日本肠道微生物组的基因组特征及其与饮食、人群和疾病的相关性

0资源0从787个日本肠道宏基因组中恢复的原核和病毒基因组揭示了与饮食、人群和疾病相关的微生物特征0图解摘要0亮点0d  从日本肠道宏基因组中组装了19,084个原核和31,395个病毒基因组0d  在日本微生物基因组中观察到了与传统日本食品相关的特征0d  crAss-like噬菌体与人群和疾病相关联0d  噬菌体及其宿主的丰度倾向于呈正相关0作者0Yoshihiko Tomofuji, Toshihiro Kishikawa,Yuichi Maeda, ..., Kiyoshi Takeda, AtsushiKumanogoh, Yukinori Okada0通讯 ytomofuji@sg.med.osaka-u.ac.jp(Y.T.), yokada@sg.med.osaka-u.ac.jp(Y.O.)0简而言之0Tomofuji等人从日本肠道宏基因组shotgun测序数据中重建了19,084个原核和31,395个病毒基因组。他们揭示了肠道微生物组与饮食、人群和疾病的关联。他们的基因组目录JMAG和JVD有助于扩大以前代表性不足的人群的微生物基因组的多样性。0Tomofuji等，2022年，Cell Genomics  2 , 100219 2022年12月14日  ª2022 The Author(s). https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100219 ll0从787个日本肠道宏基因组中恢复的原核和病毒基因组揭示了与饮食、人群和疾病相关的微生物特征0Yoshihiko Tomofuji, 1,2, *  Toshihiro Kishikawa, 1,3,4 Yuichi Maeda, 2,5,6 Kotaro Ogawa, 7 Yuriko Otake-Kasamoto, 8 Shuhei Kawabata, 9 TakuroNii, 5,6 Tatsusada Okuno, 7 Eri Oguro-Igashira, 5,6 Makoto Kinoshita, 7 Masatoshi Takagaki, 9 Naoki Oyama, 10 Kenichi Todo, 7 KenichiYamamoto, 1,11,12 Kyuto Sonehara, 1,2 Mayu Yagita, 5,6 Akiko Hosokawa, 13 Daisuke Motooka, 2,14 Yuki Matsumoto, 14 Hidetoshi Matsuoka, 15Maiko Yoshimura, 15 Shiro Ohshima, 15 Shinichiro Shinzaki, 8 Shota Nakamura, 2,14 Hideki Iijima, 8 Hidenori Inohara, 3 Haruhiko Kishima, 9Tetsuo Takehara, 8 Hideki Mochizuki, 7 Kiyoshi Takeda, 6,16 Atsushi Kumanogoh, 2,5,17 and Yukinori Okada 1,2,12,18,19,20,21, * 1 Department ofStatistical Genetics, Osaka University Graduate School of Medicine, 2-2 Yamadaoka, Suita 565-0871, Japan 2 Integrated Frontier Research forMedical Science Division, Institute for Open and Transdisciplinary Research Initiatives, Osaka University, Suita 565-0871, Japan 3 Department ofOtorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Osaka University Graduate School of Medicine, Suita 565-0871, Japan 4 Department of Head andNeck Surgery, Aichi Cancer Center Hospital, Nagoya 464-8681, Japan 5 Department of Respiratory Medicine and Clinical Immunology, OsakaUniversity Graduate School of Medicine, Suita 565-0871, Japan 6 Laboratory of Immune Regulation, Department of Microbiology andImmunology, Osaka University Graduate School of Medicine, Suita 565-0871, Japan 7 Department of Neurology, Osaka University Graduate Schoolof Medicine, Suita 565-0871, Japan 8 Department of Gastroenterology and Hepatology, Osaka University Graduate School of Medicine, Suita565-0871, Japan 9 Department of Neurosurgery, Osaka University Graduate School of Medicine, Suita 565-0871, Japan 10 Department of StrokeMedicine, Kawasaki Medical School, Kurashiki 701-0192, Japan 11 Department of Pediatrics, Osaka University Graduate School of Medicine, Suita565-0871, Japan 12 Laboratory of Statistical Immunology, Immunology Frontier Research Center (WPI-IFReC), Osaka University, Suita 565-0871,Japan 13 Department of Neurology, Suita Municipal Hospital, Suita 564-8567, Japan 14 Department of Infection Metagenomics, Research Institutefor Microbial Diseases, Osaka University, Suita 565-0871, Japan 15 Department of Rheumatology and Allergology, NHO Osaka Minami MedicalCenter, Kawachinagano 586-8521, Japan 16 WPI Immunology Frontier Research Center, Osaka University, Suita 565-0871, Japan 17 Department ofImmunopathology, Immunology Frontier Research Center, Osaka University, Suita 565-0871, Japan 18 Laboratory for Systems Genetics, RIKENCenter for Integrative Medical Sciences, Tsurumi 230-0045, Japan 19 Center for Infectious Disease Education and Research, Osaka University, Suita565-0871, Japan 20 Department of Genome Informatics, Graduate School of Medicine, the University of Tokyo, Tokyo, Japan 21 Lead contact*通讯:  ytomofuji@sg.med.osaka-u.ac.jp  (Y.T.),  yokada@sg.med.osaka-u.ac.jp  (Y.O.) https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.1002190总结0我们从787个日本肠道宏基因组中重建了19,084个原核生物和31,395个病毒基因组，作为日本宏基因组组装基因组（JMAG）和日本病毒数据库（JVD），这是单个人群的大型微生物基因组数据集。JMAG中的枯草芽孢杆菌和b-多糖酶的种群特异性富集可能源自日本传统食品纳豆（发酵大豆）和紫菜（海苔）。与东亚特异性错义变异体rs671:G>A在ALDH2中与乳制品相关的肠球菌B乳杆菌和热带链球菌名义上相关。在JVD中的物种水平病毒基因组聚类中，62.9%是新的。crAss-like噬菌体在日本人中的组成较低，而在非洲和大洋洲人中相对较高。对crAss-like噬菌体与疾病之间的关联的评估显示了显著的疾病特异性关联。我们的大型病毒-宿主对目录确定了病毒丰度与宿主之间的正相关关系。0介绍0人类微生物组是栖息在人体内的复杂微生物群落。人类最大的社区0微生物群落存在于肠道内，它们通过免疫系统和代谢反应与宿主体相互作用。因此，了解人类肠道微生物组对微生物学和医学都很重要。0细胞基因组2，100219，2022年12月14日©2022作者。本文是根据CCBY-NC-ND许可证的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。0ll0开放获取0A B0C D E0图1.JMAG基因组的系统发育分析（A）饼图显示了JMAG的门水平系统发育组成，它在UHGG中具有相应的物种水平聚类（顶部）或没有（底部）。构成每个基因组集<1%的门被折叠成“其他”。（B）从1,267个物种水平代表性细菌MAG重建的最大似然系统发育树。节点的颜色表示物种水平聚类是否在UHGG中具有相应的聚类（海军蓝色）或没有（品红色）。外环表示门水平的分类注释。树的外围绘制的条形图表示属于相同聚类的MAG的数量。（C）散点图表示物种水平聚类中JMAG基因组的数量（x轴）和不是源自日本的UHGG基因组属于相应物种水平聚类的数量（y轴）。点的颜色表示门水平分类。包含R 10 JMAG基因组和% 1 UHGG基因组的六个物种水平聚类由菱形表示。0（图例续于下一页）02细胞基因组2，100219，2022年12月14日0资源0ll0开放获取ll0在肠道微生物组研究中，单个微生物的基因组序列是重要的资源，它们本身反映了肠道微生物组的多样性和功能，并且可以作为用于定量测序（MSS）数据的参考基因组。因此，人们花费了大量精力来扩展肠道微生物基因组的目录。除了培养努力外，来自肠道MSS数据的2-4基因组组装和分箱极大地扩展了人类肠道微生物组的已知多样性。5-7从大规模人类MSS数据中恢复代谢组装的基因组（MAGs）使我们能够调查肠道微生物组的以前未知部分，特别是不可培养的原核生物。最近，几个微生物基因组数据库，包括MAG数据集，被整合，发布了统一的人类胃肠基因组（UHGG）收藏，包括4,644个物种水平基因组，代表了>200,000个非冗余参考基因组，是目前最全面的人类肠道原核生物图谱。8然而，目前原核基因组的人群多样性仍然有限，因为从欧洲、北美和中国以外的人群中恢复的MAG数量相对较低。因此，有必要重建目前代表性不足人群的MAG。尽管许多肠道微生物组研究都集中在原核生物上，但病毒，主要是噬菌体，在肠道微生物组中也非常丰富。9噬菌体感染细菌，并通过溶解宿主或改变其生理功能来调节细菌群。除了调节作用外，肠道病毒被认为通过免疫系统直接与我们的身体相互作用。10,11各种疾病，如肠道疾病12,13和代谢性疾病14,15与肠道病毒组相关。然而，大多数人类肠道病毒组仍然了解不足，部分原因是传统的实验室技术，如培养，通常吞吐量低，并且不适用于某些病毒。为了克服这一问题，病毒基因组已经从MSS数据中恢复，并且病毒基因组的新组装极大地扩展了病毒基因组的库存，并使我们能够揭示肠道病毒组的一部分。16,17例如，crAss-like噬菌体，是人类肠道病毒组的主要组成部分之一，最早是通过MSS数据的交叉组装在2014年发现的。18最近，一些研究从大规模MSS数据中恢复了病毒基因组。19,20然而，肠道病毒基因组的多样性仍然没有饱和，目前病毒基因组的人群多样性仍然有限，就像原核生物一样。日本人有独特的饮食文化和习惯，这导致了肠道微生物组的独特特征，例如富集降解海藻多糖酶、21碳水化合物代谢相关基因和放线菌门，与其他人群相比。220然而，大多数先前的研究都使用了参考细菌0用于系统发育分析的参考基因组的覆盖率较低。因此，尚未充分评估未被参考数据集覆盖的肠道微生物的存在。此外，以前对肠道微生物基因的分析缺乏基因与其来源基因组之间的联系，这阻碍了我们对微生物基因的分类特征的理解。此外，很少有研究关注日本肠道病毒组，16并且从日本肠道宏基因组中恢复的公开可用病毒基因组数量很少。因此，从日本肠道宏基因组中恢复MAGs和病毒基因组对于深入了解日本肠道微生物组是必要的，并通过增加人群多样性来补充微生物基因组数据库。我们从787名日本个体的肠道MSS数据中恢复了MAGs和病毒基因组。利用这些重建的微生物基因组，我们评估了特定于日本的微生物分类单元和基因的存在，揭示了crAss-like噬菌体与人群和疾病的关联，并扩展了当前对病毒-原核生物相互作用的认识。重建的微生物基因组和相关信息可供科学界使用。0结果0从日本MSS数据中重建MAGs为了从日本肠道中恢复MAGs，我们对787个日本肠道MSS数据进行了单样本宏基因组组装和分箱（图S1；表S1）。在基于CheckM29的过滤后（>50%基因组完整性，<5%污染，并且估计质量分数>50；STAR方法），我们获得了19,084个符合或超过‘‘关于宏基因组组装基因组的最低信息’’标准30（R50%基因组完整性和<10%污染；图S2A-S2J；表S2；数据S1）的MAGs，我们将这组MAGs称为JMAG（日本宏基因组组装基因组）。我们将>90%基因组完整性和<5%污染的11,917个MAGs称为根据UHGG的标准为近完整。0然后，根据平均核苷酸同源性（ANI），将JMAG基因组聚类为1,273个物种水平的聚类。尽管一些物种水平的聚类在UHGG中具有相应的聚类（由18,734个MAGs组成的1,040个聚类），但其他聚类则没有（由350个MAGs组成的233个聚类）。我们使用GTDB-tk31为JMAG基因组分配了分类信息，并构建了最大似然系统发育树。在UHGG中呈现的JMAG基因组中，厚壁菌门_A、Bacteroidota和放线菌门_A频繁（图1A）。在UHGG中未呈现的JMAG基因组中，放线菌门_A的频率高于其他MAGs，这反映了拟杆菌属属的高物种水平多样性（图1A和1B）。0（D）不同群体中枯草芽孢杆菌丰度（RPKM）的箱线图。箱线图显示了中位数（中心线）和IQR（箱边），并且触须延伸到范围内的最极端点（下四分位数 - [1.5 *IQR]）和（上四分位数 + [1.5 * IQR]）。（E）枯草芽孢杆菌基因组的非度量多维标度图。点的颜色代表基因组的来源。GenBank中的枯草芽孢杆菌natto和枯草芽孢杆菌168基因组被注释并呈菱形。IQR，四分位距。另见图S1-S4，表S2和数据S1和S2。0细胞基因组 2，100219，2022年12月14日30资源0开放获取ABCD0（图例见下一页）04细胞基因组2，100219，2022年12月14日0资源0ll0开放获取0评估JMAG代表基因组在日本肠道微生物多样性中的代表性，我们将肠道MSS数据映射到1,273个JMAG代表基因组。至于日本肠道MSS数据，与4,644个UHGG代表基因组相比，对1,273个JMAG代表基因组的映射比率几乎与UHGG相当，尽管JMAG中的基因组数量较UHGG少（一致映射读数，JMAG为75.2％，UHGG为78.6％；总映射读数，JMAG为82.6％，UHGG为86.4％；图S2K和S2L）。合并4,644个UHGG代表基因组和233个JMAG代表基因组，这些基因组在UHGG中不存在，只略微提高了映射比率（一致映射读数，79.1％；总映射读数，86.9％）。请注意，JMAG和UHGG之间的映射比率差异在日本以外的其他人群中更大。为了评估JMAG是否包含了在非日本人群中代表性不足的原核物种，我们比较了JMAG基因组在物种水平聚类中的数量和属于相应物种水平聚类的非日本UHGG基因组的数量（图1C）。我们发现，与UHGG相比，JMAG中有六个物种水平聚类富集（R10 JMAG基因组和％1UHGG基因组）。这些物种水平聚类中的MAGs，特别是未分类的Acutalibacteraceaem和枯草芽孢杆菌，具有几种在JMAG中特有的碳水化合酶（CAZymes）（图S3A和S3B），这表明它们可能在日本肠道微生物组中具有独特的代谢功能。这些CAZymes在目前最大的肠道微生物蛋白数据库Uni�ed HumanGastrointestinal Protein（UHGP）中代表性不足（图S3B），并且在日本人中比其他人群更丰富（图S3C）。因此，JMAG捕获了以前研究中代表性不足的肠道微生物特征的一部分。枯草芽孢杆菌在JMAG中经常出现（26个MAGs），而在UHGG中只包括一个孤立的基因组。枯草芽孢杆菌在日本人中比其他人群更常见，也是基于读数的定量方法（图1D）。为了揭示JMAG和UHGG中枯草芽孢杆菌基因组的系统发育特征，我们检索了GenBank中可用的162个枯草芽孢杆菌基因组进行比较分析。JMAG中的枯草芽孢杆菌基因组通过ANI基于非度量多维缩放分析（图1E、S4A和S4B；数据S2）与枯草芽孢杆菌natto紧密相关。枯草芽孢杆菌natto是日本传统发酵食品natto的关键组成部分。因此，这表明JMAG中的枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌0納豆及其在JMAG中的频繁存在与UHGG相比是日本独特饮食的结果。0b-多糖酶的分类和人群注释为了获得对重建的MAGs的功能洞察，我们预测了JMAG基因组中的43,043,613个假定蛋白，并对其进行了功能注释。对于频繁重建的类群，如厚壁菌门_A、Bacteroidota和放线菌门，大多数预测蛋白都被eggNOG-mapper覆盖，而它们包括大量功能未知的蛋白（图S5A）。对于某些类群，如蓝藻门和梵克微生物门，数据库覆盖率和功能注释比率（具有任何eggNOG-mapper命中和功能上特征化的COG注释的蛋白比率，详见STAR方法）相对较低（图S5A）。我们发现了部分蛋白的门的特异性。例如，GH92（dbCAN2）和susD（京都基因和基因组百科全书[KEGG]基因）主要来自Bacteroidota（图S5B–S5E）。我们将JMAG的预测蛋白序列与UHGP合并，并通过100%、95%、90%和50%序列同源性进行聚类，评估了两个数据集之间的重叠。在包括JMAG中预测蛋白的聚类中，46.1%、19.6%、16.2%和9.5%仅在JMAG中检测到（图S5F）。在JMAG中的蛋白中，我们专注于b-多糖酶，它催化海藻来源的多糖，即海带多糖的水解。先前的研究在Phocaeicolaplebeius（从Bacteroidesplebeius改名）基因组中鉴定了b-多糖酶，并揭示了b-多糖酶在日本肠道中可检测到，但在欧洲肠道中不可检测21，因为日本人食用由海带制成的紫菜。然而，由于当时肠道MSS数据的有限可用性，其分类起源和人群模式尚未得到充分评估。我们在JMAG和UHGP中鉴定了推测的b-多糖酶序列，它们都与已知的b-多糖酶序列在最大似然系统发育树上紧密相关，表明我们的分析成功地将b-多糖酶与其他相关蛋白区分开来（图2A）。在JMAG中的b-多糖酶序列中，有三个序列（JPN-Por1、JPN-Por-2和JPN-Por-5）也包括在UHGG中（氨基酸同源性[AAI] >99%），而其他五个序列仅包括在JMAG中（图S6A）。我们在JMAG中检测到133个b-多糖酶序列（比率=133/43,043,613=3.09 3 10 �6），在UHGP中检测到245个b-多糖酶序列（比率=245/625,255,473=3.92 3 10 � 7），这表明0图2.JMAG和UHGP中b-多糖酶的系统发育和种群间分析（A）JMAG和UHGG中检测到的b-多糖酶序列的最大似然系统发育树。b-多糖酶蛋白及其相关蛋白（b-琼脂酶和k-卡拉胶酶）也被用于重建系统发育树。节点的颜色和形状代表基因的来源和名称。（B）饼图表示与b-多糖酶蛋白相关的MAGs的系统发育组成，分别在门水平（顶部）和属水平（底部）。描述了JMAG（左）和UHGG（右）的结果。构成每个基因组集的门所占比例小于1％的门被合并为“其他”。（C）饼图表示b-多糖酶相关MAGs的区域（顶部）和国家（底部）水平的来源。（D）不同人群中b-多糖酶丰度的箱线图。箱线图显示了中位数值（中心线）和IQRs（箱线边缘），晶须延伸到范围内最极端的点（下四分位数- [1.5 * IQR]）和（上四分位数+ [1.5 *IQR]）。IQR，四分位距。另请参见图S5和S6。0细胞基因组2，100219，2022年12月14日50资源0ll0开放获取ll0b-多糖酶在日本来源的肠道原核基因组中比主要来源于其他人群的肠道原核基因组更常见。我们评估了b-多糖酶的分类起源，并发现大多数分类起源是Bacteroidota（JMAG中为78.9％，UHGP中为93.9％），尽管Firmicutes_A来源的b-多糖酶蛋白也在JMAG和UHGP中检测到（分别为18.8％和5.3％；图2B）。在属水平上，我们检测到Phocaeicola和Bacteroides是JMAG和UHGP中b-多糖酶的主要来源。我们还评估了UHGP中b-多糖酶的人群模式，并发现大多数b-多糖酶序列来自亚洲人群（图2C）。至于国家级别的注释，尽管中国人群中b-多糖酶序列的比例低于日本人群（比例=177/125,294,874=1.41*10^-6，中国和13/2,048,327=6.35*10^-6，日本），但仍高于其他国家级别的注释，如美国、西班牙和丹麦（比例=13/113,161,322=1.15*10^-7，11/43,819,760=2.51*10^-7，9/59,342,818=1.52*10^-7，分别；图2C）。在基于读数的定量中，b-多糖酶在日本人中比其他人群更丰富（图2D和S6B）。因此，我们复制了b-多糖酶在日本肠道代谢组中的高频率，并新发现b-多糖酶也存在于中国人群的肠道代谢组中。0食品相关细菌菌株在日本人群中共享利用JMAG和原始MSS数据的物种级代表基因组，我们通过inStrain评估了日本人之间的原核菌株共享。32我们首先对每个数据集进行分析，并发现至少在3个数据集中可重复检测到10种菌株共享（图S7A），这些菌株共享在JMAG的1,273种菌株中。对于这10种菌株，我们对所有样本进行了菌株水平的比较。我们发现在针对的五种菌株的分析中，大多数个体参与了菌株共享（图3A和S7B），这表明与JMAG中其他物种相比，这些物种的菌株共享相对较频繁。在这五种物种中，枯草芽孢杆菌被认为来源于日本传统食品纳豆，如上所述。此外，其他四种物种（动物双歧杆菌，乳链球菌B，副嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌）据报道与乳制品相关。33,34因此，食品相关细菌倾向于在菌株水平上在人群中共享。ALDH2中的一个错义变异rs671：G>A是一个东亚特异性单核苷酸多态性，处于最近的正选择之下。35rs671的A等位基因导致酒精不耐受，并且与疾病、临床生物标志物和饮食习惯有各种多效性关联。36,37由于纳豆和乳制品的消费分别与rs671的A等位基因呈负相关和正相关，我们评估了五种与食品相关的细菌物种丰度与rs671的A等位基因之间的关联（图3B；表S3；总共N =546）。我们发现与Enterococcus_B的A等位基因呈名义相关0lactis（效应大小=0.270，p=0.034）和S.thermophilus（效应大小=0.122，p=0.048）。即使去除疾病样本，Enterococcus_B lactis（效应大小=0.355，p=0.036）和S.thermophilus（效应大小=0.134，p=0.079）的效应大小也是一致的（图S7C）。我们进行了一项Mendelian随机化分析38，评估了饮食习惯对细菌丰度的影响，并发现增加乳制品摄入量可能会增加Enterococcus_Blactis（效应大小=2.385，p=0.034）和S.thermophilus（效应大小=1.077，p=0.047）的丰度（表S4）。0从日本MSS数据中重建病毒基因组我们从787个日本MSS数据中恢复了病毒基因组（见图S8）。病毒基因组是从VirSorter 39和VirFinder 40组装的contigs中提取出来，并经过CheckV41处理。在CheckV之后，我们保留了具有R50％完整性和比宿主基因更多的病毒基因的病毒基因组。我们获得了31395个病毒基因组，包括4098个完整的，7492个高质量的和19805个中等质量的基因组（表S5）。我们将这组病毒基因组称为日本病毒数据库（JVD）。31395个基因组在R 95％ANI下聚类成12213个聚类，与Gut Phage Database（GPD）、19Metagenomic GutVirus（MGV）、20和分类参考基因组（RefSeq和Yutin等人42）合并，并进一步聚类成94714个物种级病毒操作分类单元（vOTU），R95％ANI。这些物种级vOTU根据基因共享比和AAI（STAR方法；表S6和S7）进一步聚类成10022个属级和2577个科级vOTU。我们根据聚类结果为所有病毒基因组分配了推测的病毒分类（图4A）。Siphoviridae（14.0％）和Myoviridae（9.3％）主导了分类注释的病毒，而crAss-like噬菌体（2.6％）和Podoviridae（0.8％）也占据了分类注释的病毒基因组的一部分。最近创建的病毒家族Salsmaviridae43也占据了分类注释的病毒基因组的一部分（0.7％）。我们评估了JVD、先前研究（GPD和MGV）和参考基因组在科、属和种水平上的重叠。在种水平上，包括JVD基因组的大多数vOTU（62.9％）与其他数据库没有重叠（图4B）。请注意，由于原始MSS数据的重叠，GPD和MGV之间存在相对较大的重叠。相反，大多数科和属级vOTU被其他数据库覆盖（分别为7.5％和0.67％是新颖的）。我们预测并对JVD病毒基因组上的蛋白序列进行功能注释。与其他病毒相比，当前数据库覆盖和功能注释的蛋白比率对于crAss-like噬菌体较低，可能是由于相对较新的发现和crAss-like噬菌体基因组的扩展（图S9 A）。在病毒同源基因组44中0和KEGG45对JVD的注释中，像衣壳蛋白、端粒酶和门蛋白等典型病毒蛋白被观察到具有高频率的蛋白（图S9B和S9C）。在KEGG途径中，与病毒相关的途径，如DNA复制和同源重组，频繁地06细胞基因组 2，100219，2022年12月14日0资源0开放获取εε0观察到（见图S9D）。此外，我们还可以看到KEGG基因和途径的分类倾向，例如在crAss-like噬菌体基因组中dUTP焦磷酸酶和嘧啶代谢相关蛋白的相对高出现率。我们还检测到一些辅助代谢基因46，这些基因可能影响宿主的代谢功能（见图S9E）。蛋白序列还从GPD和MGV中的病毒基因组中预测出来，并与JVD蛋白序列合并，并以100％、95％、90％和50％的氨基酸序列同一性进行聚类。在包括JVD蛋白的聚类中，分别有65.3％、38.6％、32.3％和19.4％仅在JVD中检测到（见图S9 F）。0crAss-like噬菌体的族群间和病例对照比较crAss-like噬菌体是肠道中丰富的噬菌体。18自2014年通过人类肠道宏基因组数据的交叉组装发现以来，18已知crAss-like噬菌体的多样性已经扩展，现在0认可了五个亚科，即ag，b，d，ε和z。420我们根据属水平vOTU聚类的结果为crAss-like噬菌体基因组注释了亚科级别的分类（表S8）。为了验证亚科级别的注释，我们为crAss-like噬菌体的标志蛋白末端酶（TerL）制作了最大似然系统发育树。属于相同亚科的crAss-like噬菌体落入相同的类群，属于相同属水平vOTU的噬菌体则被放置在附近（图5A）。然后，我们比较了不同族群背景下crAss-like噬菌体基因组的亚科级别组成。在JVD中，ag，d，ε和z频繁，b在crAss-like噬菌体基因组中较少。在MGV中，b型crAss-like噬菌体在亚洲、欧洲和北美也较少，与JVD的情况相似。相反，与日本、亚洲、欧洲和北美相比，大洋洲和非洲的b型crAss-like噬菌体基因组的组成显著较高（图5B;PFisher<0.05/21=2.4 3 10 �3）。非洲相对较高的b型crAss-like噬菌体的流行率也0A B0图3.菌株水平分析和与rs671的食物相关细菌物种的关联检验（A）环形图表示五种食物相关细菌物种在受试者中的菌株共享。节点表示检测到每种细菌的个体，边表示细菌菌株的共享。节点的颜色表示个体的数据集。独立的菌株共享网络用不同的颜色表示。灰色边表示菌株仅在一对个体之间共享。（B）箱线图表示按rs671基因型分层的五种食物相关细菌物种的丰度（平均覆盖率）。箱线图表示中位数值（中心线）和IQR（箱边），晶须延伸到范围内的最极端点（下四分位数�[1.5 3 IQR]）和（上四分位数+[1.5 3 IQR]）。ALDH2的rs671的“A”等位基因在先前的研究中与纳豆消费呈负相关，与乳制品消费呈正相关。37*p <0.05；IQR，四分位间距。另请参见图S7和表S3和S4。0细胞基因组学2，100219，2022年12月14日70资源0ll0开放获取AB0通过对crAss-like噬菌体的基于读数的定量支持（图5C）。因此，建议日本人的crAss-like噬菌体的亚科水平组成在很大程度上与亚洲、欧洲和北美等人群相似，而b型crAss-like噬菌体与非洲和大洋洲人群相关。这些结果可能反映了饮食习惯的差异。尽管认为crAss-like噬菌体被假定为健康肠道病毒组成的核心成分，但它们与疾病的关联尚未得到充分评估。因此，我们评估了crAss-like噬菌体的亚科和属水平vOTU与疾病（类风湿性关节炎（RA）（N病例=113，N对照=114），系统性红斑狼疮（SLE）（N病例=36，N对照=205），多发性硬化（MS）（N病例=30，N对照=77），溃疡性结肠炎（UC）（N病例=35，N对照=40），克罗恩病（CD）（N病例=39，N对照=40）和结直肠癌（CoCa）（N病例=40，N对照=39;图5D和5E;表S9，S10和S11）的病情状态之间的关联。ag、cluster_1743、cluster_1322和cluster_655crAss-like噬菌体在RA和SLE患者中至少名义上减少（p<0.05）。在MS患者中，我们未能检测到crAss-like噬菌体丰度的任何显着变化（p>0.05）。在炎症性肠病（IBD）患者，即UC和CD，包括ag、cluster_1743和cluster_655在内的大多数类群减少（p = 3.2 3 10 �3和3.0 3 10 � 4 for ag，p = 1.9 3 10 � 4和9.0 3 10 � 5 for cluster_1743，p = 3.5 3 10 � 50和7.4 3 10 �6，分别为cluster_655）。相比之下，一些类群的增加，例如agcrAss-like噬菌体在CoCa中被观察到。鉴于已报道了SLE、25UC和CD的细菌多样性的降低，47,48但CoCa的增加，49我们假设crAss-like噬菌体与细菌的多样性有关。我们评估了crAss-like噬菌体类群与Shannon指数之间的关联，Shannon指数是细菌多样性的测量，发现大多数类群与Shannon指数呈正相关（图5 D和5E; 表S10和S11）。0CRISPR-Cas系统是一种原核生物适应性免疫系统，用于抵抗噬菌体等捕食者。50CRISPR-Cas系统摄取病毒序列的短片段作为CRISPR间隔子，在随后的感染中有效地排出病毒。因此，原核生物基因组中的CRISPR序列是先前病毒感染的证据。利用JMAG基因组中的CRISPR序列，我们预测了病毒-原核生物相互作用。我们总共检测到296,915个间隔子，其中147,354个（49.6%）与从肠道宏基因组中恢复的病毒序列匹配，149,561个（50.4%）与之不匹配（图S10A）。然后，我们评估了CRISPR间隔子的链接MAGs和病毒靶标的分类组成，这反映了病毒的宿主范围（图S10 A;表S12）。例如，crAss-like噬菌体的主要宿主是Bacteroidota，而一些crAss-like噬菌体感染了Firmicutes_A，这与先前的研究预期一致。20,42我们还在286,997个UHGG基因组中搜索了CRISPR间隔子的病毒靶标序列，JMAG分析得出的物种级vOTU和原核生物属的59%对在UHGG中得到了复制（图6A）。我们还评估了从JVD基因组中的原噬菌体序列推断出的病毒-原核生物相互作用（图S10 B;表S13）。我们得到了额外的推论，例如JVD中crAss-like噬菌体和Salasmaviridae的原噬菌体序列的缺失。JVD中crAss-like噬菌体的原噬菌体序列缺失可能反映了crAss-like噬菌体缺乏溶原体的情况，正如先前所建议的。20至于Salasmaviridae，有报道称Salasmaviridae遵循严格的溶解生命周期，没有溶原体活动的证据。51因此，我们的大规模分析支持了对这一新分类病毒的先前推论。病毒和原核生物的共同丰度分析已被用于推断病毒-原核生物相互作用，但CRISPR和原噬菌体分析的结果与之相符的程度尚未得到很好的评估。利用这一大型数据集，我们评估了由JMAG中CRISPR间隔子支持的病毒和原核生物丰度之间的关联（图S10 C;表S12）。受CRISPR间隔子支持的病毒-原核生物关联检验的p值膨胀程度远远严重于没有支持的情况（图6B）。受CRISPR间隔子支持的病毒-原核生物对的Z得分严重偏向正向。0图4.病毒基因组的重建及与其他数据库的比较（A）饼图显示了JVD的家族水平系统发育组成。组成<0.3%的家族被折叠成“其他”。（B）维恩图表示了不同数据库之间vOTUs的共享情况（左边，家族级别；中间，属级别；右边，种级别）。参考基因组由RefSeq和Yutin等人42组成（STAR方法）。另请参阅图S8和S9以及表S5、S6和S7。08细胞基因组学2，100219，2022年12月14日0资源0ll0开放获取0A0B C0D E0（见下一页图例）0细胞基因组学 2，100219，2022年12月14日90资源0ll0开放获取εll0表明病毒及其潜在宿主的丰度倾向于呈正相关（图6C）。我们对UHGG中的CRISPR序列和JMAG中的嵌合噬菌体进行了相同的分析，