埃及基础科学与应用科学杂志3（2016）141主办方：完整文章土壤化学和生物消毒对细菌群落Md Rokunuzzamana，Ayumi Hayakawab，Shinzo Yamaneb，Sota Tanakac，Kouhei Ohnishid，*a日本爱媛县松山市爱媛大学农业科学联合研究生院b日本高知县南国高知大学农学院c高知大学黑潮科学研究生院，日本高知县南国d日本高知县南国高知大学分子遗传学研究所A R T I CL EI N F OA B S T R A C T文章历史记录：2015年12月14日收到，2016年1月13日收到修订版2016年1月20日接受2016年2月11日在线发布关键词：焦磷酸测序氯化苦芥菜消毒关于土壤消毒对细菌群落的影响知之甚少。用有效的化学熏蒸剂氯化苦和生物熏蒸剂芥菜（芥菜）处理土壤。芥菜对土壤细菌群落结构影响不大，氯化苦则显著降低了土壤生物量和细菌物种丰富度。氯化苦也影响了细菌群落结构，使厚壁菌门占优势，约占75%。在两个多月的时间里，厚壁菌门的比例下降到基础水平，拟杆菌门和变形菌门成为优势门。由于芥菜作为土壤还原的碳源，土壤用麦麸和低浓度乙醇处理。麦麸和乙醇还原对土壤细菌群落结构没有影响。β多样性主坐标分析表明，除氯化苦处理土壤外，其余土壤细菌群落均聚为一簇。结果表明，生物熏蒸剂芥菜对土壤细菌群落的破坏程度远小于化学药剂氯化苦。© 2016曼苏拉大学.由Elsevier B. V.制作和托管。这是一个CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。1.介绍土壤细菌通过调节土壤有机质分解、养分循环和矿化、污染物降解许多研究已经表明，农艺和作物保护措施显著影响土壤微生物群落的功能和结构[1土壤消毒的化学方法，如杀虫剂，除草剂和熏蒸剂，已被应用于控制杂草，植物病害和土传有毒病原体在世界各地[4]。已知这些化学物质中的一些会损害* 通讯作者。联系电话： +81 888645213。电子邮件地址：kouheio@kochi-u.ac.jp（K. Ohnishi）。http://dx.doi.org/10.1016/j.ejbas.2016.01.0032314- 808 X/© 2016曼苏拉大学。Elsevier B. V.制作和托管这是CC BY-NC-ND许可证下的开放获取文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。可在www.sciencedirect.com在线获取ScienceDirect杂志主页：http://ees.elsevier.com/ejbas/default.asp142埃及基础科学与应用科学杂志3（2016）141环境，对人类有毒，对土壤微生物有一定的负面影响[5甲基溴是一种高效的熏蒸剂，由于其破坏臭氧层，在一些发达国家被禁止使用[8]。广泛用于温室的氯化苦也因其致癌作用而被欧盟禁止作为农业用途的杀虫剂[9]。氯化苦通常被认为对真菌害虫有效，但对线虫和杂草的效果不如溴甲烷[10]。为了促进环境友好型农业，现在越来越多地尝试使用有机化合物和绿色材料如米糠[11]、油饼[12]、木炭和灰烬来控制杂草和土传病原体。为了寻找化学熏蒸剂的替代品，人们从各个方面进行研究，以找到合适的生物熏蒸剂。生物熏蒸是利用植物组织分解释放的挥发性化学物质（化感物质）来抑制害虫的农学实践[13，14]。大多数研究是用含有异硫氰酸酯的芸苔属植物[15]寻找生物熏蒸剂，异硫氰酸酯对线虫、细菌、真菌、昆虫和杂草的发芽种子然而，关于生物熏蒸剂对整个土壤细菌群落的影响的资料很少在此基础上，研究了生物熏蒸剂和化学熏蒸剂氯化苦对土壤微生物群落结构的影响。用于生物熏蒸的芸苔属植物被用作土壤还原的碳源麦麸和低浓度乙醇用于土壤还原。下一代DNA测序技术，特别是使用Roche/454平台的焦磷酸测序，已应用于微生物生态学研究[16在这项研究中，我们调查了细菌群落组成的条形码16 S rRNA基因454-焦磷酸测序技术。结果表明，氯化苦熏蒸剂对天然土壤细菌组成有较大影响，而生物熏蒸剂和还原剂处理对天然土壤细菌群落影响不大。图1 -土壤处理和土壤取样的时间表。在黑色条所示的整个时间内用左侧所示的材料处理土壤。番茄植物在由灰色条所示的时间内在土壤中生长。在箭头所示的当天采集土壤。在距地表5cm处定期采集。总结了土壤处理和土壤采样的时间表（图1）。①的人。2.1.2.土壤理化性质分析土壤理化性质分析采用以下方法。将土壤样品风干并通过2 mm筛目的筛子。用六偏磷酸钠作分散剂，用吸管法测定土壤颗粒度。使用玻璃电极以1：5的土壤溶液比在水中测定土壤pH使用NC分析仪（JM 1000CN，J-Science）分析总碳和氮含量新鲜土壤样品通过4 mm筛孔后，用0.5 MK2SO4溶液以1：5的土壤与溶液比提取土壤有机碳，并通过TOC仪（TOC-VCPH，Shimadzu）测定C浓度[19]。2.2.454焦磷酸测序和数据分析使用ISOIL for Beads Beating从土壤中提取DNA2.材料和方法2.1.土壤取样、制备和理化性质2.1.1.土壤准备和土壤样品采集实验中使用了装有约45公斤土壤的塑料容器。土壤是从农场取样的 高知大学亚热带田野科学教育研究中心每种处理进行5次重复。1.4将2个月大的芥菜（Brassicajuncea）的100g小块嫩枝和100g根与土壤（芥菜）混合将土壤与0.24 kg麦麸（小麦麸）和2%乙醇（乙醇）混合。用塑料布覆盖容器，并将其浸没在水中约一个月，以进行土壤减少消毒。土壤处理，在两个孔中加入4 ml氯化苦，用塑料片覆盖10天（氯化苦）。在第一次处理后，在每个容器土壤样品（ Nippon Gene ） 。 使 用 Micro Smash MS-100 （ TomySeiko）以5500 rpm破碎0.5 g土壤将表达DNA稀释，超声处理5分钟，并用作PCR模板。PCR扩增16SrRNA基因V4和V5区。正向引物F563-LXA的5′端含有一个序列（ CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC ） 和 一 个 关 键 序 列（TCAG），随后是钛接头（MID 1 ~MID 6，Roche）和特异性序列（AYTGGGYDTAAAGNG）。反向引物为BSR 926-LB（5′-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGCCGTCAATTYYTTTRAGTTT-3′）。的PCR产物（约450-bp大小）通过使用大小缓冲液（7%PEG 6000和1M NaCl ） 的 Ampecourt AMPure XP 纯 化 用 Lib-L 试 剂 盒（Roche）进行乳液PCR，并在GS Junior 454系统（Roche）上分析扩增子。使用QIIME 1.8[20]至OTUMAMi 3.13[21]处理和分析原始序列数据。RDP用于将序列分类到门/纲中，并将序列聚类到操作分类单位（OTU）中。从每个OTU中选择代表性序列并使用143埃及基础科学与应用科学杂志3（2016）141表1一土壤处理日期bpH有机碳总C（g kg−1）全氮C/N比粒度砂质粉土（%） 粘土治疗前5.950.8516.41.3711.958.222.019.8没有一25.940.6416.71.3912.060.520.818.636.220.5815.61.4111.145.880.5816.11.4511.155.850.5916.11.4411.2芥末绿15.980.6817.21.5411.261.021.018.026.030.7717.11.4012.259.721.119.236.290.6416.51.4811.245.890.6616.61.5210.956.020.7117.01.5311.1麦麸15.900.7417.51.5211.559.522.118.425.950.8517.81.4212.559.621.618.836.130.6016.51.5011.045.750.6316.51.5210.955.850.6816.21.5010.8乙醇15.840.6916.61.4311.660.521.418.125.810.5017.21.4312.159.721.818.436.090.3715.91.4211.245.690.4315.71.4410.955.700.4715.91.4510.9氯化苦35.900.0715.51.4111.046.170.1115.31.4410.755.830.0915.71.4211.0一 三次测量的平均值。b日期对应于图1中的采样时间。1.一、使用RDP管道[23]计算Chao I丰度估计[22]。观察到的物种数据通过使用MicrosoftExcel程序从用于生成稀疏图的QIIME管道中拾取。使用OTUMAMi绘制分层热图[21]。主要门的相对丰度的条形图通过OTUMAMi中生成的R命令进行，并通过统计软件包R 3.0.2可视化。通过使用QIIME管线中的UniFrac距离[24]生成Jackknifed Prin-UNRCoordinate（PCoA）分析图，并通过合并的EMPEROR软件进行可视化。测序的读段数据已经以登录号DRA003990 和 DRA003993 保 藏 在 DDBJ Sequence ReadArchive（DDBJ）中。3.结果3.1.土壤物理性质测定了所研究土壤的物理性质，不同处理之间没有观察到显著差异（表1）。研究土壤类型为砂质粘壤土、弱酸性土壤。3.2.土壤有机碳含量土壤中的有机碳可来源于微生物生物量[19]。有机碳略有增加，在土壤减少与麦麸和芥菜的初始步骤（图）。 2），表明在这些步骤中，微生物生物量增加。在氯化苦处理的土壤中，土壤生物量急剧降低，并保持在低水平在整个研究过程中（图） 2和表1）。番茄在所有的土壤中都长得很好。在生长速率方面未观察到显著差异（数据未显示）。3.3.不同处理16S rRNA基因的大规模焦磷酸测序在系统发育分析方面提供了更多的序列信息。图2 -不同处理土壤有机碳含量。在圆圈指示的日期收集具有不同处理的土壤。用0.5M K2SO4溶液按土液比1：5提取土壤有机碳，用TOC仪测定碳浓度。144埃及基础科学与应用科学杂志3（2016）141图3 -用不同材料处理的土壤的稀疏分析。计算了物种丰富度观测值和估计值的稀疏度，并利用QIIME绘制了稀疏度曲线。(A)CT3、KA3、SR3、ET3和CP3分别在采样时间3使用未经处理、芥菜、麦麸、乙醇和氯化苦处理的土壤。(B)CT5、KA5、SR5、ET5和CP5分别在采样时间5使用无、芥菜、麦麸、乙醇和氯化苦处理的土壤。多样性和群落组成与克隆文库的基于Sanger的测序相比[16]。在两个阶段（采样时间3和5）进行16 S rRNA基因V3-V4区域的基于焦磷酸测序的分析。物种丰富度估计与两个稀疏曲线（图）。 3）和Chao 1指数（表2）。除氯化苦处理外，不同处理土壤细菌物种丰富度基本相同。在采样时间3，施用氯化苦的土壤中的物种丰富度约为其他土壤中物种丰富度的一半，在采样时间5略有增加（图3）。施用氯化苦的土壤中的细菌多样性远低于Shannon多样性指数估计的其他土壤中的细菌多样性（表2）。这些观察结果与施用氯化苦的土壤中有机碳含量较低（图2）相一致。表2样品序列号OTU数量a超1BH′cCT32,0216561,2295.73KA31,5146211175.87SR31,4345421,2535.62ET31,4495471,0925.75CP31,2192255484.01CT58,0502,3353,8067.05KA510,6392,7874,5517.09SR514,0472,9864,6646.96ET511,5822,5964,0506.90CP54,4731,0752,0735.86a最大距离为0.03的OTU数bChao 1指数，最大距离为0.03。c香农多样性指数，最大距离为0.03。3.4.门级在土壤中检测到的主要门是绿藻门、浮游菌门、疣微菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、蓝细菌门和硝化螺旋菌门（图11）。4）。酸杆菌和变形菌门是最丰富的门在对照土壤中没有任何处理在两个采样时间。这两个门在除氯化苦施用土壤外的其它土壤种植番茄后，酸杆菌的优势度略有下降。这可能是由于番茄根际中掺入了某些细菌所致。当氯化苦施入土壤中时，厚壁菌门成为优势菌，约占土壤细菌群落的75%。在取样时间5，厚壁菌门的丰度减少，拟杆菌门出现。虽然变形菌变得最丰富，但施用了氯化苦的土壤中的细菌群落组成仍然与其他土壤中的细菌群落组成不同（图1）。 4）。3.5.OTU级别土壤细菌群落组成按生物学分类等级递减。热图是用OTU构建的，OTU在任何土壤中相对丰富，超过1%在施用氯化苦的土壤中，大多数丰富的OTU在处理后三周属于厚壁菌门（Fig.5A），与门水平的α多样性一致。优势菌OTU#3024属于脂环酸芽孢杆菌属。观察到黄土杆菌属的成员（OTU#904）为主要OTU。氯化苦处理后两个月，大多数厚壁菌门消失或变得不那么丰富。属于拟杆菌门的OTU成为优势菌（图1）。 5A）。的145埃及基础科学与应用科学杂志3（2016）141图4用底部所示的材料处理土壤缩写与图相同。3.第三章。优势OTU为黄腐杆菌属（OTU#2988）。属于变形菌门的几个OTU也变得丰富。属于慢生根瘤菌属的OTU#3551是其他土壤中的优势细菌之一（图11）。5B）。 由于这种OTU主要存在于对照土壤中，甚至存在于施用氯化苦的土壤中（图1）。5A），该细菌似乎在该实验中使用的土壤中占优势。另一个优势菌OTU#2871 属 于 土 杆 菌 属 （ Solibacter ） 。 Solibacter 是Acidobacteria的成员，在门水平上与α多样性一致（数据未显示）。属于梭菌属的OTU#1467在用麦麸和芥菜处理的两种土壤中均占优势。优势细菌的组成在取样时间3和5之间稳定两个月（图5B）。3.6.Beta多样性使用Jackknifed PCoA计算β多样性。α多样性分析表明，乙醇、麦麸和芥菜处理的土壤中的细菌群落组成与未处理的土壤中的细菌群落组成形成一个聚类（图6）。这一现象的原因是氯化苦的施用杀死了大部分优势菌，并在两个月内使细菌群落结构发生了重组。但群落结构并未恢复到原来的土壤细菌组成。4.讨论研究了几种土壤消毒材料对土壤细菌群落结构的影响两种生物材料，麦麸和芥菜，和一种化学物质，低浓度的乙醇，用于土壤还原。一种化学品氯化苦被用于熏蒸。 DGGE是观察整体细菌群落结构和组成的快速且相对容易的方法[25]。DGGE结果与另一种焦磷酸测序方法的结果几乎一致（数据未显示），表明这两种方法的组合可以是分析细菌群落结构的有效方式。我们证明了氯化苦施用土壤含有与其他土壤非常不同的细菌组成。厚壁菌门成为占主导地位的约75%的细菌物种的氯化苦施加的土壤。与生物量相应的有机碳也在施用氯化苦的土壤中急剧减少。尽管细菌群落结构存在这些差异，但种植的番茄植物在氯化苦处理的土壤中生长并形成果皮，与在其他土壤中一样正常（数据未显示）。我们将在下一步阐明土壤中细菌多样性与农业影响（如植物生长和生产力）之间的关系氯化苦是一种有毒气体，可直接杀死土壤生物并减少生物量[26]。化学烟雾剂破坏微生物的细胞壁[5]。由于厚壁菌门形成孢子，孢子形式可以抵抗氯化苦，甚至在氯化苦处理后仍然存活虽然我们没有测试氯化苦对害虫的有效性氯化苦被证明对商业草莓田中的几种杂草有效[27]。即使在氯霉素处理后三个月，细菌群落结构也没有恢复到原来的状态，尽管厚壁菌门不再占优势。总之，我们得出结论，氯化苦完全扰乱细菌群落结构。146埃及基础科学与应用科学杂志3（2016）141图5选择在所选土壤中存在超过1%的OTU，指出了（A）施用氯化苦的土壤和（B）其他土壤中的OTU147埃及基础科学与应用科学杂志3（2016）141图6PCoA显示了细菌组成的差异基于计算的加权UniFrac距离度量示出了折刀图土壤中的细菌群落结构不受土壤还原与几个碳源，麦麸，乙醇，芥菜。土壤还原消耗了土壤中的氧气，因此真菌等真核生物无法在这种还原的气氛中生存，尽管我们没有测量真核微生物的数量。许多土壤细菌是兼性厌氧的，确认我们感谢Masatoshi Shirota使用GS Junior系统进行焦磷酸测序R E F E R E N C E S即使在用碳源减少土壤之后。这就是为什么用麦麸处理过的土壤中的细菌成分，乙醇和芥菜几乎与对照土壤相似杂草在小麦麸皮施用的和芥菜绿施用的土壤中生长芥菜作为生物熏蒸剂，只要是减少土壤的碳源。芸苔属植物分解形成生物毒性元素异硫氰酸盐[28，29]。从芸苔属植物的切碎的叶材料释放的挥发物抑制马铃薯的多种植物病原真菌的生 长， 包 括 立 枯丝 核 菌（ Rhizoctonia solani ） 、 赤 腐 疫霉（ Phytophthora erythoseptica ） 、 终 极 腐 霉 （ Pythiumultimum）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）和接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）[30]。B. 芥菜和芜菁引起超过91-95%的 死亡率囊鸡蛋的线虫Globodera 苍白球[31，32]。B. juncea和B.芜菁分别含有2-丙烯基芥子油苷和3-丁烯基芥子油苷作为主要芥子油苷。这些芥子油苷的杀生物活性与合成杀虫剂和抗生素庆大霉素的功效相当[31，32]。从这个意义上说，合成农药，如溴甲烷和氯化苦，可以用芸苔属植物代替芸苔属植物是一种极具吸引力的减土和生物熏蒸材料[1] 杜C，里斯特伊诺BJ，胡S.有机番茄种植系统土壤微生物量和活性：有机投入和秸秆覆盖的影响。土壤生物学与生物化学2006;38：247[2] 克莱格CD，洛弗尔RDL，霍布斯PJ。 草地管理制度对土壤细菌群落结构的影响。FEMS微生物学生态2003;43：263-70。[3] PeacockAD ， Mullen MD ， Ringelberg DB ， Tyler DD ，HedrickDB，Gale PM，et al.土壤微生物群落对牛粪或硝酸铵施用的反应。土壤生物化学2001;33：1011-19.[4] 皮门特尔湾农药应用的环境和经济成本主要在美国。《环境与发展可持续》，2005年;7：229-52。[5] Navarro G，Vela N，Navarro S.土壤中农药残留的环境行为研究进展。Span JAgric Res2007;5：357-75.[6] FrankMP，Graebing P，Chib JS. 土壤湿度和样品深度对农药光解的影响。农业食品化学杂志2002;50：2607-14.[7] Rodríguez-CruzMS，Jones JE，Bending GD.农药降解随土壤深度变化的田间尺度研究及其与土壤特性的关系。土壤生物学与生物化学2006;38：2910-18.[8] 立谷湾日本为在2013年之前逐步淘汰甲基溴所做的巨大努力。Acta Hortic2010;883：83-9.148埃及基础科学与应用科学杂志3（2016）141[9] Himelrick DG，Dozier WA Jr.土壤熏蒸和土壤日晒在草莓生产中的应用。 Adv Straw 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