羟基氯喹与SARS-COV-2感染相关蛋白结合的研究

医学信息学解锁26（2021）100714羟基氯喹与SARS-COV-2感染相关靶蛋白结合的计算研究V.B. Navya，M.V.霍苏尔*国家高级研究所，IISc。班加罗尔，印度A R T I C L EI N FO关键词：冠状病毒SARS-COV-2HydroXychloroquineACE2烟碱型乙酰胆碱受体刺突肾上腺素能受体细胞因子风暴拓扑异构酶III β复制A B S T R A C T由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染引起的COVID-19疾病已构成全球卫生紧急情况。重新利 用 现 有 药 物 可 能 是 对 抗 感 染 的 快 速 有 效 策 略 。 临 床 试 验 已 经 报 道 了 当 患 者 接 受 抗 疟 疾 药 物 HydroXychloroquine（HCQ）治疗时，病毒载量的减少或消除。为了了解这种药物有效再利用的分子作用机制，我们对HCQ和靶蛋白之间的复合物进行了计算机被鉴定为结合HCQ的蛋白质是：血管紧张素转换酶2（ACE 2）、α 7烟碱乙酰胆碱受体（α 7 nAChR）、α 1D-肾上腺素能受体（α 1D-AR）、组胺N-甲基转移酶（HNMT）和DNA促旋酶/拓扑异构酶III β（Top3β）。这些蛋白质中的大多数是新的，以前没有在对接研究中使用过。我们的对接和模拟结果支持HCQ的行动在进入和进入后阶段的SARS-CoV 2感染。进入阶段的作用机制是通过直接结合两种受体ACE2 α 7 nAChR上的病毒结合位点来阻断&这些位点。我们的计算研究还表明，HCQ在进入后阶段的作用是通过分别抑制宿主Top3 β酶和α 1D-AR来防止病毒复制和“细胞因子风暴”的产生HCQ与HNMT的结合不是所需的结合，因此在HCQ的再利用期间应减少这种结合。1. 介绍由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2（SARS-COV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）传播相对较快，导致全球大流行[1]。这种新的SARS-COV-2可以感染下呼吸道并导致人类肺炎。报告的最常见症状包括头痛、发热、腹泻、咯血、流鼻涕、咳嗽和淋巴结炎，影响心脏、肾脏、肝脏、胃肠道系统和中枢神经系统[1]。一个重要的不良反应是“细胞因子风暴”的炎症反应病毒通过内吞作用进入宿主细胞是由病毒刺突蛋白（S）介导的，该刺突蛋白被宿主蛋白酶弗林蛋白酶切割成S1和S2亚基。S1亚基中的受体结合结构域（RBD）介导病毒与宿主受体血管紧张素转化酶2（ACE 2）的附着，所述宿主受体血管紧张素转化酶2（ACE 2）表达于多种细胞（例如，肾脏、心脏、肺和胃肠道系统）[3]。的S2亚基介导内吞作用中的融合后步骤[4]。在病毒进入并经过5.2天的潜伏期后，SARS-COV-2感染的症状开始出现[1]。COVID-19的临床管理目前通过对症治疗，因为尚未有特定药物可治愈该疾病。抗疟疾药物盐酸氯喹（HCQ）已被证明对人类免疫缺陷病毒（HIV）、SARS-COV-1、流感病毒、丙型肝炎病毒等有效。[5]，被发现在控制SARS-COV-2感染方面也有显著的成功率[6]。HCQ治疗的好处是减少呼吸道症状、肺部炎症和鼻咽清除。HCQ与阿奇霉素联合使用可降低病毒载量和死亡率[7]。然而，其他一些研究表明HCQ对COVID 19患者无效[8]，因此导致了关于HCQ疗效的争议[8，9]。最近对HCQ治疗COVID-19患者的报告进行的一项调查显示，HCQ的疗效取决于给药时的疾病阶段，在疾病早期阶段更有效[6，10，11]。EX实验* 通讯作者。电子邮件地址：hosurmv@nias.res.in（M.V.Hosur）。https://doi.org/10.1016/j.imu.2021.100714接收日期：2021年6月14日;接收日期：2021年8月19日;接受日期：2021年2021年8月23日在线提供2352-9148/©2021的 自行发表通过Elsevier 公司这是一个开放接入文章下的CCBY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）中找到。可在ScienceDirect上获得目录列表医学信息学期刊主页：www.elsevier.com/locate/imuV.B. Navya和M.V. Hosur医学信息学解锁26（2021）1007142±研究表明HCQ的抗病毒和抗炎特性基于多种机制[11HCQ干扰病毒有效进入宿主细胞所需的细胞受体ACE2和唾液酸受体的糖基化通过增加内体pH，HCQ干扰病毒和细胞内体膜的融合HCQ还对病毒体组装和出芽产生不利影响，并减少细胞因子风暴[5，6，13]。然而，这些作用机制在分子水平上还不清楚。因此，在我们的研究报告中，我们研究了HCQ的分子机制，通过寻找靶分子，然后使用分子对接和分子动力学模拟的计算机技术研究靶点与药物的相互作用。靶点发现仅基于分子相似性，对SARS-COV-2相关分子没有任何偏见。发现的靶点之一是烟碱乙酰胆碱受体，最近报道其参与SARS-COV-2的病理生理学[14，15]。我们的研究结果表明，HCQ直接与α7烟碱乙酰胆碱（α7 nAChR）和ACE2受体结合[3]，其结合方式会干扰病毒刺突蛋白与这些受体的结合。我们的计算还表明，HCQ直接与α 1D-肾上腺素能受体（α 1D-AR）结合，这可能会影响抗炎反应，如细胞因子风暴[2，5]。我们的研究结果还表明，HCQ可以通过抑制SARS-COV-2复制所需的拓扑异构酶III β（Top3β）的活性来干扰病毒复制。因此，我们的研究结果表明，HCQ的潜力，影响进入和复制的SARS-CoV-2，从主机的抗炎反应。通过给出药物-靶标结合的原子级结构细节，我们的结果还为化学修饰提供了模板，这些化学修饰将使修饰的HCQ对COVID-19更具特异性。2. 材料和方法2.1. 药物靶点预测有几种软件工具可用于预测可以结合给定药物分子的蛋白质。本研究中使用的HCQ工具包括：SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/），[16]，Targetmine，Promiscous [17]，相似性包围方法（SEA）[18]和SuperTarget [19]。来自药物数据库DrugBank，ChEMBL [20]的信息DrugBank（https://www.drugbank.ca/）是一个在线免费网络服务器，用于确定药物的化学，生物学和结构细节[21]。从DrugBank（HCQ的DrugBankID为DB01611）获得的药物的SMILE（简化分子输入行输入系统）表示作为目标寻找软件的输入2.2. 蛋白质结构建模从UniProt数据库[22]中检索其三维结构待建模的蛋白质的氨基酸序列，并用于在BLASTp（基本逻辑序列比对工具）[23]中查询蛋白质数据库（PDB）。从BLASTp输出中选择具有较高序列同一性的结构作为同源性建模的模板，使用工具Robetta同源性建模器进行同源性建模使用各种工具评价模型的立体化学质量：使用PyMOL计算靶模板（用于同源性建模的结构）RMSD [25]，通过VADAR（体积，面积，二面角报告基因）进行Ramachandran图分析[26]，ProSA（蛋白质结构分析）[27]，ERRAT和Verify3D [28]。使用GROMACS [29]对最佳模型进行分子动力学模拟，并使用与上述相同的工具进一步确认输出能量最小化结构的质量。2.3. 对接-蛋白质制备从RCSB Protein Data Bank（rcsb.org）中检索以下靶蛋白的三维结构：天然ACE2（PDB ID：1R42）、α7 nAChR（3SQ9）、DNA促旋酶（4KFG）、HNMT（2AOT）、TOP3β（ 5GVC ） 。 通 过 使 用 蛋 白 质 制 备 向 导 （ Schr ？ dingerSuite2019-2Protein2.4. 结合位点分析和网格生成使用Maestro（Schrödinger，LLC，NewYork，NY，2019-2）的Glide应用程序（Glide，Schr ödinger，LLC和NewYork-2）中的受体网格生成选项生成受体网格。生 成蛋白质靶点的受体网格，以包围由SiteMap工具（SiteMap，Schr？dinger，LLC，NewYork，NY，2019）识别的结合（活性）位点残基[31]。根据位点评分和BSA（结合表面积）对药物结合位点在每个位点生成长度为20 μ m的立方体网格在靶蛋白HNMT和DNA促旋酶的情况下，立方体网格框X被定位成其中心与配体-蛋白质复合物的晶体结构中的配体分子的质心重合。部分原子电荷为0.25单位。2.5. 配体文库制备关于配体分子4-羟基氯喹的信息以空间数据文件（.SDF）文件格式从Pub-Chem化合物数据库（PubChem CID：3652）（国家生物技术信息中心;https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载。然后在对接前 ， 将 借 助 Marwin sketch （ Marwin 15.12.17 ， ChemA X on（https://www.chemaxon.com）工具）制备的3D结构通过LigPrep（ LigPrep ， Schrödinger ，LLC ， NewYork ， NY ， 2019 ） 。 通 过LigPrep制备分子涉及保留确定的手性，以使用pH 7.0的默认条件，每个配体产生至少五个低能立体异构体2.0. LigPrep纠正质子化和电离状态的化合物，磅，并分配适当的键序。然后，为每个配体创建互变异构和电离状态2.6. 分子对接使用Schrodinger [32]和AutoDock Vina [33]的两种软件工具Glide程序完成配体4-羟基氯喹与靶蛋白的对接将配体库输出文件和受体网格文件用作输入文件。在对接过程中，将配体视为柔性体，而将受体视为刚性体在Glide对接中使用XP-E x tra精密度模式对接配体通过使用第二个软件工具AutoDock Vina独立验证最佳姿势在对接前通过氢键优化、电荷添加进行蛋白质和配体预处理，然后生成类似于Glidegrid boX中的位点的grid boX。拉马克遗传算法（GA）结合基于网格的能量评估方法用于对接[33]。其他参数设置为默认值，获得的最终结果为使用PyMOL [25]和LigPlot+ [34]手动分析。V.B. Navya和M.V. Hosur医学信息学解锁26（2021）1007143-表1通过不同软件预测HCQ可以高亲和力结合的靶蛋白。(The软件工具以粗体给出，并且由该工具鉴定的蛋白质紧接在下面列出）。表2使用Glide对接软件（对接中比较的对照），（a）HCQ（b）HCQ/抑制剂/底物与不同蛋白质靶标的分子对接的对接评分。瑞士目标预测毒蕈碱乙酰胆碱公司简介Toll样受体7蛋白质靶点对接评分(kcal/mol）1组胺N甲基转移酶-15.08M2受体α-1D-肾上腺素能受体Toll样受体9SEA SERVER细胞色素P4502α7烟碱型乙酰胆碱受体3血管紧张素转换酶2-11.9-10.059毒蕈碱乙酰胆碱药物库/PUBCHEM4毒蕈碱乙酰胆碱-9.804M2受体α-1D-肾上腺素能受体DNA组胺N甲基转移酶Toll样受体7 DNA促旋酶亚单位BToll样受体9受体5DNA促旋酶-9.336β 2-肾上腺素能受体-9.167 MAPKP38-7.564C-C细胞色素P4508细胞色素P450D26-7.3699趋化因子受体4-7.08PROMISCOUS血管紧张素转换酶2胱天蛋白酶3CHEMBLCaspase 8凝血因子X10Caspase8-7.03311NSP3蛋白酶712Toll样受体7-6.36613Toll样受体9-5.772白细胞介素-6碳酸酐酶14Nsp12 RdRp（RNA依赖性RNA聚合酶）-5.6SUPERTARGET神经元乙酰胆碱受体α 7（烟碱乙酰胆碱酯酶Caspase8白细胞介素-615弗林-5.55816胱天蛋白酶3-2.617（a）蛋白质靶向配体对接评分（千卡/摩尔）α7烟碱HCQ-11.92.7. 分子动力学模拟对蛋白质进行了分子动力学模拟和蛋白质-配体复合物，使用GROMACS 2018.1 [29]。使用ATB在线服务器[35]在框架中分析配体参数乙酰胆碱受体血管紧张素转换酶2盐酸洛贝林-5.172-7.668-7.80-10.059GROMOS力场43a1的工作。将配体-蛋白质复合物置于尺寸为10*10*10 μm的立方体的中心，然后通过SPC/E水分子将其溶剂化。了配合物α1D-肾上腺素能受体DNA拓扑异构酶IIIβ喹那普利-7.5HCQ-8.8哌唑嗪-9.1HCQ-9.23通过添加抗衡离子中和电荷，并使能量最小化用最陡梯度法消除空间位阻。能量最小化 系统 是 进一步 分析 与NVT 和 然后是《不扩散条约》（b）第（1）款阿霉素-9.4在300 K温度下，100 ps（ps）模拟的系综。最终的生产MD运行进行50ns（每步2fs），其中周期性边界条件保持系统温度在300K.使用软件包中的选项xmgrace计算的能量、均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、回转半径（Rg）和氢键数（HB）的2D图分析产生的每个轨迹。蛋白质-HCQ复合物的稳定性反映在通过分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）方法计算的结合自由能中[ 36 ]。2.8. 蛋白质对接蛋白质-蛋白质对接（主要是病毒刺突蛋白的受体结合结构域与受体蛋白的对接）使用工具- HADDOCK和HADDOPro进行。必要的蛋白质的三维结构和预测的接口残基的身份被用作对接计算中的输入。对接结构基于相互作用能量值（HADPro）和HADDOCK评分（HADDOCK）进行排名，HADDOCK评分给出了各种相互作用能量的累积评分[37，38]。还使用PDBsum和PDBePISA服务器分析了所有对接的复合物，以探索大分子界面[39，40]。2.9. 使用的其他工具分子图形软件PyMOL和COOT用于分子结构的可视化和叠加[25，41]。蛋白BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Clustal O（clustalomega）用于成对序列比对研究。3. 结果和讨论3.1. HCQ目标表1中给出了通过不同软件工具鉴定为与HCQ结合的蛋白质靶标。有趣的是，受体ACE2没有被任何靶标发现软件识别。除了表1中列出的那些之外，通过检索文献，以下蛋白质被鉴定为HCQ的可能结合物：MAPK [42]、ACE 2、刺突蛋白、NSP 3蛋白酶、弗林蛋白酶、TMPRSS 2[13]和聚合酶蛋白[43]。所有这些蛋白质通过文献调查和目标寻找软件被确定为我们的分子对接计算的目标3.2. 分子对接研究网格生成和靶分子和配体分子的制备 如在分子对接计算之前的方法中所述。HCQ在每种鉴定的蛋白质靶标上的对接结果在表2a中给出。表2b给出了当已知的抑制剂/底物对接到相应的受体蛋白质中时获得的对接分数以供比较。仅进一步研究了对接评分为8 kcal/mol或更好的靶点（表2a），这些靶点为：ACE 2、α7 nAChR、α1 D-AR、DNA促旋酶和HNMT（表2a）。V.B. Navya和M.V. Hosur医学信息学解锁26（2021）1007144-Fig. 1. HCQ与ACE2的对接：HCQ在ACE2的两个结构域的界面处结合。配体对接后的蛋白质表面视图（顶部）。相互作用的残基被标记，并显示了氢键相互作用（下图）。在两种类型的乙酰胆碱受体中，nAChR与SARS-COV-2感染相关，因此将其用于我们的研究[14，15]。许多其他目标，给出了良好的对接分数与HCQ是表3HCQ与最佳对接姿势的不同蛋白质的相互作用发现与SARS-COV-2感染直接相关[5，13]。例如，与已知病毒受体ACE2的对接得分蛋白目标氢键疏水性相互作用盐桥是表2a中第三高的对接分数。HCQ与ACE 2具有以两种方式影响病毒刺突蛋白结合的潜力：1）通过ACE2谷氨酰胺98（2.74），酪氨酸202（2.85），Glu 208亮氨酸95，色氨酸566，谷氨酰胺98，Tyr 196、Trp 203、Asp201Tyr 202影响ACE2的糖基化，和2）通过阻断ACE2上的刺突蛋白结合位点[44]。有趣的是，同样高的对接分数 是针对目标α7 nAChR获得的，这是最近才发现的α7 nAChR（2.69）A：色氨酸145（2.75），B：谷氨酰胺55（2.79），B：天冬氨酸160（3.08）A：Tyr 191，B：Trp 53，B：Leu116，A：Tyr 184，B：Leu116，B：赖氨酸139A：色氨酸145参与SARS-COV-2的病理生理学[14，15]。高α1D-ARIle 152（2.94），Glu色氨酸76，蛋氨酸60，苯丙氨酸292，天冬氨酸80肾上腺素能受体是胆碱能通路的一部分，其评分具有重要意义，因为最近发现α1D-AR拮抗剂可降低COVID-19患者的死亡率，并且HCQ结合可在炎性细胞因子促炎过程中影响儿茶酚胺信号通路。TOP 3β154（3.43）丙氨酸384（3.08）、天冬氨酸511（2.93），Arg181（2.94）苯丙氨酸288，酪氨酸296丙氨酸384，丙氨酸512，缬氨酸178，天冬氨酸386，天冬氨酸119，谷氨酸121这是一个与许多死亡有关的问题[45]。另一个具有高对接得分的新靶标是与DNA促旋酶同源的拓扑异构酶蛋白，其显示参与SARS-COV-2复制[46]。拓扑异构酶活性的可能抑制可能是体外研究中观察到的HCQ进入后作用的机制之一[6]。 对与这些靶标结合的HCQ分子周围环境的详细表征将使HCQ能够有效地重新用于治疗COVID-19患者。早期的研究试图重新利用靶向宿主分子ACE 2、醌还原酶和病毒分子nsp 12 RNA聚合酶、nsp 3蛋白酶、核衣壳、刺突、加帽机制nsp 14/nsp 16等的药物[47此外，靶蛋白质实验显示，本研究中鉴定出的H2 O2在SARS-COV-2感染过程中起关键作用[15，44，45，51]，因此是HCQ抑制的适当靶点[44，52，53]。3.2.1. 血管紧张素转换酶2（ACE 2）-HCQHCQ与ACE 2的对接针对通过位点图分析确定的每个位点。在对接得分为10.059 kcal/ mol的最佳姿势中（表2a），HCQ位于靠近活性位点腔的位置，如图1所示。HCQ的这种结合位点不同于早期对接研究中报道的与ACE 2结合的变构位点[47，48]。差异可能是由于使用不同的软件V.B. Navya和M.V. Hosur医学信息学解锁26（2021）1007145或由于在研究中使用ACE 2-spike晶体复合物进行HCQ对接。此外，最近V.B. Navya和M.V. Hosur医学信息学解锁26（2021）1007146---+号表4使用AutoDock Vina进行的HCQ与蛋白靶点的对接研究：评分&相互作用残基的详细信息。氢键作为时间的函数（图2）。可以看出，蛋白质-HCQ复合物的RMSD最初在10 ns之前显著变化，并且在12 ns之后变得稳定，收敛到平均值蛋白质靶标亲和力(kcal/mol）氢键疏水相互作用残留物0.25nm的波长，直到运行的50ns。相反，对于载脂蛋白，该图显示连续变化，并且即使在50 ns后也没有显示收敛ACE2-6.2 Glu208 Gln 102，Tyr 196，Gln 98，Leu95，Pro 565，Asp 206，Ala396α7 nAChR-6.2 Ser 77，Asp 87，Trp 145，Ile 80，Val 85，Tyr 116（图2a）。RMSF图显示当HCQ结合到ACE 2的596个氨基酸时，ACE2的596个氨基酸的波动较小，平均值为0.1 nm。蛋白质（图） 2 b）。HCQ和H2O之间的氢键数α1D-AR-6.4 Asp80，Cys Lys 289，Phe 288，Asp 80，Trp蛋白质在整个模拟过程中都TOP 3β150-6.1天冬氨酸185，苯丙氨酸21476，Ala 77，Phe 292，Ser283精氨酸181，甘氨酸189，谷氨酰胺182，丙氨酸512，谷氨酰胺218，精氨酸524，His 517显示了氢键相互作用的稳定性（图2c）。Rg图显示，与未配体的蛋白质不同，HCQ结合的蛋白质更加紧凑和稳定，没有波动（图11）。 2d）。的计算[50]也可以在我们对HCQ的计算中找到，但排名较低。这里观察到的HCQ的结合比已知的ACE 2抑制剂喹那普利的结合更强通过AutoDock Vina [33]进行的对接研究进一步证实了该位点的HCQ相互作用，获得的对接评分为6.2 kcal/mol（表4）。HCQ结合位点靠近位于ACE 2的亚结构域I和II的界面处的活性位点，HCQ与来自亚结构域I（Gln 98）和II（Tyr 202，Glu 208）的残基形成氢键（图1B）。 1），如表3所示。裂缝中HCQ的结合可能干扰ACE2催化活性所需的两个亚结构域的铰链运动[54]。Glide和Vina预测氨基酸残基Gln 98、Tyr 196、Gln 102和Glu 208参与HCQ结合（表4）。研究了HCQ在新发现的位点与ACE2结合对ACE2与病毒刺突蛋白相互作用的影响，结果报告如下。HCQ-ACE 2复合物的稳定性通过运行MD来研究使用软件GROMACS [29]模拟50 ns，结果显示为RMSD、RMSF、Rg和配体-蛋白质MM-PBSA [36]使用2 ns MD轨迹进行结合能计算，ACE 2-HCQ复合物显示结合能为1090.881/- 57.615 kJ/mol。作为补充资料，（补充材料：表1&，图1a和b）。HCQ与Gln 102、Tyr 196和Glu 398的氢键在ACE2 HCQ对接复合物的整个MD模拟中稳定保持在ACE 2-刺突蛋白复合物的晶体结构中，氨基酸残基Gln 102和Tyr 196从其天然位置置换1.5- 6个碱基[ 55 ]（图2）。这些残留物与HCQ的相互作用可能不允许这种移动能够与病毒刺突蛋白相互作用。与天然ACE 2相比，HCQ-ACE 2对接复合物中主要来自S1亚结构域的其他残基已被置换多达3- 5个碱基[ 54 ]。由于这些残基也参与了刺突蛋白与ACE2的结合[55]，我们的结果表明HCQ与ACE2的结合会对刺突蛋白与ACE2的亲和力产生不利影响。Rg图显示（图2d）ACE 2在结合HCQ时构象变得更加稳定和紧凑。图二. ACE 2- HCQ复合物MD模拟输出：（a）RMSD图（b）RMSF图（c）氢键图（d）回转半径图。V.B. Navya和M.V. Hosur医学信息学解锁26（2021）1007147----表5以刺突蛋白进行蛋白质靶点的蛋白质对接研究。PROTEINS HADDOCK PRACTICE Pro埋表面积HADDOCK评分ACE 2加标物-132.4+/- 8.4 2009.8-1432.5ACE 2-HCQ加标物-74.7+/- 8.7 1888.4-1377.4α 7 nAChR加标-87.2+/- 2.32112.9-1432。α7 nAChR-HCQ加标物-64.8+/-6.0 1998.7 7593.2.2. ACE 2-加标物HCQ-ACE 2现在可以获得加标物-ACE 2复合物的晶体结构（PDB ID：6lzgg），从而揭示了结合界面处的氨基酸残基[55]。有了这个输入，通过HADDOCK和HADDOPro进行ACE 2-尖峰对接[37，38]。在我们的对接研究中，最好的ACE 2-尖峰复合体姿势是HADDOCK和加权HADDOCK Pro评分为 132.48.4和1432.5（表5&图3a）。为了检查HCQ与ACE 2的结合是否抑制刺突结合，提取模拟后ACE 2-HCQ复合物的坐标用于与刺突蛋白对接。对于该对接，相应的HADDOCK和HADDOPro评分分别为74.7 /- 8.7和1372.5（表5）。有趣的是，HADDOCK评分显著降低，表明HCQ与ACE2的结合干扰了尖峰ACE2结合。ACE 2-刺突对接复合物在最近确定的ACE 2-刺突复合物的晶体结构上的叠加显示在图1B中。 3 a.可以看出，结构一致性非常好，为蛋白质-蛋白质对接计算期间使用的参数的正确性提供了在将刺突蛋白对接到HCQ-ACE 2复合物期间使用相同的参数，并且该HCQ-ACE 2-刺突对接复合物在结构上叠加在图3b中的ACE 2-刺突对接复合物上。可以看出，在HCQ结合的三元复合物中，刺突蛋白相对于ACE 2的S1亚结构域的取向显著不同。有趣的是，如上所述，在HCQ结合后，与刺突蛋白相互作用的ACE 2的螺旋和环区域中存在一些构象变化。这些构象变化可能是负责蛋白质间相互作用的损失和HADDOCK评分的降低蛋白质中的氢键和盐桥相互作用– 细节表6和表7中给出了这些化学相互作用。在ACE 2-刺突对接复合物中，ACE 2和刺突蛋白之间存在12个氢键和5个盐桥相互作用（表6a和6 b）。&在HCQ结合的ACE 2-刺突复合物的情况下，存在11个氢键和4个盐桥相互作用（表7a&表6ACE 2和刺突蛋白之间的相互作用：（a）氢键，（b）盐桥。ACE2距离（Ao）尖峰赖氨酸353 [新西兰]2.65天冬氨酸320[OD 1]赖氨酸68 [新西兰]2.87Tyr 449 [OH]谷氨酰胺24 [NE 2]3.01丙氨酸475 [O]天冬氨酸30 [OD 2]2.71赖氨酸417 [新西兰]天冬氨酸38 [OD 2]3.07Tyr 453 [OH]谷氨酰胺24 [OE1]3.86丝氨酸477 [OG]Tyr 83 [OH]2.92天冬酰胺487[ND 2]谷氨酸35 [OE2]2.99谷氨酰胺493[NE2]酪氨酸41 [OH]2.68甘氨酸502 [N]天冬氨酸355 [OD 1]2.67验证503 [N]天冬氨酸38 [OD 1]2.63Tyr 505 [OH]谷氨酰胺42 [OE1]ACE23.50距离（Ao）Tyr 449 [OH]尖峰赖氨酸353 [新西兰]2.65天冬氨酸405[OD 1]赖氨酸353 [新西兰]3.48天冬氨酸405[OD 2]天冬氨酸38 [OD 1]3.64天冬氨酸403[NH2]天冬氨酸30 [OD 1]3.32赖氨酸417 [新西兰]天冬氨酸30 [OD 2]2.71赖氨酸417 [新西兰]表7HCQ结合的ACE2和刺突蛋白之间的相互作用：（a）氢键，(b)盐桥ACE2-HCQ距离（Ao）尖峰天冬酰胺322 [ND 2]2.76丝氨酸477 [OG]谷氨酰胺325 [N]3.16丙氨酸475 [O]赖氨酸353 [新西兰]2.91Tyr 453 [OH]天冬氨酸30 [OD 1]2.76谷氨酰胺498[NE2]天冬氨酸30 [OD 2]2.62Tyr 499 [OH]谷氨酸35 [OE2]2.88甘氨酸502 [N]谷氨酸35 [OE2]2.91天冬酰胺501[ND2]天冬氨酸38 [OD 1]2.69精氨酸403 [NH1]天冬氨酸38 [OD 2]2.71精氨酸403[NH2]赖氨酸353 [O]2.9Tyr 453 [NZ]His 34 [NE2]2.88Tyr 505 [O]ACE2-HCQ距离（Ao）尖峰天冬氨酸38 [OD 1]3.55精氨酸403[NH2]天冬氨酸38 [OD 1]2.69精氨酸403 [NH1]天冬氨酸38 [OD 2]2.71精氨酸403[NH2]天冬氨酸38 [OD 2]3.45精氨酸403 [NH1]V.B. Navya和M.V. Hosur医学信息学解锁26（2021）1007148图三. ACE 2-刺突对接研究：ace 2（品红色）-刺突（黄色）对接复合物与（a）晶体ACE 2（蓝色）-刺突（橙色）复合物结构（6LZG）和b）HCQ-ACE 2（绿色）-刺突（蓝色）对接复合物的叠加。(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版V.B. Navya和M.V. Hosur医学信息学解锁26（2021）1007149--见图4。α7 nAChR与HCQ的对接：（a）对接姿势：α7 nAChR在正构位点与两个亚基的界面结合HCQ（左-表 面 视 图 ， 右 - 蛋 白 质的 带 状 表 示 ） ; （ b ） 叠 加 图 像 视图 ： 尼 古 丁 （ 蓝 色 对 接 配 体 ， 黄 色晶 体 结 构 配 体 ） 与 α 7 n A C h R 蛋 白在 与 H C Q 相 同 的 裂 缝 中 （ 在 A 、 B 和C 环 内 ） 相 互 作 用 。(For在这个图例中，颜色的参考解释，读者可以参考本文的Web版本。7 b）。表6a和表7a的比较表明，在蛋白质间界面处的两个残基氢键存在差异例如，在ACE 2-刺突二元复合物中，来自ACE 2的 Lys 353与来自刺突蛋白的Asp 320形成氢键，而在三元HCQ-ACE 2-刺突复合物中，Lys 353与来自刺突蛋白的Tyr 453形成氢键。这些差异是由于HCQ与ACE2结合诱导的细微虽然ACE 2的位置相似，但与HCQ-ACE 2的复合物中刺突蛋白的取向与与天然ACE 2的复合物中刺突蛋白的取向显著不同（图3b）。该特征预测刺突蛋白与唾液酸共受体的结合[56]可能受到HCQ存在的显著影响这一结果意味着HCQ通过其刺突蛋白干扰病毒与细胞受体的结合。这一结果也与基于体外实验研究提出的建议一致[5，6，57]。3.2.3. 烟碱乙酰胆碱受体（nAChR）-HCQnAChR形成五聚体配体门控离子通道，其介导神经肌肉接头处的快速化学神经传递。配体（如尼古丁、乙酰胆碱、拮抗剂bungarotoX in和snake toX ins）与该受体的细胞外或跨膜结构域中的正构和变构位点结合，并触发离子通道和抗炎信号传导的激活/阻断[58基于SARS-COV-2病毒刺突蛋白RBD结构域含有与已知的nAChR拮抗剂如α-银环蛇Xin相似的氨基酸序列基序，nAChR受体被认为是SARS-COV-2进入的第二受体。这一假设表明，不仅nAChR介导的病毒进入，而且烟碱胆碱能系统（NCS）的失调导致细胞因子风暴以及免疫应答无法恢复稳态[14，15，58，61]。HCQ与α7 nAChR（表2a）在toX in结合位点（PDB：3sq 9）的高对接评分表明，HCQ可能影响nAChR介导的SARS-CoV 2进入和病理生理学[59，60]。的HCQ最佳位姿的对接得分为-11.5 kcal/mol，结合素能为-17292.2，该位点位于两个α7亚基之间的界面区域（表2a，图4a和b）。对接AutoDock Vina在该结合位点也得到了6.2 kcal/mol的高分（表4）。为了比较的目的，还将配体尼古丁和乙酰胆碱分别对接在相同的位点和相同的激动剂尼古丁的最佳对接评分要低得多，为5.17 kcal/mol（表2b）。HCQ通过氢键和疏水相互作用与B环中的残基Trp 145以及C环中的残基Tyr 184和Tyr 191相互作用（表3）。AutoDock Vina还预测残基Trp 145参与结合HCQ（表4）。对接复合物中的HCQ结合位点与尼古丁-α 7 nAChR对接复合物中尼古丁的位置相距3.32 μ m（图 4 b），并由4.11位从尼古丁晶体结构中的尼古丁- AChBP复合物。这种短暂的分离表明HCQ结合可以防止同时的尼古丁结合。缺乏激动剂尼古丁结合可能导致胆碱能抗炎通路功能障碍[59]。HCQ - α 7 nAChR复合物的稳定性 使用GROMACS的MD模拟[29]。图5以蛋白质-RMSD、蛋白质-RMSF和配体-蛋白质氢键数目随时间变化的曲线的形式显示了结果。由于HCQ和其他配体靶向底物结合位点，模拟分析的重点是α7亚基的主要相互作用区域（A、B和C环）[60，62]。蛋白质-配体复合物的RMSD值稳定且较低（平均值0.25 nm）V.B. Navya和M.V. Hosur医学信息学解锁26（2021）10071410-+号--图五. α7 nAChR-HCQ(For对本图中颜色图例的解释，读者可参考本文的网络版在所有时间点与未配体的蛋白质相比（图5a）。α7 nAChR的RMSF图显示受体的同源链A和B之间的平均差异约为0.02 nm（图5&此外，RMSF图显示蛋白质-HCQ复合物在参与结合HCQ的区域（A、B和C环区域）中的0.15 nm的较小波动（图5b）。这显示了每条链对与HCQ相互作用的贡献[62]。蛋白质-HCQ复合物变得更加紧凑，如从较低的Rg值可以看出的，特别是在超过40 ns的动力学收敛之后（图5d）。 氢键图显示配体和蛋白质之间的氢键在整个模拟期间是稳定的（图5c）。在MD模拟期间，HCQ与来自B环的Trp 145和来自C环的Tyr 191的相互作用得以维持，并与Tyr 91形成额外的键 循环A。HCQ与A、B和C环的结合可阻断结合nAChR上促进病毒进入细胞的位点。然而，这一预测需要实验验证。使用MMPBSA [36]计算的结合能显示自由能值为2921.473 /-57.100 kJ/mol。作为补充资料，给出了结合能和极性及非极性溶剂化能图（补充材料：表1&图2a和b）。3.2.4. α7 nAChR-加标MD模拟结果与A.索菲亚·F Oliveira等人支持SARS-CoV-2刺突蛋白与烟碱乙酰胆碱受体，特别是存在于人支气管上皮和内皮细胞中的α7 nAChR的相互作用[15，61]。由于病毒刺突蛋白RBD结构域中的一个区域具有与toX in相匹配的氨基酸序列，因此我们以toXin-α7nAChR复合物（PDBID：4 hqp）的晶体结构为指导，探索了刺突蛋白与α7 nAChR的相互作用如前所述，我们为此目的使用了软件工具HADDOCK和HADDOPro [37，38]。当盲对接表8对接的相互作用：α 7 nAChR -刺突相互作用之间的氢键（a）和盐桥（b）。α7 nAChR距离（Ao）尖峰A：Arg 182 [NH 1]3.22B：Tyr 380 [O]A：Arg 182 [NH 1]2.79B：Gly 381 [O]A：赖氨酸139 [新西兰]2.74B：Thr 385 [O]A：赖氨酸139 [新西兰]2.74B：Lys 386 [0]A：Ser 124 [OG]2.74B：Asn 388 [O]A：色氨酸145 [NE1]3.82B：Thr 393 [OG1]A：Arg 182 [NH2]2.70B：Thr 430 [OG1]A：色氨酸145 [NE1]3.02B：Ala 520 [O]A：Ser 124 [OG]3.60B：Gly 526 [O]A：Tyr 91 [O]3.02B：Cys 391 [N]A：天冬氨酸126 [OD 1]2.64B：赖氨酸386 [新西兰]A：Glu 185 [OE1]2.65B：Arg 355[NH 1]A：Tyr 191 [OH]3.33B：His 519 [NE2]α7 nAChR距离（Ao）尖峰A：天冬氨酸182 [NH1]2.64B：赖氨酸386 [新西兰]A：Glu 185[OE1]3.60B：Arg 35[NH2]A：Glu 185[OE1]2.65B：Arg 35[NH 1]A：Glu 185[OE2]3.36B：Arg 35[NH 1]HADDOCK评分为35分，更好的分数87.2在对接期间指定X个不相互作用的残基后获得了1/-2.3（表4）。使用PDBePISA分析界面处的相互作用表明，刺突蛋白通过表8中给出的氢键和盐桥相互作用在与Xins[40]相同的位点结合。类似地，在50 ns MD-模拟后获得的稳定HCQ-α7nAChR复合物结构用于在与用于对接刺突蛋白蛋白质与α7 nAChR单独。HADDO