨水填充（ （h）载有hiPSC衍生的肝细胞和支持细胞的基于GelMA的水凝胶构建体的荧光图像;（i）PEG作为用于制造用于耳再生的复杂水凝胶结构的牺牲材料;（j，k）排空液化的Pluronic F-127以产生可灌注通道。（l，m）dECM：（l）脱细胞骨骼肌生物墨水的凝胶化过程，mdECM：脱细胞骨骼肌细胞外基质;（m）由脱细胞骨（DCB）ECM和PCL组成的用于骨再生的共混物（n）复合材料：一个实例是将PLA纳米纤维（NF）添加到载有细胞的藻酸盐水凝胶（Alg）中以促进人类间充质干细胞（hMSC）的细胞增殖和软骨形成分化。DI：去离子的。(a)复制自Ref。[12]经美国化学学会许可，©2016;（b）转载自参考文献[20]经Springer Nature许可，©2016;（c）转载自Ref.[43]与IOP Publishing许可，©2015;（d）转载自Ref.[59]经美国化学学会许可，©2016;（e）转载自参考文献[71]经美国化学学会许可，©2016;（f）转载自参考文献[45]经Elsevier许可，©2015;（g）转载自Ref.[15]经Elsevier许可，©2009;（h）转载自Ref.[16]经Elsevier许可，©2017;（i）转载自Ref.[66]经IOP Publishing许可，©2009;（j，k）转载自参考文献[67]经John Wiley and Sons许可，©2014;（l）转载自Ref.[10]经John Wiley and Sons许可，©2016;（m）转载自Ref.[68]经美国化学学会许可，©2016;（n）转载自参考文献[72]经美国化学学会许可，©2016。dECM克服了上述缺点，因为它保留了ECM组件[57]。Perniconi等人[79]证明了从小鼠中获得的无细胞支架支持肌纤维的形成，这表明dECM可以在该过程中提供Pati软骨和心脏组织dECM生物墨水，并验证了这些组织特异性dECM材料在3D生物打印中的可行性。功能性骨骼肌构建体是使用来源于骨髓的dECM生物墨水制造的（图3（l）），其提供肌生成微环境[10]。此外，782B. Zhang等人/工程5（2019）777在dECM-PCL支架中的人脂肪源性干细胞的成骨基因的表达（图11）。 3（m）），表明脱细胞ECM材料在骨再生中的有效性[68]。然而，印刷后的形状保真度差，必须在未来解决此外，由于其来源，dECM从实验室转化为临床环境时可能复合材料结合了每种组分的优点，并潜在地改善了组分在机械强度、可印刷性、生物相容性和凝胶化特性方面的性能。例如，通过将各种纳米纤维引入水凝胶中，可以显著改善水凝胶的机械性能，并且可以增强其细胞活性。Dolati等人[13]报告称，添加碳纳米管增强了藻酸盐基血管导管的强度。由纳米原纤化纤维素和藻酸盐组成的生物墨水不仅表现出良好的形状保真度，而且还支持用于耳软骨重建的人鼻软骨细胞（hNC）的增殖和再分化[61]。如图3（n）所示，在PLA-β-纤维素增强的生物墨水中观察到更高水平的细胞增殖和代谢活性，并且表现出软骨形成分化[72]。认为这些多尺度的微环境线索通过纳米纤维的接触引导和水凝胶基质的定制渗透性来控制细胞的行为[81]。凝胶化特性可以通过混合各种生物材料来调节。通过将PEGDA和GelMA水凝胶与基于曙红Y的光引发剂混合来实现可见光可固化材料[82]。经历双重交联的改性HA表现出比客体-主体组装或单独光聚合更好的长期稳定性[71] 。Alginate–GelMA-based bioinks, which alsounderwent dual-step gelation, were used in the bio- printing ofperfusable vascular constructs and a heart-on-a-chip device 此外，通过将纳米材料如金纳米颗粒或碳纳米管引入生物墨水中，可以开发电活性组织[84]并操纵其导电性。此外，打印后修改，包括结构重构和表面功能化，已被实现以增强3D生物打印的能力并改善工程生物材料的生物功能[85]。2.2.2. 细胞球状体和组织束组织/器官的形成需要适当的细胞间信号传导和自主组织，以便可以发育生理结构[21]。当用作生物墨水时（图4），细胞球状体和组织链可以模拟天然组织和器官的发育过程。Jakab等人[86]通过实验和模拟研究验证了使用球形细胞聚集体作为生物墨水的可行性。细胞球状体模式的时间演变如图所示。 4（a）.在长期孵育后可以观察到融合。图4（b）显示了在Norotte及其同事[15]进行的一项研究中，通过将细胞类球体沉积到琼脂糖棒模具上构建的结构;该结构显示有助于构建单层和双层血管导管。在最近的一项研究中，Yu等人。[46]通过将细胞显微注射到藻酸盐胶囊中来产生“组织链”（图11和12）。 4（c，d））。在细胞聚集后，无支架的组织束可以直接打印在“生物纸”上，由于细胞球状体和组织链是通过直接组装细胞产生的，因此使用这两种类型的材料可以实现高细胞密度。当开发人工组织如心肌组织和血管时，高细胞密度是至关重要的[15]。因此，这些生物墨水可能在开发具有致密血管网络的长寿命功能组织2.2.3. 细胞来源目前用于3D生物打印的细胞来源是各种类型的原代细胞或干细胞。通过以预定模式沉积多种原代细胞类型，打印的构建体可以模拟其体内对应物的功能。 然而，许多类型的原代细胞的有限寿命限制了移植后工程化构建体的长期功能见图4。细胞球状体和组织链作为生物墨水。（a，b）细胞球状体：（a）细胞球状体模式的时间演变;（b）融合成管状和分支结构的细胞球状体。（c，d）组织链：（c）8 cm长的组织链;（d）由藻酸盐胶囊支撑的聚集细胞沉淀。(a)经美国国家科学院许可，复制自参考文献[86]，©2004;（b）复制自参考文献[86]，[15]经Elsevier许可，©2009;（c，d）转载自参考文献。[46]在Springer Nature的许可©2016.B. Zhang et al. / Engineering 5（2019）777-794783[21]. 因此，干细胞由于其寿命长、自我更新和多能性/多能性而成为一种有前景的选择[21]。胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）具有分化为任何细胞类型的能力，并具有长期增殖潜力[87]。干细胞的分化主要受生物、化学和物理因素的影响[88]。虽然已经进行了研究，通过沉积具有限定空间梯度的生长因子来调节细胞微环境[89]，但干细胞分化的潜在机制除了为干细胞设计合适的微环境之外，还需要打印过程提供合适的物理提示，例如剪切应力，同时保持干细胞的高活力和多能性例如，Ouyang et al.[90]系统地研究了3D生物打印参数对干细胞活力，增殖和多能性维持的影响在参数优化后，他们成功地设计了具有90%活力的ESC负载构建体，并且ESC在打印后保持未分化状态。打印ESC和iPSC的一个挑战是致瘤性风险[91];还应考虑伦理问题[88]。成体干细胞（ASC）是能够自我更新的未分化干细胞这些可以来自各种来源，如骨髓、脂肪组织和肝脏[92]。来源于骨髓[93]和脂肪组织[94]的间充质干细胞（MSC，ASC的一种）已用于生物打印人工组织。[76，95]。MSC被认为是较低的致瘤性[91]，因此比ESC和iPSC更安全。虽然干细胞打印仍处于起步阶段，但3D生物打印技术和干细胞技术的结合已显示出工程组织和器官的前景。此外，这种组合可能用于开发患者特定的疾病模型和药物测试平台。3. 固体组织实体组织被定义为内部没有中空结构的组织。研究人员已经3D生物打印了用于组织再生的固体组织。[2019 - 04 - 19][2019- 04] [2019 -05][23.1. 软骨和骨软骨和骨是人体中机械强度最高的组织软骨和骨的研究最近集中在改善机械性能和实现患者特定的几何形状[100]。此外，骨软骨界面和打印部件与天然组织之间的界面在修复骨软骨缺损中起着至关重要的作用[101]。软骨是弹性连接组织，构成耳、鼻和关节的主要部分（图5（a-c））。关节软骨由于其复杂的分层结构而引起了人们的极大兴趣图5. 软骨和骨骼的3D生物打印（a-c）软骨的3D生物打印：（a）软骨的分层结构;（b）使用丙烯酸化PEG水凝胶同时光聚合喷墨打印软骨栓;（c）组合IBP和静电纺丝的混合打印方法。（（g，h）骨软骨界面构建：（g）不同厚度的骨软骨缺损，包括部分软骨缺损、全软骨缺损和骨软骨缺损[103];（h）修复骨软骨缺损的模块化组织组装策略[107]。(a)经Springer Nature许可，转载自参考文献[102]，©2014;（b）转载自参考文献[24]，John Wiley and Sons许可，©2015;（c）经IOP Publishing许可，转载自参考文献[96];（d）经IOP许可，转载自参考文献[98]出版，©2009;（e）转载自Ref.[68]经美国化学学会许可，©2016;（f）转载自参考文献[39]经Elsevier许可，©2016;(g)经Mary Ann Liebert，Inc.许可，转载自参考文献[103]，©2014;（h）经Springer Nature许可，转载自参考文献[107]，©2016。--784B. Zhang等人/工程5（2019）777（图5（a）），从关节面到钙化软骨的深度[102]。这些层涉及不同的骨软骨缺损：部分软骨缺损、完全软骨缺损和骨软骨缺损[103]。IBP策略已用于直接软骨修复，同时进行UV聚合[24，30]（图5（b））。然后将电纺丝系统与IBP系统整合（图5（c）），以产生机械强度更高的组织构建体[96]。打印的软骨组织的发育可能会受到生物墨水特性的显著影响。据报道，藻酸盐和琼脂糖水凝胶支持透明样软骨的发育，而GelMA和基于PEGMA的水凝胶支持更像纤维软骨的组织的发育[47]。纳米原纤化纤维素[61，97，104]和PLA纳米纤维[72]已与载有细胞的藻酸盐水凝胶组合，以提高细胞密度并增强机械强度。由于高密度胶原的机械稳定性和维持细胞生长的能力，高密度胶原被认为是人工软骨承重应用中的优选材料[59]。用于骨再生和修复的3D生物打印的研究已经使用EBP和IBP两者进行（图1A和1B）。 5（d-f））。Sawkins及其同事[98]打印了基于PLGA的结构，其屈服应力和杨氏除了高机械强度之外，血管生成和成 骨 在 功 能 性 骨 植 入 物 的 制造 中 是 至 关 重 要 的 使 用 脱 细 胞 骨（DCB）基质和PCL作为生物墨水（图1）。 5（e）），人脂肪来源的干细胞表现出成骨基因的显著上调[68]。Lv及其同事[105]将血管内皮生长因子（VEGF）的受控释放与3D生物打印相结合，以改善骨生成和血管生成。 IBP策略用于将粘合剂液滴沉积到粉末上（图11）。 5（f）），如羟基磷灰石（HA）和磷酸三钙（TCP），以制造骨样结构[38，39]。构建骨软骨界面（图5（g，h））是工程化骨软骨植入物最具挑战性的部分[106]，特别是对于从关节面到软骨下骨的全层骨软骨缺损（图5（g，h））。 5（g））。模块化组装策略（图 5（h））用于骨软骨损伤修复，由Schon及其同事提出[107]。3D生物打印在这一领域显示出了希望，因为它能够将各种材料精确地沉积到多层梯度结构中。丙烯酸酯化PEG水凝胶的同时UV光聚合显著增强了成骨和成软骨分化[24]。总之，应进行进一步研究，以设计具有梯度结构[108]和更好机械性能的骨软骨结构梯度结构可以潜在地与软软骨和硬软骨下宿主环境整合。应构建合适的微环境以促进细胞增殖和分化。应将生长因子及其受控释放整合到打印过程中，以改善工程构建体的功能。3.2. 皮肤皮肤是人体最大的器官，作为第一道防御屏障，在免疫系统中发挥着重要作用[109]。皮肤病、烧伤、糖尿病足溃疡和皮肤坏死是皮肤缺损的主要原因，需要大量的皮肤替代品进行治疗。由于大多数国家禁止在动物身上进行化妆品试验，因此化妆品行业迫切需要功能性人造皮肤[110]。功能性皮肤模型的基础是具有真皮和表皮的双层首先实施基于喷墨的3D自由成型制造（FF），以打印具有胶原蛋白的成纤维细胞和角质形成细胞，以在水凝胶支架中形成真皮/表皮样独特层[111]（图6（a））。以类似的实验中，在空气-液体界面处构建并培养与手动沉积模型相比，打印的皮肤组织表现出更好的形状保真度，并且表现出不同的表皮和真皮层（图6（c））。为了克服用胶原或藻酸盐制造良好形状的3D支架结构的困难，Kim及其同事开发了一种新型低温绘图系统[113]，如图所示。 6（b）. 将胶原蛋白溶液在40°C下逐层铺放，然后置于冷冻干燥器中，76℃下培养3d。该结构具有98%的孔隙率，与共培养的角质形成细胞和成纤维细胞的良好性能。然后，同一小组设计了由外部胶原蛋白和内部藻酸盐组成的混合（核/壳）支架，以提高这些皮肤支架的机械稳定性[114]（图6（d））。与纯胶原支架相比，这些混合支架的杨氏模量增加了约7倍，而根据体外和体内测试，生物相容性处于相似的水平（图1）。 6（e））。将羊水来源的干细胞（AFS）和骨髓来源的MSC重悬于纤维蛋白-胶原凝胶中，并通过IBP策略打印在裸鼠的伤口部位上[25]（图1B）。 6（f））。与对照组相比，愈合率Kim及其同事[115]通过结合EBP和IBP策略设计了一种皮肤模型用功能性transwell系统在单步过程中制造人类皮肤模型，其成本比传统培养低50倍，培养基少10倍（图1）。 6（g））。除了EBP和IBP之外，还采用了EBP方法来打印细胞级分辨率皮肤[51]。包埋在胶原凝胶中的NIH-3 T3成纤维细胞和人角质形成细胞用作生物墨水，并打印在MatridermTM片上;生物墨水层证明了生物墨水的微图案化能力（图11）。 6（h））。采用裸鼠背部皮褶腔来评估人工组织的进一步功能[33]（图11）。 6（i））。在小鼠的伤口区域中发现了新的血管。到目前为止，大多数皮肤打印研究都集中在表皮和真皮的几何结构然而，皮肤替代物的血管化对于临床应用具有重要意义采用3D生物打印技术结合使用iPSC衍生细胞的组织工程来研究工程化人类皮肤构建体的血管化[99]（图6（j））。建立了微图案化的血管网络，并证明了在愈合期间促进和引导新血管形成研究发现，嵌入工程皮肤替代物中的内皮祖细胞和脂肪源性干细胞可加速体内新生血管形成[116]。应进一步检查皮肤的血管化以及继发性和附属结构的受累情况。最近，已经进行了研究，以开发具有在真皮-表皮连接处精确打印的黑素细胞的色素皮肤结构[117，118]。这些结果意味着完全功能性的皮肤替代品可以通过3D生物打印技术进行工程设计。3.3. 肌肉由于其在肌肉疾病和损伤的治疗以及药物研究中的潜力，肌肉的打印引起了许多研究兴趣，如图7所示[10，12，20，43，83，119]。收缩性和肌生成是构成功能性肌肉的基础Choi等人[10]制备了一种基于脱细胞骨骼肌细胞外基质（mdECM）的新型生物墨水，并为细胞增殖、肌管形成和肌源性分化提供了适当的肌源性微环境（图7（a））。Merceron及其同事[43]打印了一个肌肉-B. Zhang等/工程学5（2019）777-794785图第六章 3D生物打印皮肤 （a-e）用于皮肤重建的EBP：（a）多层皮肤细胞和胶原蛋白的逐层打印的示意图;（b）低温绘图系统和3D支架的制造程序的示意图;（c）3D皮肤组织的构建;（d）核/壳皮肤支架的表面扫描电子显微照片（SEM）;（e）用支架处理的移植区域的组织学显微照片，产生的脉管系统由箭头指示。（f，g）用于皮肤重建的IBP：（f）愈合方法的示意图;（g）描述结合EBP和IBP的细胞打印策略的示意图。（h-j）用于皮肤重建的LBP：（h）激光打印装置的草图及其多层结构的荧光照相术;（i）插入裸鼠伤口中的组织工程化皮肤构建体;（j）皮肤制造过程和血管化模型的开发的示意性描述。(a)经Elsevier许可，转载自参考文献[111]，©2009年;（b）转载自参考。[113]经皇家化学学会许可，©1991;（c）转载自参考文献。[112]经Mary Ann Liebert，Inc.许可©2014年;（d，e）转载自Ref。[114]经皇家化学学会许可，©1991;（f）转载自参考文献。[25]经John Wiley and Sons许可，©2012;(g)转载自Ref。[115]经IOP出版社许可，©2009;（h）转载自参考文献。[51]经John Wiley and Sons许可，©2012;（i）转载自Ref.[33];（j）转载自参考文献。[99]经John Wileyand Sons许可，©2016。PCL-成纤维细胞肌腱末端（图7（b））。在打印后7d显示出高的细胞活力（> 80%）这些结果表明打印具有可接受的弹性和强度的肌肉的可能性工程肌肉组织的特征激发了对仿生细胞机器和微电机的研究[120]。Cvetkovic和同事[119]开发了一种肌肉动力生物机器（图7（d））。通过施加电刺激，触发肌细胞的收缩。功能性肌肉构建体可用于治疗损伤和开发用于毒性评估的器官芯片。Kang等人[12]制造了一种骨骼肌结构（图7（c）），并将其与插入的腓总神经皮下植入。有组织的肌肉纤维和神经支配能力当植入两周后收获肌肉结构时，证实了这一点心脏组织工程被认为是治疗心肌梗死（MI，也称为心脏病发作）的一种有前途的方法[121]。已经做出了许多努力来通过3D生物打印构建可收缩和功能性心脏补片[122，123]。Zhang及其同事[83]通过将心肌细胞接种到内皮化水凝胶支架中研究了心脏组织的血管化（图7（e））。将类器官嵌入灌注微流体生物反应器中使该平台能够模拟心血管疾病并评估心血管毒性。Lind等人[20]通过将软应变计传感器与打印的层状心脏组织集成，开发了一种芯片上的心脏（图7（f）），786B. Zhang等人/工程5（2019）777图第七章肌 肉 组 织 的 3D生物打印（(c) 使用PCL支持、牺牲性Pluronic F-127和载有细胞的水凝胶进行骨骼肌重建;（d）由收缩性工程化肌肉条提供动力的细胞机器（生物机器人）[119]。（e，f）心肌的3D生物打印：（e）用心肌细胞接种的内皮化水凝胶支架，用于开发心血管毒性评估平台;（f）具有集成软应变计传感器的心脏微生理设备（芯片上的心脏）的原理。(a)经John Wiley andSons许可，转载自参考文献[10]，©2016;（b）转载自参考文献[43]经IOP出版社许可，©2009;（c）转载自参考文献。[12]第十二话Springer Nature，©2016;（e）转载自Ref.[83]经Elsevier许可，©2016;（f）转载自Ref.[20]经Springer Nature许可，©2016。观察到组织收缩。他们研究了结构对两种药物的反应，并研究了长期培养中的收缩发育。4. 中空组织中空组织的3D生物打印与固体组织不同，因为其结构复杂性更高血管是主要在3D生物打印领域中研究的中空组织。脉管系统的长度尺度范围从微米