胆碱结合蛋白A表位疫苗的电子设计与肺炎链球菌的免疫原性相结合的研究

医学信息学解锁23（2021）100546胆碱结合蛋白抗原表位疫苗的电子设计肺炎链球菌AMeherunnesaMunia a，Shafi Mahmud c，Mohammed Mohasin b，K.M. Kaderi Kibria a，*a孟加拉国坦盖尔Mawlana Bhashani科技大学生命科学学院生物技术和遗传工程系，1902b达卡大学生物科学学院生物化学和分子生物学系，达卡，1000，孟加拉国c孟加拉国拉杰沙希拉杰沙希大学遗传工程和生物技术系A R T I C L EI N FO保留字：肺炎链球菌MHC胆碱结合蛋白A（CbpA）表位疫苗A B S T R A C T肺炎链球菌（肺炎球菌）是导致细菌性肺炎、败血症、中耳炎和脑膜炎的主要全球健康负担。它是全球发病率和死亡率很高的原因。 可用的肺炎疫苗要么是基于碳水化合物的疫苗，要么对特定血清型没有保护性。此外，肺炎球菌的抗生素耐药性证明了进一步关注探索新的候选疫苗的合理性。基于不变肽的疫苗不仅对所有年龄组都具有免疫原性，而且对所有血清型的肺炎球菌都具有保护性。最初，我们通过文献挖掘寻找潜在的肺炎球菌疫苗候选者。我们发现胆碱结合蛋白A（CbpA）作为一种潜在的免疫原性细胞外蛋白。接下来，我们应用免疫信息学方法设计了一种基于多表位的肺炎球菌CbpA疫苗（MEV）候选物。此外，蛋白质序列揭示了CbpA的免疫原性T细胞表位。通过分子对接（MD）分析评估T细胞表位与MHC分子之间的亲和力。我们发现了一个单一的15聚体T细胞表位（AMATGWLQYNGSWYY），它不仅对两者都有亲和力，MHC I类和II类也具有最高的人群覆盖率。此外，B细胞和IFNγ诱导还选择了表位。评估所有肽的保护性、变应原性、免疫原性和疏水性。最后，我们组装了最好的T细胞、B细胞和IFNγ诱导表位以制备MEV。对接和MD模拟研究揭示了MEV和Toll样受体之间的强亲和力。因此，我们认为，我们认为CbpA的MEV可能是一种新的候选疫苗，它可以诱导针对非血清型特异性肺炎球菌的体液和细胞免疫应答。1. 介绍肺炎是一种影响一个或两个肺的呼吸道感染。肺由称为肺泡的小囊组成，当健康人呼吸时，肺泡充满空气。然而，在持续性肺炎中，肺泡充满脓和液体，这会导致呼吸疼痛并减少氧气摄入，从而导致急性呼吸综合征[1]。肺炎链球菌（肺炎球菌）是一种非运动性革兰氏阳性细菌，是社区获得性肺炎的主要病原体。不幸的是，肺炎球菌性肺炎是全球2岁以下儿童、老年人和免疫功能低下个体中发病率和死亡率最高的原因（综述见参考文献[2]）。此外，肺炎球菌还引起侵袭性疾病，如侵袭性肺炎球菌病（IPD）、败血症、脑膜炎、鼻窦炎和中耳炎[2，3]。因此，全世界每年发生超过1400万例严重肺炎球菌疾病，约160万例患者死于肺炎球菌感染[4]。在发展中国家，近0.29儿童中的肺炎发病率为每人每年0.05次，而发达国家为每人每年0.05次[4，5]。这使其成为全球儿童死亡的最常见原因。2008年，美国的一项研究表明，肺炎球菌对广泛的抗菌药物具有耐药性，包括喹诺酮类、青霉素、大环内酯类和头孢菌素[6]。此外，最近中国显示肺炎球菌对克林霉素、红霉素、四环素和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑的耐药率分别为95.8%、95.2%、93.6%和66.7%[7]。此外，现有的肺炎球菌疫苗既不是100%有效，也不是对所有血清型的肺炎球菌都有保护作用。因此，最新* 通讯作者。电子邮件地址：km_kibria@yahoo.com（K.M.K.Kibria）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100546接收日期：2020年12月11日;接收日期：2021年2月28日;接受日期：2021年3月1日2021年3月16日网上发售2352-9148/© 2021作者。出版社：Elsevier Ltd这是CC BY许可下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：http://www.elsevier.com/locate/imuM. Munia等人医学信息学解锁23（2021）1005462肺炎球菌结合疫苗PCV 13（Prevnar）于2010年引入，其仅覆盖95种肺炎球菌血清型中的13种血清型。不可否认，PCV 13疫苗显著减少了儿童肺炎球菌感染，并通过打破细菌传播途径帮助老年人[8]。然而，由于社区中疫苗血清型被非疫苗血清型替代，使用PCV 13预防IPD的疫苗接种计划的成功率下降。因此，有必要鉴定新的疫苗候选物，特别是基于蛋白质/肽的疫苗，其将在所有年龄组中具有保护性，并且对所有血清型的肺炎球菌具有全球免疫原性。在这项研究中，我们利用一种新的疫苗组学方法，将免疫遗传学和免疫基因组学与生物信息学相结合，寻找和开发新的肺炎球菌相关疫苗候选物。疾病[9]。最近，这种方法已被应用于提出一种新的基于表位的Chagas病嵌合疫苗候选物[10]。由于病原体下一代测序的最新进展以及全球蛋白质序列数据库的可访问性，这些基于计算机模拟的策略已显示出疫苗开发的前景[11]。相比之下，用于疫苗开发的传统方法费力且耗时，并且主要依赖于从体外培养模型表达和纯化足量的抗原。此外，ORTHODOX方法表达足够量的抗原并不总是可行的，并且产生定制的疫苗候选物如嵌合肽疫苗是昂贵的。以前，这些常规方法失败了 到 控制 几 爆发 然而，在这方面， 上述“vaccinomicsFig. 1. 方法流程图。M. Munia等人医学信息学解锁23（2021）1005463≤如疟疾[12]、多发性硬化[13]和肿瘤[14]。该策略仔细鉴定了人类白细胞抗原（HLA）的顶级配体[15]，其指定了用于选择有效候选疫苗的T细胞表位。因此，我们采用了这种新的方法来设计一种基于表位的潜在的下一代疫苗候选物，该疫苗候选物针对S. 肺炎。2. 材料和方法2.1. 文献挖掘以寻找候选疫苗整个表位预测的方法已概述于图2中。1.一、简单地说，我们选择了几篇关于S. pneumoniae疫苗，并筛选了潜在候选疫苗的湿实验室和计算机模拟研究。将蛋白质分选出来并检查其抗原性和在细菌细胞中的适当位置。识别出几种细胞表面蛋白用于进一步分析（表S1）。2.2. 抗原性评价及亚细胞定位的 选择 13 蛋白 和 他们的 对应 序列S.从美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中检索肺炎链球菌的基因组数据[16]。随后，将每种蛋白质的FASTA格式提交至VaxiJen版本2.0，以通过使用默认参数评价其抗原性[17]。 肺炎链球菌最有潜力的抗 原 蛋 白 是 胆 碱 结 合 蛋 白 A （ CbpA ） 。 此 外 ， 通 过 pSORTb（https://www.psort.org/psortb/）预测所选蛋白的亚细胞位置。2.3. T细胞表位T细胞表位不仅是引发病原体特异性免疫应答所必需的，而且是任何基于表位的疫苗设计的重要肽片段。我们从CbpA的氨基酸序列中鉴定了T细胞表位（表S2）。这些表位与MHC I类和II类等位基因的亲和力水平通过免疫组织化学方法评估前所述的方法[18 简而言之，本发明人的CTL表位是：一系列HLA A和B超型的蛋白质序列由NetCTL v1.2服务器预测[21]。还定量了来自CbpA蛋白的T细胞表位分析和每个表位与I类MHC的亲和力评分。这里，测量算法的组合得分，例如，蛋白酶体C-末端切割预测、抗原肽转运蛋白（TAP）转运效率和MHC I类亲和力。值得注意的是，我们使用默认参数运行NetCTL服务器，并提交了蛋白质序列的FASTA格式。2.4. MHC I类和MHC II类结合的预测我们评估了从NetCTL预测的肽的亲和力服务器与MHC I类和II类通过利用IEDB结合预测工具[22在MHC I类结合的情况下，通过稳定基质方法测量预选的9.0-mer表位(SMM)[25]. 选择所有HLA等位基因用于结合预测，并且每个等位基因的长度设定为9.0-mer选择的MHC来源物种是具有频繁出现的等位基因的人随后提取IC 50为250 nM的所得等位基因< 预选9-将MHC I类的mer表位视为核心肽，并将其投射为15-mer表位，使用NetMHCpan算法分析其用于MHC II类结合分析。在这里，大约有320个人类HLA-DR等位基因，330个人类HLA-DP等位基因，和280个人类HLA-DR等位基因。选择人类HLA_DQ等位基因，考虑每个HLA类型的5-10个成员。 我们提取了MHC II类等位基因，IC 50100从IEDB服务器。 表位由免疫组化交叉检查PREDIVAC工具来测量它们与MHC II类的亲和力。2.5. 人口覆盖率肺炎球菌引起的肺炎是一种世界性的流行性疾病。因此，这些表位的覆盖率是通过IEDB人口覆盖工具估计的，用于世界上肺炎球菌流行率高的不同地区。由于MHC分子包含极端多态性，因此各种HLA表达的频率在不同种族中多样化。HLA等位基因的这种较高水平的多态性限制了一定比例的人群识别特定抗原。因此，在具有特定HLA组成的群体中激发免疫应答的T细胞表位可能对其他群体无效。因此，我们使用IEDB群体覆盖率工具计算了所有表位的群体覆盖率。此外，选择国家种族作为查询，而MHC I类和II类的组合得分用于测量全球人口覆盖率。2.6. 保护性分析与现有的肺炎球菌疫苗相比，预期CbpA的基于保守表位的疫苗提供针对多种肺炎球菌菌株的更高水平的保护。对于保护研究，我们从1000S中检索了CbpA蛋白序列的FASTA格式。从NCBI数据库中检索肺炎菌株。排除部分序列，并使测序错误最小化。使用IEDB保守性分析工具（ www.example.com ） 彻 底 研 究 预 期 表 位 的 保 守 性http://tools.immuneepitope 。 org/tools/conservation/iedb_input ）[26]。序列同一性的阈值对于9-mer表位设定为100%，对于15-mer表位设定为90%。对于每个潜在的表位，通过评估肺炎球菌的993个CbpA蛋白序列的同一性来测量保护水平。2.7. 变应原性评估探索肽的致敏性对于避免其潜在的影响潜在疫苗候选物质量的副作用是必不可少的。通过AllerTOP v2服务器[27]评价预测表位的变应原性，该服务器基于支持向量机（SVM）算法以及序列组成分析数据2.8. 结构挫折通 过 MODELLER v9 [28] 构 建 CbpA 的 同 源 性 模 型 ， 并 通 过PROPERTIES服务器[29]评价伪模型的质量。使用跨膜隐马尔可夫模型（TMHMM版本2.0）来确定肽是否位于蛋白质的跨膜螺旋中[30]。此外，通过蛋白质Frustratometer Server测量蛋白质结构的稳定性和能量差异[31]。2.9. HLA等位基因的分子对接及相互作用分析我们还使用最佳可能的表位进行了对接模拟研究，以加强HLA分子与所提出的表位之间的结合预测。选择HLA-B *15：01分子的晶体结构作为MHC I类的候选物，并且选择HLA-DRB 1 *01：04作为MHCII类的候选物用于分子对接分析。PDB结构1XR 8（与来自人UbcH 6和EB病毒EBNA-3的肽复合的HLA-B*15：01的晶体结构，9聚体自身肽）和5 NI 9（晶体结构的HLA-DRB1*04：01与的α-烯醇化酶肽（326-合作实验 为 结构 生物信息 （RCSB） 蛋白质数据库M. Munia等人医学信息学解锁23（2021）1005464=[32 ]第32段。通过利用PyMOL分子图形系统从晶体结构中消除现有的配体来细化MHC I类以及MHC II类的结构将MHC分子和相应的肽序列提交至CABS dock服务器（http://biocomp.chem）。此外，用PyMOL软件对极性相互作用进行了鉴定。2.10. B细胞和IFNγ诱导表位从蛋白质序列中发现和选择最佳免疫原性表位可能会显着减少潜在疫苗候选物的巨大实验负担据推测，基于潜在表位的体液免疫应答的知识可以通过B细胞表位预测方法来预测[33]。我们通过ABCpred服务器（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/index.html），其通过使用人工神经网络测试固定长度表位。我们选择了14个氨基酸表位序列从整个蛋白质。另一方面，干扰素-γ（IFNγ）在IFN-表位服务器（http://crdd.osdd.net/）中通过基于支持向量机（SVM）的模型2.11. 多表位疫苗的构建及疫苗特性评价通过使用GPGPG接头序列组装顶部T细胞、B细胞和IFNγ诱导表位，并在肽的然后对嵌合疫苗进行评估，通过AllerTop 2.0服务器检测其致敏性。用SOPMA法测定疫苗的二级结构通过iTASSER构建嵌合疫苗的三级结构，并通过Galaxy refine服务器对然后由两个真实的服务器ProSa [34]和Procheck [29]评估改进结构的质量。2.12. MEV与Toll样受体的为了激活适当的免疫应答，疫苗应该与免疫细胞受体相互作用。因此，我们进行了对接研究以评估最终的多表位疫苗与TLR2和TLR4之间的相互作用。从RCSB蛋白质数据库下载TLR2（PDB ID 2Z7X）和TLR4（ PDB ID 3FXI ） 的 晶 体 结 构 。 通 过 使 用 HADDOCK 2.4 服 务 器（https://wenmr.science.uu.nl/haddock2.4/）将疫苗的结构与TLR 2和TLR 4对接。基于最低HADDOCK分数和最低Z分数选择最佳结构。选定的停靠模型通过HADDOCK细化接口进行细化。挑选最佳精制结构，并通过PDBsum（www.example.com bsum/ www.example.com）定位疫苗和 TLR 之 间 的 相 互 作 用 残 基 http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/pdGetPage.pl? pdbcode index.html）。通过使用PRODIGY服务器（https：//wenmr. science.uu.nl/prodigy/）上提供。2.13. 分子动力学通过CABS-flex网络服务器（http://biocomp.chem.uw.edu.pl/CABSflex2/）评估多表位疫苗与TLR 2和TLR 4的对接复合物的稳定性和灵活性[35]。CABS-flex服务器通过生成与NMR系综的那些很好相关的10 ns MD模拟来评估对接复合物的氨基酸残基的波动还在YASARA动力学软件包[36]中进行了分子动力学模拟研究，其中采用了AMBER 14力场[37]。模拟的复合物被清洁，氢键取向初始能量最小化过程由最陡梯度算法进行，采用模拟退火 方法. 的 TIP3P 水 溶剂化 模型（0.997g/L-1，25℃，1个大气压），并创建立方体模拟室。在复合物的所有情况下，将模拟单元扩展20 μ m以自由移动[38]。通过加入0.9%NaCl、pH 7.4和310K温度对模拟体系进行中和。Berendsen恒温器用于控制模拟温度。通过粒子网格埃瓦尔德（PME）方法，以8 μ m的截止半径计算长程定常相互作用[39]。模拟时间步长设定为1.25fs。最后，每隔100ps保存一次仿真轨迹，并进行100ns的仿真轨迹用于分析均方根偏差、回转半径、溶剂可及表面积、氢键和MM-PBSA[402.14. MEV的B细胞诱导潜力评估通过使用IEDB工具评价最终嵌合多表位疫苗的B细胞抗原性，包括Kolaskar和Tongaonkar抗原性量表[44]、Emini表面可及性预测[45]、Karplus和Schulz柔性预测[46]和Parker亲水性预测[47]。3. 结果3.1. CbpA是一种潜在的肺炎球菌33个细胞表面蛋白。各种研究和综述文章揭示了肺炎。VaxiJen（2.0版）是一种用于预测保护性抗原和亚单位疫苗的服务器，用于测量最有效的抗原蛋白。胆碱结合蛋白A（CbpA）被鉴定为潜在抗原蛋白，最大评分为0.8118（表S1）。此外，pSORTb服务器证明CbpA是肺炎球菌的胞外蛋白（评分，9.73）。3.2. CbpA中T细胞表位的鉴定通过NetCTL v1.2服务器预测所选CbpA蛋白序列的最具抗原性的区域。基于最高的组合评分选择有效的T细胞表位，并选择前12种肽用于进一步分析（表1）。我们通过SMM预测了T细胞表位与大范围的MHC I类等位基因的相互作用，并且表2中示出了12个表位各自的等位基因的数量。根据低于阈值的ic50值，肽LQYNGSWYY和KVSDKWYYV具有被8个MHC I等位基因识别的亲和力（表2）。根据与最高数量的I类MHC的相互作用 ， 选 择 前 四 种 肽 ， 例 如 LQYNGSWYY 、 KVSDKWYYV 、AMATGWLQY和YPTNTYKTL。我们还通过IEDB工具分析了MHC II类相互作用表位（表3）。在预测的肽中，两个15-mer肽序列显示出与最 大 数 量 的 MHC II 类 分 子 具 有 亲 和 力 特 别 地 ， 15 聚 体 肽AMATGWLQYNGSWYY 和SDKW YYVNGSGAL AV具有与肽AMATGWLQYNGSWYY和SDKWYYVNGSGAL AV相同的结构。表1由NetCTL预测的胆碱结合蛋白A（cbpA）的T细胞表位超类型表位开始位置组合得分A1AMATGWLQY五百八十，五百六十2.2319A2KVSDKWYYV6681.1112A3AMATGWLQY五百八十，五百六十1.5314A24KYLLEN NVL991.6698A26公司简介6451.9546B7YPTNTYKTL1661.5374B8DVKVKEAEL3441.1326B27RRSEEEYNR4551.6195B39YYVNGSGAL6741.5972B44SERKVHYSI61.4536B58KLSAIKTKY921.3100B62公司简介五六六五八六六二六1.4915M. Munia等人医学信息学解锁23（2021）1005465表2CD8+ T细胞的表位及其相互作用的MHC I类等位基因，亲和力250 nM。表3潜在的CD4+ T细胞表位及其相互作用的MHC II类等位基因，亲和力（IC50）250nM和相应的predivac评分。<2019 - 03 - 19 01：01：01KVSDKWYYV HLA-A*02：06（6.71），HLA-C*12：03（30.71），HLA-8A*02：01（34.29），HLA-C*05：01（143.44），HLA-A*68：02（151.91）、HLA-C*15：02（153.61）、HLA-A*30：01（171.38），HLA-A*31：01（219.01）AMATGWLQY HLA-A*29：02（7.48），HLA-B*15：01（48.42），HLA-7B*15：02（52.03），HLA-C*12：03（72.81），HLA-C*12：03（72.81），A*30：02（107.27），HLA-C*03：03（114.45），HLA-2019 - 03 - 19 01：01：01KYLLANVL HLA-C*14：02（5.74），HLA-C*07：02（99.35），HLA-5C*12：03（104.52）、HLA-C*03：03（154.03）、HLA-A*23：01（204.38）WVKDGDTWY HLA-C*12：03（5.93），HLA-C*03：03（65.10），HLA-5B*15：02（73.83）、HLA-B*35：01（169.27）、HLA-29：02（172.89）YPTNTYKTL HLA-C*03：03（11.29），HLA-B*15：02（46.69），HLA-6C*12：03 （78.38）、HLA-B*07：02（104.93）、HLA-C*14：02（156.18），HLA-B*35：01（178.07）HLA-DPA 1 *01：03/DPA1*01：05/DPB1*15：01（198.81）、HLA-DPA1*01：04/DPB1*15：01（198.81）、HLA-DPA1*01：03/DPB1*73：01（235.44）、HLA-DPA1*01：03/DPB1*18：01（238.91）、HLA-DPA1*01：05/DPB1* 18：01（238.91）、HLA-DPA1*01：04/DPB1*18：01（238.91）QWFKVSDKWYYV NGS HLA-DPA 1 *01：03/DPB 1 *15：01（124.83）、HLA-DPA1*01：05/DPB 1 *15：01（124.83）、HLA-DPA1*01：04/DPB 1 *15：01（124.83）、HLA-DPA1*01：05/DPB 1 *15：01（124.83）8 63.06DVKVKEAEL HLA-C*12：03（17.426），HLA-C*03：03（41.649）2 DPA1*01：03/DPB1*28：01RRSEEEYNR HLA-C*12：03（41.99），HLA-C*07：02（127.69），5HLA-C*03：03（154.74）、HLA-C*07：01（170.68）、HLA-B*27：05（205.385）YYVNGSGAL HLA-C*14：02（1.14），HLA-B*15：02（6.46），HLA-5C*03：03（8.66），HLA-C*12：03（68.58），HLA-C *03：03（8.66），C*07：02（70.33）SERKVHYSI HLA-C*12：03（32.45），HLA-B*40：02（32.95），HLA-3B*40：01（140.57）KLSAIKTKY HLA-C*12：03（36.49），HLA-C*03：03（89.25），HLA-5HLA-C*14：02（220.61），HLA-2019 - 03 - 15 01：01：01LQYNGSWYY HLA-B*15：01（18.28），HLA-C*12：03（21.49），HLA-8C*03：03（43.61）、HLA-A*02：06（81.39）、HLA-HLA-A *29：02（85.07），HLA-A*30：02（128.07），HLA-B * 29：02（85.07），B*15：02（162.64），HLA-B*35：01（228.34）分别与30个和18个MHC II类等位基因具有亲和力3.3. 人口覆盖率（183.46）、HLA-DPA1*01：03/DPB1*73：01（182.94）、HLA-DPA1*01：03/DPB1 * 18：01（185.4）、HLA-DPA1*01：05/DPB1*18：01（182.94）、HLA-DPA1*01：03/DPB1*18：01（185.4）、HLA-DPA1*01：05/DPB1*18：01（185.94）、HLA-DPA1*01：05/DPB1 * 18：01（185.94）、HLA-DPA1*01：05/DPB1 * 18：01（185.95）。DPB 1 *18：01（185.4），HLA-DPA 1 *01：04/DPB 1*18：01（185.4）LSAIKTKYLLENSHNVLHLA-DPA 1 *02：02/DPB1 *06：01（140.73），HLA-DPA 1 *02：04/DPB 1*06：01（140.73）SDKWYYVNGSGAL AV HLA-DRB 5 *01：06（37.54），HLA-DRB5*01：11（37.74），HLA-DRB1*07：08（48.82），HLA-DRB1*07：07（48.82），HLA-DRB1*07：05（48.82），HLA-DRB1*07：12（50.67），HLA-DRB 1 *13：10（68.5），HLA-DRB1*13：03（75.07），HLA-DRB3*02：12（129.38），HLA-DRB1*07：11（137.73），2 75.10美元1886.66通过使用IEDB工具确定MHC I类和II类的组合人群覆盖率得分，以评估其成为一个潜在的群体的概率。潜在的疫苗候选人。表位“AMATGWLQYNGSWYY“具有全世界最高人口覆盖率为82.47%（图3和表4）。然而，第二个潜在肽QWFKVSDKWYVNG表位相互作用MHC-I等位基因（IC50）（nM规模）等位基因数肽（核心肽以粗体显示）等位基因等位基因总数Predivac评分AMATGWLQYHLA-A*29：02（7.48），HLA-B*15：01（48.42），HLA-B * 29：02（7.48），B*15：02（52.03）、HLA-C*12：03（72.81）、HLA-A *30：02（107.27）、HLA-C*03：037LNSNGAMATGWLQY NHLA-DRB1*08：10（168.43），874.04M. Munia等人医学信息学解锁23（2021）1005466S 显 示 具 有 60.40% 的 群 体 覆 盖 率 ， 而 第 三 个 表 位SDKWYYVNGSGALAV仅具有43.38%的群体覆盖率（表4）。此外，最高表位的群体覆盖率数据FASKSERKVHYSI RKHLA-DRB3*02：09（142.3），HLA-DRB3*03：01（148.21），HLA-DRB3*02：05（167.71），HLA-DRB3*02：02（172.71），HLA-DRB3*02：10（172.71），HLA-DRB3*02：01（187.6），HLA-DRB3*02：14（199.28），HLA-DRB1*07：04（224.39）HLA-DRB1*12：08（152.29），HLA-DRB1*12：03（245.42）2 60.86美元在世界不同地区进行了重新评估。 不可否认，第一表位的最大群体覆盖率在北美（99.56%）观察到，其次是欧洲（98.24%）、南亚（90.65%）和东北亚（83.11%）（表S3）。而第二最可能的表位QWFKVSDKWYVNGS被认为适合于西印度群岛，因为其在该地区的较高人口覆盖率36.37%）。3.4. 跨膜螺旋我们使用MODELLER 9.0版通过同源建模构建了胆碱结合蛋白A的3D结构（图2）。用PRO-BACK服务器对模型进行验证，发现预测模型中89.1%的残基位于最有利区域，9.7%的残基位于额外允许区域，1.2%的残基位于宽松允许区域，0.0%的残基位于不允许区域AMATGWLQYNGSWYYHLA-DRB 1 *08：10（83.5），HLA-DRB1*01：06（111.33），HLA-DRB1*12：08（115.56），HLA-DRB5*01：06（127），HLA-DRB1*01：04（131.99），HLA-DRB1*12：03（132.81），HLA-DRB1*13：10（138.27），HLA-DRB1*13：03（140.93），HLA-DRB1*14：06（162.65），HLA-DRB1*12：06（163.83），HLA-DRB1*12：05（163.83），HLA-DRB1*12：07（163.83），HLA-DRB1*12：10（163.83），HLA-DRB1*15：05（174.5），HLA-DRB1*13：09（194.23），HLA-DRB1*08：05（203.46），HLA-DRB1*01：10（210.11），HLA-DRB1*01：09（221.12），30 62.76（接下页）M. Munia等人医学信息学解锁23（2021）1005467--表3（续）肽（核心肽以粗体显示）表4等位基因总数等位基因HLA-DRB5*01：11（230.81），HLA-DRB3*03：01（246.05），HLA-DRB1*09：06（247.3），HLA-DRB1 * 13：06（249.82），HLA-DPA 1 *01：03/DPB 1 * 15：01（160.71），HLA-DPA 1 *01：05/DPB 1 * 15：01（160.71），HLA-DPA 1 *01：04/DPB 1 * 15：01（160.71），HLA-DPA 1 *01：03/DPB 1 * 18：01（211.52），HLA-DPA 1 *01：05/DPB 1 * 18：01（211.52），HLA-DPA 1 *01：04/DPB 1 * 18：01HLA-DPA1 * 01：03/DPB 1* 28：01（233.08），HLA-DPA1 * 01：03/DPB 1 *73：01（245.58）Predivac评分表S5为接触图。15-mer肽通过氢键与HLA-DRB 1 *01：04的Tyr 78、His 13、Glu 9和His 81相互作用该肽还与HLA-DR分子的β亚基的氨基酸Asn 82以及α亚基的Ser 53、Asn 62和Gln 9相互作用HLA-DRα亚基的Asn 62和肽分子的Gly 11之间存在空间相互作用（图11）。 表S5）。3.6. B细胞和IFNγ诱导肽预测通过ABCpred从CbpA氨基酸序列进行14聚体B细胞表位预测。从分析中发现的前11个14-mer表位示于表5中。我们还发现具有诱导IFNγ通过SVM方法从IFN表位服务器中获得（表6）。3.7. 保护性分析我们测量了前三个T细胞、B细胞和IFNγ诱导表位的保守性， 通过利用 的 IEDB保护分析工具。有趣的是，考虑到序列同一性阈值>90%，所有表位显示具有超过90%的保护性，除了CbpB2（表7）。 肽AMATGWLQYNGSWYY和LNSNGA-预测的CbpA的15聚体肽的群体覆盖率肽世界人口覆盖率LNSNGAMATGWLQYN43.33%QWFKVSDKWYYVNGS百分之六十点四公司简介百分之四十二点九九SDKWYYVNGSGALAV43.38%FASKSERKVHYSIRK20.39%AMATGWLQYNGSWYY82.47%Ramachandran图中的区域（图S2）。TMHMM服务器的分析描绘了CbpA蛋白序列中的跨膜螺旋（图1A）。 S1）。发现预测的肽不位于跨膜区。发现选自上述分析的前两种肽（i）AMATGWLQYNGSWYY（图2）和（ii）QWFKVSDKWYYV NGS（数据未显示））在蛋白质的表面上，表明它们的表面可及性。此外，还通过结构挫折分析评估了模拟模型，发现表位区域没有受到挫折（图1B）。 S4）。通过DISOPRED服务器评估蛋白质序列中的分析表明，这两种肽不位于蛋白质的无序区域（图S3）。3.5. 分子对接预 测 的 表 位 LQYNGSWYY 及 其 15 聚 体 突 出 物AMATGWLQYNGSWYY分别适当地附着于HLA-B *15：01和HLA-DRB1 *01：04的沟。对接模拟通过PyMOL分子图形系统可视化通过PyMOL鉴定和可视化9-mer和15-mer表位与HLA-B*15：01和HLA-DRB 1 *01：04分子的极性接触通过CABS Dock服务器生成对接肽的不同模拟9.0-mer表位的氨基酸与图4中所示的HLA-B*15：01的不同氨基酸相互作用，并且所有相互作用（比4.5bp更近的残基）在表S4中作为接触图显示。在接触图中显示了几个非极性接触，在9-mer表位和HLA-B*15：01之间检测到。然而，在肽与HLA-B*15：01的Arg97、Thr 73、Asn 70、Tyr 7和Gln 155之间也发现极性相互作用，特别是氢键（表S4）。此外，15-mer表位AMA-TGWLQYNGSWYY与HLA-DRB 1 *01：04的对接如图5所示。相互作用的残基（距离小于4.5 nm的残基）显示于图10中。MATGWLQYN显示具有最低水平的同一性（86.67%），这意味着其位于具有最小变异性的蛋白质的保守区域中（表7）。其他15-mer肽具有小于60%的最小同一性得分。B细胞表位LNANGDMATGWLQY和TWYYLEASGAMKAS的阳性率分别为93.35%和93.35%，同源性为99.09%，最低同源性分别为78.57%和50.00%。IFNγ诱导表 位 GWLQNNGSWYLNAN 和 TGWLQNNGSWYLNA 均 为 100.00% 保守，最低同源性为93.33%。3.8. 多表位疫苗的构建及其序列分析我们采用了前三种T细胞、B细胞和IFNγ诱导肽，并通过几种广泛使用的工具分析了其保守性、疏水性、过敏性、毒性和免疫原性（表7）。CbpT1、CbpB1和CbpIFN 2在性质上显示出最高的保护性和亲水性。这些也是通过GPGPG接头选择和混合的非过敏性、非毒性和免疫原性肽。在多表位疫苗的N-末端添加半胱氨酸残基，其可用于将疫苗与载体蛋白缀合（图1B）。 6 A）。最终的多表位疫苗为55个氨基酸长（5.95kDa），等电点pH为3.8。它的消光系数值为29.83，低于阈值40，这意味着它在自然界中足够稳定。该疫苗具有负GRAVY值（0.507），表明其本质上是亲水性的（SM1）。通过SOPMA进行二级结构分析（图6B），并通过iTASSER构建三维结构（图6C（i））。Galaxy网络服务器对三维结构进行了细化（图6C（ii））。通过ProSa网络服务器评估最终结构的质量（图6D），发现Z分数为1.67。负Z分数表明3D结构的质量良好。最后的三维结构的MEV进行了验证的Ramachandran图分析PROPERTIES。从PROTECH服务器中发现，预测模型的91.9%的残基位于最有利的区域，5.4%的残基位于额外的允许区域，2.7%的残基位于Ramachandran图中的不允许区域（图1）。6 E）。3.9. MEV与Toll样受体的将所得多表位疫苗与Toll样受体对接以评估其诱导先天免疫应答的潜力。对接分析由HADDOCK网络服务器进行，M. Munia等人医学信息学解锁23（2021）1005468--图二 、 Cbp A 的 三 维 结 构 显 示 了提出的 T 细 胞 表 位 AMATGW LQYNGSWYY （ 蓝 色 ） ; B 细 胞 表 位 LNANGDMATGWLQY （ 绿 色 ） ; 和 IFNγ 诱 导 表 位TGWLQNNGSWYYLNA（红色），这表明了它们的表面可及性。A. 卡通视图，B.表面视图。（有关此图例中颜色的含义，请参考本文的Web版本显示负HADDOCK分数，表明这些复合物之间的强结合（表8）。通过PyMol软件提取来自对接复合物的极性相互作用。MEV与TLR2和TLR4的极性相互作用分别示于图7A（ii）和图7B（ii）中。MEV和TLR2之间所有可能的相互作用残基显示在图7A（iii）中。而MEV和TLR4之间的相互作用残基显示在图7B（iii）中。MEV与TLR2之间存在1个盐桥和14个氢键，而MEV和TLR4之间存在一个盐桥和16个氢键（图1B）。 S5、SM2和SM3）。通过PRODIGY服务器计算了这些配合物的吉布斯自由能变化（ΔG）发现MEV/TLR 2对接复合物和MEV/TLR 4的ΔG为17.5和18.5 kcal mol-1（表8）。负ΔG值意味着我们提出的MEV和TLR 2/TLR 4之间的相互作用将以能量有利的方式自发发生。3.10. 分子动力学模拟MEV和TLR复合物的柔性通过CABS-flex服务器以均方根波动（RMSF）值的形式测量在与TLR2相互作用的情况下（图8A），发现在氨基酸残基Gly 26和Asn 47中观察到疫苗构建体（链A）中的最高柔性。在此，MEV的Asn47参与与TLR2的氢键。虽然在氨基酸位置117、245、304、